1. PEWARNAAN NEGATIF
LAPORAN UTAMA
Diajukan untuk memenuhi salah satu syarat kelulusan
Praktikum Mikrobiologi Pangan Jurusan Teknologi Pangan
Oleh :
Nama : Nur Rahayu Setiawati
NRP : 113020117
Kelompok :E
Meja : 4 (Empat)
Asisten : Firmansyah
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI PANGAN
JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS PASUNDAN
BANDUNG
2012

2. KATA PENGANTAR
Assalamu’alaikum Wr. Wb
Alhamdulillah penulis haturkan atas segala rahmat dan
karunia yang telah dilimpahkan Allah SWT sehingga penulis
dapat menyelesaikan Laporan Utama Praktikum Mikrobiologi
Pangan ini walaupun dengan melewati berbagai rintangan
yang tidak mudah.
Penulis menyadari, terselesaikannya penyusunan laporan
ini tidak terlepas berkat bantuan dan bimbingan daro berbagai
pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan
ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Allah SWT yang memberikan penulis kesehatan dan
usia sampai saat ini, sehinnga penulis mampu
melewati praktikum Mikrobiologi Pangan ini dengan
lancar.
2. Kedua orang tua penulis yang selalu memberikan doa,
dukungan, dan motivasi, serta selalu memberikan
uang saku untuk penulis.
3. Ibu Ir. Neneng Suliasih, MP. selaku koordinator
Laboratorium Mikrobiologi Pangan.
4. Teh Astrie Wijayanthie, selaku koordinator asisten
Praktikum Mikrobiologi Pangan yang menjadi asisten
yang paling memacu semangat penulis pada saat di
laboratorium
i

3. 5. Kang Firmansyah, selaku asisten pembimbing yang
paling baik tiada tandingannya, selalu sabar, selalu
tersenyum, walau penulis selalu telat mengumpulkan
laporan. Hehe.. Tetapi nilai yang akang berikan tetap
sama dan terhitung besar. Terimakasih kaang..
6. Teh Selly, selaku asisten laporan yang membantu
penulis menyelesaikan laporan utama dari asisten
pembimbing ke teh Selly.
7. Teh Farah yang merupakan asisten favorit penulis,
Teh Vega yang paling cantik dengan behelnya, Teh
Natasa yang cantik dan juga sebagai penguji pada
saat penulis ujian praktikum, Teh Rianti yang selalu
tetap lincah di dalam laboratorium, dan Teh Rossi
yang kalem.
8. Mamih Tanty sebagai teman satu meja di Meja 4,
Yopan dan Vivi sebagai teman sekelompok, berkat
kerjasama dan kekompakan mereka, praktikum ini
dapat selesai.
9. Kepada Kelompok E yang tiada hentinya
menggetarkan, mengguncangkan Laboratorium
Mikrobiologi Pangan hingga cetar menggelegar dan
tetap menghadapi praktikum ini selalu ”Hadapi dengan
Senyumaann”
10. Kepada Laboratorium Mikrobiologi Pangan yang
bersedia menampung praktikan.
ii

4. 11. Kepada meja 4 yang telah bersedia memberikan
tempat untuk penulis pada saat praktikum.
12. Bude Tami, Kino, Kacang, Aci, Widya, dll yang udah
mau saling membantu
13. Seluruh angkatan 2011 yang selalu kompak.
14. Kepada lift gedung C yang mau menampung
membawa praktikan naik ke lantai 4 dan turun lagi ke
lantai 1.
15. Motor penulis yang selalu mengantarkan penulis pagi
hari untuk praktikum dengan melewati panas, hujan,
angin, maupun badai
16. Kepada semuanya yang telah membantu penulis
Penulis doakan, semoga Allah SWT membalas semua
kebaikan orang-orang yang berada di balik layar tersebut
sehingga penulis mampu maju dengan semangat yang luaarrr
biasa.
Akhir kata penulis meminta maaf atas segala kekurangan
dalam penulisan Laporan Utama ini. Semoga Laporan Utama
ini dapat bermanfaat untuk semua kalangan. Amin.
Terimakasih.
Wassalamualaikum Wr.Wb
Bandung, Desember 2012
Penulis
v

