Белорусская медицинская академия последипломного образования Критерии внутрилабораторного контроля качества молекулярно-биологических исследований Доцент, к.м.н. Костюк С.А. Минск 2009

1. Белорусская медицинская академия последипломного образования КРИТЕРИИ ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Доцент, к.м.н. Костюк С.А. Минск 2009

8. Правильный способ использования внутреннего контрольного образца для оценки соблюдения методики ПЦР ПЦР в режиме реального времени, амплификация Выделение ДНК ПЦР в режиме реального времени, детекция ВКО

10. ПЦР в реальном времени Пороговое значение Пороговый цикл По ординате интенсивность флуоресценции, по абсциссе номер цикла амплификации.

12. Оценка сходимости результатов определения ДНК Chlamydia trachomatis методом Реал-тайм ПЦР Обра - зец С t Среднее значениеС t Дисперсия Станда ртное отклонение % CV =100 (станд. откл./ среднее) Валидированное значение (Станд.откл.) v для метода Приемлемое значение % CV v =100* ((станд. откл.) v / среднее) 1.1 1 8 , 3 3 18.39 0.084158 0.290101 1,58 не более 0.5 2.72 1.2 1 8 ,8 1 - - - - - - 1.3 18, 14 - - - - - - 1.4 1 8 , 29 - - - - - - 2.1 25, 54 25,61 0,036425 0.190853 0,84 не более 0.5 2,21 2.2 2 2 , 37 - - - - - 2.3 2 2 , 73 - - - - - - 2.4 2 2 , 79 - - - - - 3.1 2 5 , 88 29,012 0,568867 0.764233 2,90 не более 0.5 1,92 3.2 2 6 , 4 - - - - - - З.З 25,03 - - - - - - 3.4 26,77 - - - - - -

15. Оценка воспроизводимости результатов определения ДНК Chlamydia trachomatis методом Реал-тайм ПЦР Обра - зец С t Среднее значение С t : сия: Станда ртное отклонение % CV =100 (станд. откл./ Среднее) Валидированное значение (Станд.откл.) v для метода Приемлемое значение % CV v =100* ((станд. откл.) v / среднее) 1.1 19,23 19.27 0.187625 0.43315 2.24 не более 0.5 2.59 1.2 19,89 - - - - - - 1.3 18,90 - - - - - - 1.4 19,07-. - - - - - - 2.1 25,36 25,69 0Д72425 0.415241 1.62 не более 0.5 1.95 2.2 25,91 - - - -• - 2.3 26,17 - - - - - - 2.4 25,33 - - - -: - 3.1 29,32 29,72 0,086433 0.293995 0,99 не более 0.5 1,68 3.2 29.34 - - - - - - З.З 30,01 - - - - - - 3.4 29,69 - - - - - -

16. Критерии внутрилабораторного контроля качества Реал-тайм ПЦР ПРАВИЛЬНОСТЬ – близость получаемых результатов к истинному значению, оценивается по погрешности определения, а именно, по относительному количеству ложно положительных и ложно отрицательных результатов: - % ложно положительные результаты = ложно положительные/общее количество отрицательных результатов; - % ложно отрицательные результаты = ложно отрицательные/общее количество положительных результатов Для оценки правильности параллельно с постановкой проб с неизвестным результатом исследования методом качественной Реал-тайм ПЦР следует проводить исследование 10 заведомо положительных и 10 заведомо отрицательных образцов.

17. Оценка правильности результатов определения ДНК Chlamydia trachomatis методом Реал-тайм ПЦР ПРОБЫ 10 заведомо- положительных проб на наличие ДНК Chlamydia Trachomatis 10 заведомо- отрицательных проб на наличие ДНК Chlamydia Trachomatis Истинно положительные 10 - Истинно отрицательные - 10 Ложно положительные: 0 Ложно отрицательные 0 - % ложно отрицательные результаты = ложно отрицательные/ общее количество отрицательных результатов - 0 % ложно отрицательные результаты = ложно отрицательные /общее количество положительных результатов 0 -

20. Результаты использования контрольной панели по выявлению ДНК C.trachomatis № образца Конц. С hl. в мл пробы Эталон Результат Значение С t 1 10 4 1 Пол. 24,58 2 10 5 1 Пол. 18,96 3 - - Отр. - 4 - - Отр. - 5 - - Отр. - 6 - - Отр. - 7 - - Отр. - 8 10 3 1 Пол. 29,16 9 10 4 1 Пол. 24,52 10 10 5 1 Пол. 18,93 11 - - Отр. - 12 10 3 1 Пол. 29,14

21. ИНТЕРВАЛ МЕТОДА - разница значений, которые соответствуют точности, правильности при определении образцов, содержащих исследуемую ДНК, на границах интервала и внутри его. Для качественной Реал-тайм ПЦР интервал метода должен соответствовать значениям С t для специфического фрагмента ДНК и ДНК ВКО, которые позволяют определенным образом интерпретировать результата анализа: «положительный», «отрицательный», «ошибочный, необходим повтор исследования». Критерии внутрилабораторного контроля качества Реал-тайм ПЦР с качественным форматом детекции

22. Интервалы интерпретации результатов качественной Реал-тайм ПЦР для определения ДНК –мишени Интервал метода: РЕЗУЛЬТАТ ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ ОШИБОЧНЫЙ, НЕОБХОДИМ ПОВТОР ИССЛЕДОВАНИЯ Сигнал по каналу амплификации специфического фрагмента ДНК –мишени не определен (отрицательный ) и сигнал амплификации по каналу ВКО определен (положительный) Сигнал по каналу амплификации специфического фрагмента ДНК-мишени определен (положительный) и сигнал амплификации по каналу ВКО определен (положительный) или не определен (отрицательный) Сигнал по каналу амплификации специфического фрагмента ДНК не определен (отрицательный ) и сигнал амплификации по каналу ВКО не определен (отрицательный) или отрицательный контроль положительный или положительный контроль вне приемлемых показателей

24. Общие критерии надежности результатов качественной Реал-тайм ПЦР для определения ДНК -мишени Показатели надежности Установленные значения Критерии надежности Сходимость, % CV 0,73-2,90 (% CV ) не более 3,0 (% CV v ) Воспроизводимость, % CV 0,53-2,24 (% CV ) не более 3,0 (% CV v ) Правильность, % ложно положительных результатов 0 0 Правильность, % ложно отрицательных результатов 0 0 Эффективность реакции 0,98-1,00 >0,98