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GLICOGENOSI DI TIPO 2 Diagnostica Biochimica e Molecolare
- 1. GLICOGENOSI DI TIPO 2 Diagnostica Biochimica e Molecolare AOU “Santa Maria della Misericordia” Udine, 25 Novembre 2014
- 2. Glicogenosi di tipo II • Malattia autosomica recessiva (1:40000) • Deficit dell’enzima lisosomiale a-glucosidasi acida (GAA) o maltasi acida • Accumulo di glicogeno nei lisosomi.
- 3. Glicogenosi tipo II Phenotypic continuum Infantile onset Late onset •Manifests in children or adults •Progressive muscular weakness •No cardiac involvement •Respiratory insufficiency •Exercise intolerance •Swallowing difficulty •Moderate hepatomegaly •Elevated CK •Residual GAA activity •Manifests soon after birth •Rapidly progressive disease course •Progressive muscle weakness •Cardiomegaly and cardiomyopathy •Hypotonia •Respiratory insufficiency •Feeding difficulties •Moderate hepatomegaly •Markedly elevated CK •no GAA activity
- 4. La proteina GAA Extracellular environment Plasma membrane Early endosome pH 6.0 Late endosome pH 5.0-6.0 Lysosome pH <5.0 GlcNac-1-phosphotransferase Lysosomal enzyme + M6P residue M6P-receptor
- 5. La proteina GAA ACTIVE SITE • Precursore di 110 kDa inattivo • Forma intermedia di 95 kDa inattiva • Le forme di 70 e 76 kDa sono attive
- 6. Diagnosi di laboratorio Parametri di laboratorio non-specifici CK, LDH, AST, ALT Oligosaccaridi in urina Accumulo di glicogeno in muscolo Tests specifici Misurazione dell’attività enzimatica nelle cellule del paziente Biochimico Molecolare Analisi di mutazioni del gene GAA
- 7. Diagnosi biochimica Dosaggio dell’attività enzimatica dell’alpha glucosidasi acida Substrato (4-methyllumbelliferyl-a-D-glucoside ) + GAA Cellule del paziente Prodotto Fluorescente (4-Metilumbelliferone) + glucosio •Linfociti •Leucociti (acarbose inibitore della maltasi glucoamylase) •DBS (acarbose inibitore della maltasi glucoamylase) 20-25 gg •Coltura linfociti immortalizzati •Coltura fibroblasti Risultati in giornata Studi futuri pH Acido
- 8. Diagnosi biochimica Non sufficiente nei casi di PSEUDODEFICIENZE Condizione presente nella popolazione generale determinata da polimorfismi Caratterizzata da attività enzimatica ridotta non associata a malattia c.1726G>A (p.G576S) Presente in omozigosi nel 4% degli Asiatici
- 9. Diagnosi molecolare Conferma diagnostica Approfondimento diagnostico Correlazione genotipo/fenotipo Consulenza genetica GAA gene 17q25.2 – q25.3 20Kb - prognosi - diagnosi prenatale - identificazione portatori ATG TAG Circa 400 mutazioni descritte. La maggior parte puntiformi e “private” http://www.pompecenter.nl
- 10. Diagnosi molecolare Campione DNA (cellule nucleate) PCR di ogni uno dei 20 esoni della GAA Sequenziamento automatico mutazioni Conferma nei genitori Una o nessuna mutazione Coltura di fibroblasti Analisi del mRNA per mutazioni di slipicing e delezioni descritta nuova Patogenetica ???