5. INTISARI
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri
tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada
pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus
pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan
atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka
terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini
menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Sel bakteri tidak berwarna,
sehingga sukar untuk diamati secara langsung. Pewarnaan sel
bakteri dilakukan untuk mempermudah pengamatan morfologi bakteri
tersebut. Proses pewarnaan bakteri lazim disebut pengecatan
Bacillus subtilis telah lama dikenal sebagai bakteri penghasil
enzim . Berdasarkan pengaruh suhu habitatnya, bakteri ini bersifat
fakultatif termofilik. Sifat ini mempengaruhi juga terhadap enzim yang
dihasilkan dimana salah satunya adalah enzim lipase. Penelitian ini
memfokuskan pada pengaruh suhu terhadap lipase yang dihasilkan
Bacillus subtilis dengan menggunakan substrat minyak zaitun
Tujuan pewarnaan negatif adalah untuk mempelajari dan
mengetahui sel-sel bakteri sehingga sel bakteri dapat dilihat secara
jelas. Pronsip percobaan pewarnaan negatif yaitu berdasarkan
pewarnaan tidak langsung dengan hanya mewarnai latar
belakangnya (kaca objek.
Berdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa pada
pewarnaan negatif dapat diketahui bentuk luar dan karakteristik dari
bakteri yang sulit untuk diwarnai, sehingga hanya mewarnai latar
belakangnya saja dan bentuk dari bakteri tersebut adalah batang.
Bakteri yang digunakan adalah Bacillus subtilis yang merupakan
bakteri basil dengan ukuran 0,5 µm x 1 µm. Biasanya bakteri tersebut
ditemukan berkoloni atau membentuk endospora oval atau
bersilinder
vi

6. ABSTRACT
Negative staining, this method is not bacteria but coloring to dye
a dark black background. In this staining microorganisms appear
transparent (see-through). This technique is useful to determine the
morphology and size of the cell. In this staining did not spread to
warm or harsh treatment with chemicals, then the depreciation and
one form that is less so the cells can be obtained by determining
more precisely. This method uses china paints or inks nigrosin.
Bacterial cells are colorless, so it is difficult to observe directly.
Staining bacterial cells to facilitate observation of the morphology of
the bacteria. The process of staining bacteria commonly called
painting
Bacillus subtilis has long been known as an enzyme-producing
bacteria. Under the influence of habitat temperature, thermophilic
bacteria voluntary. These properties also affect the enzyme produced
in which one of them is lipase. This study focuses on the effect of
temperature on lipase produced by Bacillus subtilis using olive oil
substrate
Negative staining objective is to study and know the bacterial
cells so that bacterial cells can be seen clearly. Pronsip negative
staining experiments are based on indirect staining with only the
background color (glass objects
Based on the observations we can conclude that the negative
staining can be seen outside the shape and characteristics of the
bacteria that are difficult to color, so that only the background color
only and shape of bacteria is rod. The bacteria used were Bacillus
subtilis bacterium bacillus which is the size of 0.5 μm x 1 μm. Usually
the bacteria are found in colonies or oval or cylinder form endospores
vii

7. DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR...............................................................i
INTISARI.................................................................................iv
ABSTRACT............................................................................v
DAFTAR ISI............................................................................vi
DAFTAR TABEL....................................................................vii
DAFTAR GAMBAR...............................................................viii
DAFTAR LAMPIRAN.............................................................x
1 BAB I PENDAHULUAN ................................................... 1
1.1 Latar Belakang Percobaan ....................................... 1
1.2 Tujuan Percobaan .................................................... 3
1.3 Prinsip Percobaan .................................................... 3
2 BAB II ALAT, BAHAN, DAN METODE PERCOBAAN .. 4
2.1 Alat yang digunakan ................................................. 4
2.2 Bahan yang digunakan ............................................. 4
2.3 Metode percobaan.................................................... 5
3 BAB III HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN ... 6
3.1 Hasil Pengamatan .................................................... 6
3.2 Pembahasan ............................................................ 7
4 BAB IV KESIMPULAN DAN SARAN ............................ 21
4.1 Kesimpulan ............................................................. 21
4.2 Saran ...................................................................... 21
5 DAFTAR PUSTAKA ........... Error! Bookmark not defined.
6 LAMPIRAN .......................... Error! Bookmark not defined.
vi

8. DAFTAR TABEL
Tabel 1. Hasil Pengamatan Pewarnaan Negatif..................6
Tabel 2. Perbedaan Sifat bakteri Gram Positif dan Gram
Negatif…………………………………………………..16
Tabel 3. Penggolongan Bakteri berdasarkan Suhu…...........19
vii

9. DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Metode Percobaan Pewarnaan Negatif.................5
Gambar 2. Gambar Hasil Pengamatan Pewarnaan Negatif....6
viii

10. DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Mikroskop ........................................................23
Lampiran 2. Pemakaian Mikroskop......................................24
Lampiran 3. Pewarnaan Gram.............................................26
Lampiran 4. Pewarnaan Negatif...........................................27
Lampiran 5. Biakan Lapuk....................................................28
Lampiran 6. Pembentukan Gas............................................30
Lampiran 7. Pembiakan Sarcina lutea dan Serratia
marcescens………………………………………..31
Lampiran 8. Pemeriksaan Air...............................................32
Lampiran 9. Tetesan Bergantung.........................................36
Lampiran 10. Cawan Gores dan Tuang................................37
Lampiran 11. Pewarnaaan Spora ........................................39
Lampiran 12. Pengamatan Sel Hidup & Sel Mati..................40
Lampiran 13. Penetapan Jumlah Sel Total...........................41
Lampiran 14. Zat Anti Mikroba..............................................42
Lampiran 15. Uji Mutu Makanan...........................................43
Lampiran 16. Pembentukan AMK.........................................47
Lampiran 17. Pembentukan Indol.........................................48
Lampiran 18. Pembentukan H2S..........................................49
Lampiran 19. Penguraian Enzim..........................................50
Lampiran 20. Perubahan Air Susu.......................................52
Lampiran 21. Sterilisasi Alat dan Bahan..............................54
Lampiran 22. Peragian Gula................................................56
x

11. I PENDAHULUAN
Bab ini menguraikan mengenai : (1) (1) Latar Belakang
Percobaan, (2) Tujuan Percobaan, dan (3) Prinsip Percobaan
1.1 Latar Belakang Percobaan
Selain pewarnaan gram, untuk melihat sel-sel bakteri
dapat juga dilakukan pewarnaan negatif. Pewarnaan negatif
atau pewarnaan asam merupakan salah satu teknik
pewarnaan bakteri. Akan tetapi teknik ini bukan untuk
mewarnai sel bakteri, hanya mewarnai latar belakangnya
menjadi hitam gelap. Zat warna yang digunakan tidak akan
mewarnai sel, tetapi mewarnai lingkungan sekitar sehingga sel
bakteri tampak transparan. Dalam kondisi pH mendekati
netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif
dan senyawa pewarna juga bermuatan yang sama sehingga
akan ditolak oleh dinding sel. Pewarna yang biasa digunakan
antara lain nigrosin, eosin, dan asam pikrat. Tetapi kini
nigrosin sudah tidak digunakan dalam pewarnaan, dan diganti
dengan tinta cina.
Pewarnaan negatif tidak hanya secara khusus
menvisualisasikan protein saja, tetapi dapat digunakan untuk
lipoprotein, isolasi organela, kompleks nukleoprotein. Pada
teknik ini apusan bakteri mengalami fiksasi dengan cepat
(beberapa detik sampai menit). Pewarnaan negatif adalah
cara pengamatan mikrobiologi yang biasa dilakukan untuk
1

