Teknik pemurnian protein meliputi beberapa tahapan seperti memecah sel, menghilangkan debri sel, pengendapan, dan pemurnian menggunakan berbagai teknik kromatografi seperti gel filtrasi dan penukar ion untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran, muatan, dan sifatnya. Karakterisasi protein meliputi penentuan bobot molekul, komposisi asam amino, dan urutan asam aminonya.

1. TEKNIK PEMURNIAN PROTEIN
ASRI WIDO MUKTI, S.FARM., M.FARM.KLIN., APT.

2. CAPAIAN PEMBELAJARAN
 MAHASISWA SETELAH MENGIKUTI KULIAH INI MAMPU MENJELASKAN BERMACAM-MACAM
TEKNIK PEMURNIAN PROTEIN

3. DEFINISI
 Pemurnian protein : suatu proses yg bertujuan untuk melakukan isolasi satu protein di antara
beberapa protein dari suatu campuran yg sangat kompleks, biasanya dari sel, jaringan, maupun
organisme.
 Didasarkan pd sifat protein  gugus R
 Fungsi  untuk uji aktivitas (respons fisiologi, kecepatan reaksi substrat menjadi produk, reaksi Ag-
Ab
 2 metode : analisis dan prparatif --> tgntg dr jumlah protein yg diperoleh
 Metode analisis : u/ melakukan deteksi dan identifikasi protein
 Metode preparatif : u/ mendapatkan protein yg diinginkan dlm jumlah ttt

4. KORELASI KLINIS
 Analisis aa sbg identifikasi penyakit  ex : fenilketonuria  kekurangan ezim fenialanin
hidroksilase (mengubah fenilalanin mjd tirosin).
Penyakit sistinuria
 Pemurnian protein obat, -> ex : insulin

5. SIFAT PROTEIN
 Muatan protein sangat dipengaruhi oleh pH
 Protein dapat dipisahkan berdasarkan pH
 Sifat polar dan nonpolar protein dipengaruhi oleh rantai samping dari asam amino
 Bentuk asam dari protein mempunyai keseimbangan dengan bentuk basa

6. EKSTRAKSI PROTEIN
STABILITAS PROTEIN !!!
YG PERLU DIPERHATIKAN :
A. pH
B. Temperatur  umumnya stabil temp <<, kecuali : ATPase dalam mitochondria
C. Inhibitor Protease
D. Reducing Agents  B-mercaptoethanol dan dithiothreitol --> mencegah oksidasi asam amino
E. Detergent  agar membran mudah dirusak, ex : CMC

7. YG HARUS DIPERHATIKAN DALAM PEMURNIAN PROTEIN
 Jenis sel  metode melisis sel
 Bagian apa dari sel  bebrbda jaringan berbeda protein
 Maksud pemurnian  analisis / preparatif

8. TAHAPAN PEMURNIAN PROTEIN
1. MEMECAH SEL
2. MENGHILANGKAN DEBRI SEL  DG SENTRIFUGASI
3. PENGENDAPAN
4. PEMURNIAN
5. ANALISIS AKTIVITAS, BM

9. 1. MEMECAH SEL
 TDPT 2 METODE : MEKANIK & NON MEKANIK
 CARA PEMECAHAN :
 SONIKASI  GELOMBANG SUARA FREKUENSI TINGGI
 TEKANAN TINGGI  PEMURNIAN SKALA BESAR (SKALA INDUSTRI)
 LISIS  MELISIS DDG SEL (SKALA KECIL)

10. 2. PENGENDAPAN
1. PENAMBAHAN GARAM  SALTING IN – SALTING OUT
 Anion u/ pengendapan  lyotropic of hofmeister series  sitrat > fosfat > sulfat > asetat
2. SOLVEN ORGANIK
 Penambahan solven organic  penurunan konstanta dielektrika  protein mengendap
 Kekurangan : pd bbrp pelarut menyebabkan denaturasi protein,  ex : MPD, DMSO< ethanol 
dlm konsentrasi tinggi

11. 3. PEMURNIAN
 Pemurnian dlm bentuk aktif berdasarkan kelaruran, uk molekul, mata molekul, hidrofobisitas, &
specific binding affinity
 Metode pemurnian berdasarkan sifat protein :
SIFAT PROTEIN METODE
Kelarutan Pengendapan bertingkat
Uk Molekul Gel Filtration Chromatography
Muatan Molekul Ion Exchange Chromatography
Hidrofobisitas
specific binding affinity Affinity Chromatography

12. PENGENDAPAN BERTINGKAT
 Penambahan garam  salting out
 Dialisis --> menggunakan membrane semipermeable
 molekul ukuran > kantong dialysis akan tertinggal

13. PEMURNIAN DENGAN TEKNIK KROMATOGRAFI
 Protein akan dilewatkan pd kolom dengan fase diam dan solven yg sesuai
 Jenis fase diam : kromatografi gel filtrasi, penukar ion, reverse phase HPLC, dan kromatografi
afinitas
1. Kromatografi gel filtrasi
 Proses pemisahan berdasarkan ukuran molekul
 Protein dimasukkan ke kolom menggunakan fase diam yg sesuai, kemudian dielusi dg solven. Protein akan
memisah dan ditampung pd waktu tertentu

15. PEMURNIAN DENGAN TEKNIK KROMATOGRAFI
2. Kromatografi penukar ion
 Pemurnian berdasar muatan protein  Fase diam bermuatan ttt
 Fase diam bermuatan (-)  ex : CMC  protein yg bermuatan (+) akan binding pd fase diam
 F.D (+) ex : DEAE
 Protein yg sdh binding dg fase diam dilepaskan dg menggunakan NaCl konsent. Ttt
 Protein yg muatannya plg tinggi akan terlepas dl dan keluar dr kolom untuk kemudian ditampung

16. PEMURNIAN DENGAN TEKNIK KROMATOGRAFI
3. Reversed phase HPLC
 Berdasarkan sifat hidrofobisitas protein
 Fase diam hidrofobik, fase gerak hidrofilil
4. Kromatografi afinitas
 Didasarkan pd aktivitas biologis
 Fase diam mengandung molekul yg dpt beriakatn spesifik dg protein  protein murni
 Ikatan spesifik  Ag-Ab, Ab-Ag, substrat-enzim, hormone – binding protein atau reseptor

17. PENETAPAN KADAR PROTEIN
 Tahapan setelah pemurnian  pemekatan dan menentukan konsentrasi
 Pemekatan  lyophilization , ultrafiltrasi,
1. Berdasarkan rx warna : Biuret, Lowry
2. Spektrofotometri UV  u/ protein yg terlarut, protein yg pny aa dg iktn rangkap terkonjugasi (pny
cincin aromatis pd rantai samping)

18. KARAKTERISASI PROTEIN
 Tdd 3 proses :
- menentukan bobot molekul  elektroforesis gel poliakrilamid-SDS, native
- menentukan komposisi aa penyusun protein tsb  HPLC
- menentukan urutan aa dr ujung N smp ujung C  Edman degradation