- 11. Caratterizzazione in vitro dei mutanti GAA Mutagenesi sito diretta • Attività enzimatica • Western blot • Immunofluorescenza GAA cDNA WT pcDNA3 GAA cDNA MUT pcDNA3
- 12. Espressione di mutazioni missenso 120 100 80 60 40 20 0 WT c.399C>A c.670C>T c.1064T>C c.2104C>T c.2188G>T % residual GAA activity in COS-1 cells GAA wt c.1064T>C c.2104C>T 110 95 76 70 WT ALDP
- 13. Correlazione genotipo/fenotipo Infantile GSDII Profilo di mutazioni molto eterogeneo Tutte le mutazioni descritte sono severe Late onset GSDII Mutazioni severe in eterozigosi con mutazione “mild” porta ad una forma LO c.-32-13T>G è la più frequente c.525delT (11.8%) c.1064T>C (7.9%) c.1655T>C (10.5%) c.-32-13T>G (42.3%)
- 14. La mutazione c.-32-13T>G ATG TAG Normale Mutato c.-32-13T>G
- 15. Pt# (sex) Age (years) First symptoms noted Mobility status % residual enzyme activity Respiratory follow-up onset Diagnosis At diagnosis Follow-up 1 (F) 13 14 Elevated CK, AST, ALT Lower limb weakness, Fatigue unrestricted With help 18 (M) Reduction of pulmonary function 2 (F) 2 2 Elevated CK, AST, ALT unrestricted unrestricted NA Normal 3 (F) 30 31 Elevated CK, Fatigue Generalized weakness unrestricted With walker or wheelchair 4.3 (L) Respiratory distress 4 (M) 18 27 Elevated CK, AST, ALT Generalized weakness unrestricted With help 10 (M) non invasive ventilation 5 (F) 30 52 Difficulty in walking up steps Fatigue unrestricted With help absent Supplemental oxygen 6 (M) 22 46 Generalized weakness Fatigue unrestricted With help 0.1 (L) Reduction of pulmonary function 7 (M) 38 38 Generalized weakness Fatigue unrestricted With difficulty 8 (L) Reduction of pulmonary function 8 (M) 1 2 Elevated CK, AST, ALT Muscular weakness Impaired ambulation With wheelchair 3.7 (M) non invasive ventilation 9 (M) 1 10 Elevated CK, AST, ALT unrestricted unrestricted 0.02 (M) Normal Clinical data of late onset GSDII patients carrying the c.-32-13T>G/c.2237G>A (p.Trp746X) genotype
- 16. Diagnosi prenatale E’ possibile quando c’è un paziente diagnosticato in famiglia I genitori, entrambi portatori, hanno una probabilità ¼di avere un figlio affetto Mamma (portatrice) Papa (portatore) Sano 25% Malato 25% Portatori 50% Non affetti 75%
- 17. Diagnosi prenatale Campione: Villo coriale (12^sett.) o amniociti (16^sett) Diagnosi biochimica: Analisi dell’ attività enzimatica Diagnosi molecolare: Analisi delle mutazioni del gene GAA presenti nella famiglia. Solo utile in famiglie in cui le 2 mutazioni sono state caratterizzate. Esclusione della contaminazione con DNA materno
- 18. Ringraziamenti Bruno Bembi Andrea Dardis Silvia Cattarossi Marta Deganuto Erika Malini Annalisa Pianta Milena Romanello Irene Zanin
Editor's Notes
- Malattia di accumulo lisosomiale a carattere autosomico recessivo Causato da un deficit dell’attività dell’anzima alpha glucosidasi acida detta anche maltasi acida un enzima che catalizza nei lisosomi l’idrolisi dei legami alpha 1-4 e alpha 1-6 del glicogeno con i rilascio di glucosio.
- La presentazione clinica della malattia include un’ampia gamma di fenotipi, accomunati dalla miopatia, ma con differenti età di esordio, coinvolgimento di organi e gravità del decorso. La forma più severa è la forma infantile L’espressione fenotipica è estremamente variabile
- La GAA è una proteina ubiquitaria che viene sintetizzata nel reticolo endoplasmatico dove viene glicosilata. La GAA viene trasportata nel Golgi dove le catene oligosaccaridiche di mannosio vengono fosforilate. I residui di M6P sono fondamentali per il trasporto dell’enzima al lisosoma. La proteina passa al compartimento del Golgi dove si lega al recettore del M6P ed è principalmente trasportata al lisosoma dove viene processata nella sua forma matura. Una piccola percentuale viene secreta nell’ambiente extra cellulare. Il trasporto della proteina al lisosoma è un requisito fondamentale per la sua funzione.