12. membedakan specimen kecil dengan cairan optiknya. Untuk
mikroskop medan terang, pewarnaan negative biasanya
menggunakan cairan hitam, misalnya nigrosin. Spesimen
seperti bakteri dalam cairan disebar dalam preparat kaca yang
dicampur dengan pewarna negatif dan dibiarkan kering. Ketika
diamati dengan mikroskop, bakteri atau sporanya terlihat
bersinar dengan latar belakang yang gelap. Pewarnaan
negatif atau pewarna asam dapat terjadi karena senyawa
pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati
netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif
sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak
oleh dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna.
Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan
nigrosin, asam pikrat, dan eosin.
Prosedur pewarnaan negatif sangat sederhana. Pertama,
apusan bakteri difiksasi dan dibiarkan hingga mengering pada
kaca objek. Kemudian ditetesi dengan zat pewarna. Ambil
kaca objek yang lain dan dorong apusan sejajar dengan kaca
hingga menghasilkan olesan yang tipis. Biarkan hingga kering
kemudian lihat sel bakteri pada mikroskop. Bakteri yang dapat
digunakan dalam pewarnaan ini seperti Pseudomonas
aeruginosa dan Lineola longa.
2

13. 1.2 Tujuan Percobaan
Tujuan Percobaan adalah untuk mempelajari dan
mengetahui sel-sel bakteri sehingga sel bakteri dapat dilihat
secara jelas.
1.3 Prinsip Percobaan
Prinsip Percobaan pewarnaan negatif yaitu berdasarkan
pewarnaan tidak langsung dengan hanya mewarnai latar
belakangnya (kaca objek).
3

14. 2 ALAT, BAHAN, DAN METODE PERCOBAAN
Bab ini menguraikan mengenai : (1) Alat yang digunakan,
(2) Bahan yang digunakan, dan (3) Metode Percobaan
2.1 Alat yang digunakan
Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah
Mikroskop, lampu, kaca objek, jarum oase, pinset, pipet tetes ,
dan korek api.
2.2 Bahan yang digunakan
Bahan yang digunakan adalah biakan Bacillus subtilis,
pewarna nigrosin, alkohol 70%.
4

15. 2.3 Metode percobaan
- Bersihkan kaca objek dengan
menggunakan alkohol 70 %
- Fiksasi diatas api untuk
menghilangkan lemak
- Pijarkan jarum oase
- Ambil biakan Bacillus subtilis
-Beri 1 tetes Nigrosin
-Ratakan dengan kaca objek
lainnya
- Diamkan hingga kering
- Amati dengan perbesaran 400 x
5

16. 3 HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
Bab ini membahas mengenai : (1) Hasil Pengamatan, dan
(2) Pembahasan
3.1 Hasil Pengamatan
Gambar Keterangan
Nama Bakteri : Bacillus subtilis
Bentuk : Batang
Susunan : Monobacillus
Warna : Transparan
100 X
Zat Warna : Nigrosin
400 X
(Sumber : Nur Rahayu.S, Kelompok E, Meja 4, 2012
6

17. 3.2 Pembahasan
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya
ukuran bakteri sangat kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat
dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran
1.000 X atau lebih. Sel bakteri memiliki panjang yang
beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih
panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan
makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm.
Bentuk bakteri bermacam-macam yaitu elips, bulat, batang
dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai
dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau
dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan
keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri
dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau
spiral (heliks).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat
bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk
bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik
dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta
meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan
menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan
diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada
bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan
7

18. larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan,
yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.
Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara
sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik
pewarnaan diferensial
Berdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa
pada pewarnaan negatif dapat diketahui bentuk luar dan
karakteristik dari bakteri yang sulit untuk diwarnai, sehingga
hanya mewarnai latar belakangnya saja dan bentuk dari
bakteri tersebut adalah batang. Bakteri yang digunakan
adalah Bacillus subtilis yang merupakan bakteri basil dengan
ukuran 0,5 µm x 1 µm. Biasanya bakteri tersebut ditemukan
berkoloni atau membentuk endospora oval atau bersilinder.
Bakteri tersebut berumur 24 jam, karena pada usia tersebut
morfologi bakteri sudah terlihat jelas. Awalnya kaca objek
dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70% dan di fiksasi
untuk menghilangkan lemak pada kaca objek tersebut. Lalu
pijarkan jarum oase dan ambil biakan Bacillus subtilis. Pada
kaca objek yang telah di fiksasi tadi, beri 1 tetes nigrosin dan
biakan Bacillus subtilis. Ratakan dengan menggunakan kaca
objek yang lainnya, lalu di keringkan. Pewarna yang
digunakan dalam pewarnaan negatif yaitu nigrosin. Pewarna
nigrosin tidak mewarnai bakteri, tapi mewarnai preparat
sehingga terlihat bakteri tersebut berwarna bening. Hal ini
disebabkan karena nigrosin dan bakteri sama-sama
8

19. bermuatan negatif. Akibatnya, nigrosin langsung mewarnai
preparat, tidak mewarnai bakteri.
Endospora merupakan struktur spesifik yang ditemukan
pada beberapa jenis bakteri. Struktur endospora sangat
bervariasi pada setiap spesies. Endospora merupakan struktur
yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim
misalnya kering, pemanasan dan keadaan asam. Karena
kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan
dengan sel vegetatifnya, maka endospra berbentuk sangat
padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop.
Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarnaan biasa,
sehingga harus menggunakan pewarnaan spesifik. Bakteri
yang menghasilkan spora pada umumnya tahan terhadap
pewarnaan, sedangkan bakteri yang tidak memiliki spora dan
hanya memiliki sel vegetatif tidak tahan terhadap pewarnaan.
Pewarna yang digunakan dalam pengecatan negatif
adalah nigrosin. Pewarna tersebut tidak mewarnai bakteri, tapi
mewarnai preparat sehingga terlihat bakteri tersebut berwarna
bening dengan preparat yang kontras. Hal ini disebabkan
karena tinta cina dan bakteri sama-sama bermuatan negatif.
Akibatnya, nigrosin langsung mewarnai preparat, tidak
mewarnai bakteri. (Johnson & Case, 2007).
Pewarnaan negatif adalah cara pengamatan
mikrobiologi yang biasa dilakukan untuk membedakan
specimen kecil dengan cairan optiknya. Untuk mikroskop
medan terang, pewarnaan negative biasanya menggunakan
9

20. cairan hitam, misalnya nigrosin. Spesimen seperti bakteri
dalam cairan disebar dalam preparat kaca yang dicampur
dengan pewarna negatif dan dibiarkan kering. Ketika diamati
dengan mikroskop, bakteri atau sporanya terlihat bersinar
dengan latar belakang yang gelap. Pewarnaan negatif atau
pewarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna
bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral,
dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga
pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh
dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna.
Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan
nigrosin, asam pikrat, dan eosin.
Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk
batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan
vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu
berkisar 25-35 ºC. Bacillus subtilis juga telah berevolusi
sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan
lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi
seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau
oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya
memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set
kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR
CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari
bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam
jumlah besar ke luar dari sel (Schlegal, 1994).
10

