Protein detection scheme

1. DETECTION OF TARGET
PROTEIN

2. Cell
Crude Extract
Partially purified protein
Pure protein
Cell lysis
Chromatography
Chromatography
PROTEIN DETECTION
(di setiap tahapan pemurnian)
PURIFICATION PROCEDURE
Metode kuantifikasi protein (berlaku umum belum
diketahui adanya protein target:
- Uji Bradford
- Lowry
- BCA
- Kjeldahl
Menganalisis adanya protein target melalui uji bioaktifitas
protein. Uji ini bersifat spesifik untuk maisng-maisng
protein
Menganalisis protein target dengan metode elektroforesis
(tahu prediksi ukuran protein dapat diperoleh dari bank
data, atau kemiripa dengan protein lain)
Menganalisis protein target dengan immunoassay
misalnya ELISA

3. SDS-PAGE
SDS–PAGE analysis of TagGFP (Green Florescence
Protein) protein purification. The gel was stained with
Coomassie blue G250.
Lanes: M, molecular mass standards (kDa); 1. E. coli
cells before induction;
2. E. coli cells after induction;
3. E. coli soluble protein fraction;
4. ethanol extract;
5. aqueous phase after n-butanol addition; 6. after
butyl Sepharose chromatography.
For lanes 3-6, the amount of sample loaded on the
gel was correlated to the absorption of target protein
chromophore in the sample.

4. PROTEIN QUANTIFICATION
• Bradford Assay
• Lowry Assay
• BCA Assay
Your turn: Find the protocols and write basic principals

5. BIOACTIVITY MEASUREMENT
Basic concept:
Misal protein X adalah enzim maka bagiamana prinsip dasar uji bioaktifitasnya.
Substrat product
Prinsip dasar pengukuran aktifitas dilakukan dengan mengukur berkurangnya
substrat atau bertambahnya jumlah produk. Prinsip dasar pengukuran
substrat atau produk secara langsung adalah dengan sifat fisikanya . Misal
kemamapuan menyerap cahaya, kemampuan redoks, dsb
Enzim

6. One unit of activity is 1 ,umol of CoM-S-S-CoB reduced per min. Activity
was also determined by analysis of free thiols by using 5,5'-dithiobis-2-
nitrobenzoic acid (12) as described before (9).
Prinsip pengukuran di atas adalah mengukur produk yaitu jumlah
tiol bebas menggunakan 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid.
Assay of PPO activity. The measurement of enzyme activity is based on
the increase in absorbance at 420 nm during the conversion ofthe
phenolic substrate to quinones [21]. One unit of PPO wasdefined as the
amount of enzyme that causes an increase inabsorbance of 0.001.
Prinsip pengukuran adalah mengukur quinone yang dihasilkan
secara spektroskopi Vis.
TUGAS SURVEY UJI BIOAKTIFITAS

7. • ActiVity Assays. Nitric oxide reductase activity was determined using a
Clark electrode as described in ref 4. Various combinations of electron
donors including 10 mM ascorbic acid with or without 100 µM
phenazine methosulfate (PMS) were added to the assay. In addition,
20 µM horse heart cytochrome c was added with or without the
combination of other electron mediators. Menaquinol:NO reductase
activity was determined using a Clark electrode. Menaquinol was
prepared by reducing 100 µM menaquinone with 200 µM NADH
using 0.2 U diaphorase (Sigma D 5540).
• Prinsip dasaranya mengukuran jumlah electron yang terlibat dalam reaksi
redox menggunakan elektroda.

8. Case to discuss
• Bagaimana kalua mengkur kemampaun hemoglobin yang berfungsi
mengikat oksigen?
1. Diukur oksigennya, ingat sifat gas.
PV=nRT, R dan T konstan; n,P, V berubah. Tekanan paling
mudah diikuti. Sehingga aktivitas dapat diukur dengan
mengikuti peubahan tekanan.
2. Diukur serapan dari hemoglobin. Harus dilakukan uji coba a
pakah terjadi perbuahan puncak serapan/pergeseran puncak
dengan penambahan oksigen.

9. Tentukan berat molekul dari protein hasil
overekspresi dari data SDS
Buat kurva kalibrasi antara log berat molekul marker dengan jarak
migrasi, sehingga dihasilkan persamaan garis regresi linear. Kemudian
persamaan tersbut digunakan untuk menghitung berat molekul
protein target.
Y = aX + b;
Y = log berat mokelul
X = jarak migradi
A = gradien/slope
b= intersep pada sumbu Y

10. Tentukan berat molekul dari protein hasil
overekspresi dari data kromatografi gel filtrasi

12. IMMUNO ASSAY
• Dijarkan terpisah dengan dasar-dasar immunologi