- Il peptide segnale N-terminale viene eliminato. Sito attivo N518- regione 513-524.
- CK: creatin kinasi LDH: lattato deidrogenasi AST, ALT: aspartato e alanina amino transferasi Oligosaccaridi in urina. Tetrasaccaridi del glucosio specificatamente presenti in urina.
- Il metodo utilizzato è un metodo fluorimetrico. Nei pazienti late onset la correlazione tra attività enzimatica residua e la gravità del fenotipo clinico è molto variabile. Attività residue basse possono associarsi con fenotipo mild. Il grado di deficienza enzimatica non correla con il fenotipo clinico (diversità tra substrato naturale e artificiale) Maltasi glucoamylasi si trova nei polimorfonucleati Prima di procedere alla diagnosi molecolare si deve avere la conferma dell’attività enzimatica per escludere che mutazioni nuove siano polimorfismi. La biopsia muscolare serve per eventuali diagnosi differenziali. La biopsia muscolare deve essere effettuata con attenzione in quanto è rischiosa per pazienti infantili affetti da malattia di Pompe (per coinvolgimento cardiaco) La diagnosi su spot di sangue deve essere confermata perché esistono falsi positivi
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20080426
- Il primo esone non viene tradotto ed è separato da un grande introne dall’esone 2 dove è localizzato il primo ATG Although some mutations are common in different ethnic groups (p.R854X among African–Americans, p.D645E among Asians and del525T among Dutch people), the mutation profile is very heterogeneous and most mutations are present in single individuals or small number of families. The only exception is represented by the intronic mutation c.-32-13T>G that is present in 40–70% of the alleles in patients affected with the LO form of the disease (7–12).
- La patogenicità delle nuove mutazioni viene studiata mediante la loro espressione in vitro per valutare l’effetto delle mutazioni sulla attività della proteina (enzyme function)
- Popolazione italiana!!! The type of mutation is usually a good predictor of clinical phenotype, but in a number of cases this rule seems to fail. • It is assumed that a combination of two mutated alleles that encode essentially no enzyme activity results in infantile-onset Pompe disease. • Various combinations of other alleles resulting in some residual enzyme activity likely cause disease but the age of onset and progression are most likely directly proportional to the residual GAA enzyme activity. Although a number of mutations seen in homozygosity may suggest a genotype-phenotype correlation, the existence of a number of case reports of both infantile and late-onset Pompe disease in the same family suggests strong caution in extrapolation of these observances. The clinical heterogeneity primarily relates to the occurrence of different mutations in the acid α-glucosidase gene that lead to different degrees of acid α-glucosidase deficiency, and different rates of lysosomal glycogen accumulation. Secondary genetic and non-genetic factors are thought to modulate the disease phenotype, but have not been identified yet.
- E’ localizzata nell’introne 1 a 13 nucleotidi di distanza dall’esone 2 e porta ad una diminuzione della forza del sito di splicing accettore dell’esone 2. Questo determina una dimininuita attività della GAA anche se non assente. Circa il 49-70% dei pazienti late onset sono caratterizzati dalla presenza di questa mutazione (a seconda della popolazione). Studies performed in cells from patients carrying the c.-32-13T>G mutation have demonstrated that this mutation leads to the synthesis of three different aberrant splicing variants: SV1, which retains the first 36 nt of intron 1 and lacks exon 2, SV2in which exon 2 is completely spliced out and SV3 in which exon 2 is partially spliced out (Figure 1A), as well as a small amount of normally spliced GAA mRNA. The same aberrant splicing variants were detected in low quantities in cells from normal controls
- Pazienti con lo stesso genotipo presentano attività residua e manifestazioni cliniche molto diverse. Questo può essere dovuto sia al diverso background genetico, alla presenza di varianti polimorfiche, di geni modificatori e di meccanismi di RNA editing c.2237G>A porta ad uno stop codon