21. Bacillus subtilis juga telah lama dikenal sebagai bakteri
penghasil enzim . Berdasarkan pengaruh suhu habitatnya,
bakteri ini bersifat fakultatif termofilik. Sifat ini mempengaruhi
juga terhadap enzim yang dihasilkan dimana salah satunya
adalah enzim lipase. Penelitian ini memfokuskan pada
pengaruh suhu terhadap lipase yang dihasilkan Bacillus
subtilis dengan menggunakan substrat minyak zaitun
(Johnson & Case, 2007)
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna nigrosin/tinta Cina sewaktu
proses pewarnaan. Bakteri gram negatif memiliki system
membran ganda dimana membrane plasmanya diselimuti
membrane lapisan luar permeable. Bakteri gram negatif
memiliki dinding sel tebal berupa peptidoglikan yang terletak
diantara membran dalam dan membrane luarnya. Banyak
spesies bakteri gram negatif yang bersifat patogen yang
berarti mereka berbahaya bagi organism inang. Sifat patogen
ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada
dinding sel gram negatif terutama lapisan lipopolisakarida
(dikenal juga dengan LPS atau endotoksin) (Anonim², 2011).
Proses pengecatan dilakukan dengan mengoleskan
pewarna dengan bakteri dari gelas objek ke gelas objek
lainnya. Preparat yang sudah diberi warna kemudian
dikeringkan tanpa fiksasi dengan panas. Hal ini disebabkan
karena proses fiksasi akan membuat sel bakteri tidak terlihat
11

22. jelas karen panas akan membuat pengecatan menjadi hitam
(Irianto, 2006).
Hasil pengecatan tersebut memperlihatkan sel bakteri
yang jelas baik dalam struktur dan ukurannya. Bacillus terlihat
transparan dengan bentuk batang. Latar belakang terlihat
gelap akibat pewarnaan negatif tetapi terlihat warna putih
transparan di sekeliling bakteri yang terlihat. Sehingga
pengecatan negatif dapat menggambarkan dengan jelas
struktur morfologi bakteri.
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif
dan ion negatif, salah satu di antaranya berwarna. Pada zat
warna yang bersifat basa, warna terdapat pada ion positif (zat
+ -
pewarna Cl ) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat
- +
pada ion negatif (zat pewarna Na ). Hubungan antara bakteri
dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan
terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar
dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan
negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion
positif zat pewarna basa, Kristal violet, safranin dan metilin
blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa
digunakan. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan
negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri dengan zat
pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada
daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di
atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler, 1993).
12

23. Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai
bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam
gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini
olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang
keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya
penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini
menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Sel bakteri tidak
berwarna, sehingga sukar untuk diamati secara langsung.
Pewarnaan sel bakteri dilakukan untuk mempermudah
pengamatan morfologi bakteri tersebut. Proses pewarnaan
bakteri lazim disebut pengecatan.
Genus bakteri yang termasuk gram negatif adalah
Enterobactericeae, Salmonella sp, Shigella sp, Escherichia
coli, dan Yersinia enterolitica. Sedangkan bakteri gram positif
adalah Staphylococci, Streptococci, Enterococci, Clostridium,
Bacillus. Bakteri gram negatif yang paling terkenal adalah
Veilonella alcalescens (dahulu Micrococcus lactilyticus) dan
Megasphaera (dahulu Pepto streptococcus). Keduanya tidak
mampu untuk meragikan karbohidrat. Veillonella alcalescens
ditemukan dalam ludah manusia dan hewan, juga perut
hewan pemamah biak. Bakteri ini meragikan asam-asam
organik menjadi propionat, asetat, CO2, H2 (Schlegal, 1994).
13

24. Cat atau zat warna secara kimiawi dapat dibagi menjadi
dua macam, yaitu:
1. Cat basa yaitu cat (senyawa garam) yang gugus
kromofornya adalah kation (bermuatan positif (+)). Cat
tersebut akan mewarnai sel yang bersifat asam. Cat
basa mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat
dengan bagian-bagian sitoplasma sel. Contoh:
methylene blue, kristal violet, dan lain-lain.
2. Cat asam yaitu cat yang gugus kromofornya adalah
anion (bermuatan negatif (-)). Cat tersebut akan
mewarnai sel yang bersifat basa. Cat basa mudah
bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Contoh: congo
red, eosin, nigrosin dan lain-lain (Johnson & Case,
1980).
Teknik pengecatan bakteri terdiri dari 3 macam yaitu:
1. Pengecatan negatif.
Pengecatan ini dilakukan dengan mewarnai latar
belakang preparat, tapi tidak mewaranai bakteri
sehingga bakteri terlihat jelas dan kontras dengan
latar. Pengecatan menggunakan tinta cina. Bakteri
tidak terwarnai karena bakteri dan zat pewarna sama-
sama bermuatan negatif. Pengecatan negatif biasa
digunakan untuk menentukan morfologi bakteri tanpa
penggunaan pengecatan kasar atau teknik fiksasi.
Pengecatan negatif dapat digunakan untuk
14

25. mengkonfirmasi bentuk dan ukuran bakteri dan untuk
melihat kapsul (Johnson & Case, 2007).
2. Pengecatan sederhana.
Pengecatan dilakukan dengan memakai satu macam
cat. Sel bakteri akan terwarnai sesuai cat yang
dipakai. Cat yang biasa dipakai adalah safranin,
methylene blue, atau kristal violet. Pengecatan
sederhana biasa digunakan untuk mengetahui
morfologi, ukuran dan susunan bakteri
(Johnson & Case, 2007).
3. Pengecatan diferensial.
Pengecatan dilakukan dengan memakai beberapa
macam larutan cat. Teknik ini biasa digunakan untuk
mengelompokkan beberapa jenis bakteri.
(Johnson & Case, 2007).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat
penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa
perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri gram
positif dan bakteri ram negatif (Filzahazny, 2008) :
15

26. Tabel 2. Perbedaan Sifat bakteri Gram Positif dan Gram
Negatif
Bakteri Gram Bakteri Gram
Positif Negatif
Lapisan Lapisan petidoglikan
Dinding Sel petidoglikan lebih Lebih tipis
tebal
Kadar Lipid 1-4 % 11-22%
Relatif lebih
Kebutuhan Nutrien Kompleks
sederhana
Resistensi terhadap
Lebih Pekat Larut
alkali (1% KOH)
Kepekaan terhadap
Lebih Peka Kurang Peka
Yodium
Toksin yang
Eksotoksin Endotoksin
dibentuk
Ada yang tahan Tidak ada yang
Sifat Tahan Asam
asam tahan asam
Kepekaan terhadap
Lebih peka Kurang peka
Penisilin
Kepekaan terhadap
Tidak peka Peka
Streptomisin
Resistensi terhadap
Lebih tahan Lebih peka
tellurit
16

27. Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan tetap
hidup merupakan suatu hal yang penting untuk diketahui.
Pengetahuan tentang faktor-faktor yang mempengaruhi
pertumbuhan mikroba sangat penting di dalam mengendalikan
mikroba. Berikut ini faktor-faktor penting yang mempengaruhi
pertumbuhan mikroba :
1. Suplai Nutrisi
Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya,
memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber energi dan
pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut
adalah : karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur,
fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya.
Ketiadaan atau kekurangan sumber-sumber nutrisi ini
dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga
pada akhirnya dapat menyebabkan kematian. Kondisi
tidak bersih dan higienis pada lingkungan adalah
kondisi yang menyediakan sumber nutrisi bagi
pertumbuhan mikroba sehingga mikroba dapat
tumbuh berkembang di lingkungan seperti ini. Oleh
karena itu, prinsip daripada menciptakan lingkungan
bersih dan higinis adalah untuk mengeliminir dan
meminimalisir sumber nutrisi bagi mikroba agar
pertumbuhannya terkendali.
2. Suhu / Temperatur
Suhu merupakan salah satu faktor penting di dalam
mempengaruhi dan pertumbuhan mikroorganisme.
17

28. Suhu dapat mempengaruhi mikroba dalam dua cara
yang berlawanan:
a) Apabila suhu naik maka kecepatan metabolisme
naik dan pertumbuhan dipercepat. Sebaliknya apabila
suhu turun, maka kecepatan metabolisme akan
menurun dan pertumbuhan diperlambat.
b) Apabila suhu naik atau turun secara drastis,
tingkat pertumbuhan akan terhenti, kompenen sel
menjadi tidak aktif dan rusak, sehingga sel-sel
menjadi mati. Berdasarkan hal di atas, maka suhu
yang berkaitan dengan pertumbuhan mikroorganisme
digolongkan menjadi tiga, yaitu :
1) Suhu minimum yaitu suhu yang apabila berada di
bawahnya maka pertumbuhan terhenti.
2) Suhu optimum yaitu suhu dimana pertumbuhan
berlangsung paling cepat dan optimum (disebut juga
suhu inkubasi)
3) Suhu maksimum yaitu suhu yang apabila berada
di atasnya maka pertumbuhan tidak terjadi.
Sehubungan dengan penggolongan suhu di atas,
maka mikroba digolongkan menjadi
18

29. :
Tabel 2. Penggolongan Bakteri menurut Suhu
Kelompok Suhu Suhu Suhu
Minimum Optimum Maksimum
o o o
Psikrofil - 15 C. 10 C. 20 C.
o o o
Psikrotrof - 1 C. 25 C. 35 C.
o o o
Mesofil 5 – 10 C. 30 – 37 C. 40 C.
o o o
Thermofil 40 C. 45 – 55 C. 60 – 80 C.
o o o
Thermotrof 15 C. 42 – 46 C. 50 C.
Berdasarkan ketahanan panas, mikroba
dikelompokkan menjadi tiga macam, yaitu :
1) Peka terhadap panas, apabila semua sel
o
rusak apabila dipanaskan pada suhu 60 C
selama 10-20 menit.
2) Tahan terhadap panas, apabila dibutuhkan
o
suhu 100 C selama 10 menit untuk mematikan
sel.
3) Thermodurik, dimana dibutuhkan suhu lebih
o
dari 60 C selama 10-20 menit tapi kurang dari
o
100 C selama 10 menit untuk mematikan sel.
3. Keasaman atau Kebasaan (pH)
Setiap organisme memiliki kisaran pH masing-
masing dan memiliki pH optimum yang berbeda-
beda. Kebanyakan mikroorganisme dapat tumbuh
pada kisaran ph 8,0 – 8,0 dan nilai pH di luar kisaran
2,0 sampai 10,0 biasanya bersifat merusak.
19

30. 4. Ketersediaan Oksigen
Mikroorganisme memiliki karakteristik sendiri-
sendiri di dalam kebutuhannya akan oksigen.
Mikroorganisme dalam hal ini digolongkan menjadi :
1) Aerobik : hanya dapat tumbuh apabila ada
oksigen bebas.
2) Anaerob : hanya dapat tumbuh apabila tidak
ada oksigen bebas.
3) Anaerob fakultatif : dapat tumbuh baik
dengan atau tanpa oksigen bebas.
4) Mikroaerofilik : dapat tumbuh apabila ada
oksigen dalam jumlah kecil (Lestari, 2012).
20

31. 4 KESIMPULAN DAN SARAN
Bab ini menguraikan mengenai : (1) Kesimpulan, dan (2)
Saran.
4.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa
pada pewarnaan negatif dapat diketahui bentuk luar dan
karakteristikdari bakteri yang sulit diwarnai
4.2 Saran
Bakteri yang diuji, menggunakan berbagai macam bakteri
negative lainnya agar praktikan bias lebih mengetahui bakteri-
bakteri yang masuk ke dalam pewarnaan negative
21

32. 22

33. 23

34. 24