Khả năng chống ung thư của các hoạt chất phân lập từ cây vông nem - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Nguyễn Thị Ngọc Ánh
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC
HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis
(L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd.
Et Wils, Magnoliaceae)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - Năm 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC
HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis
(L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd.
Et Wils, Magnoliaceae)
Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. HOÀNG THỊ MỸ NHUNG
Hà Nội – Năm 2012

LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
PGS.TS. Trần Công Yên, người thầy đã tạo nên trong tôi niềm ham
thích với lĩnh vực nghiên cứu ung thư và thu nhận tôi vào nhóm Ung thư
thực nghiệm. Thầy đã luôn thấu hiểu và động viên những khi tôi gặp khó
khăn trong những ngày đầu vào nhóm. Tôi luôn cảm thấy mình may mắn khi
đã được học và làm việc dưới sự hướng dẫn của thầy dù thời gian đó không
dài.
PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳ, người đồng sáng lập nhóm Ung thư thực
nghiệm. Cô đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo lý thuyết và các kỹ năng thực
nghiệm từ khi tôi còn là sinh viên đại học, tạo nền tảng giúp tôi phát triển
luận văn của mình sau này. Tôi cũng như các anh chị, các bạn học viên, sinh
viên trong nhóm luôn muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô, cảm ơn cô đã
luôn quan tâm và chia sẻ, ủng hộ các thế hệ sinh viên chúng tôi tiếp bước
con đường đóng góp cho khoa học.
TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, người có ảnh hưởng lớn đến việc thôi thúc
tôi gia nhập nhóm Ung thư thực nghiệm mặc dù thời điểm đó tôi chưa có cơ
hội được làm việc cùng cô. Cô không chỉ là người gợi mở, giúp đỡ tôi thực
hiện thí nghiệm mà còn tạo nên trong tôi lòng tin tưởng, mong muốn được
chia sẻ những khó khăn, khúc mắc gặp phải trong công việc và chủ động nêu
lên ý kiến của mình. Tôi đã học được ở cô không chỉ kiến thức, kỹ thuật mà
còn cả tính lạc quan, bình tĩnh xử lý và tháo gỡ những khó khăn gặp phải. Cô
đã, đang và sẽ luôn là một tấm gương cho tôi học tập và cố gắng.
ThS. Bùi Thị Vân Khánh, chị là người tôi có cơ hội được làm việc cùng
ngay từ những ngày đầu gia nhập nhóm nghiên cứu. Với vai trò là thành viên
cơ hữu dày kinh nghiệm, chị đã luôn tận tâm chỉ bảo, chia sẻ những kinh
nghiệm thực nghiệm quý báu và những khúc mắc trong cuộc sống với những

thế hệ học viên, sinh viên đi sau như tôi. Đặc biệt trong khoảng thời gian
chuẩn bị bảo vệ, chị đã luôn sẵn sàng giúp đỡ và động viên tôi rất nhiều.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học
nói chung và các thầy cô trong Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi – Lý sinh nói
riêng đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu, cách tư duy, làm việc, tạo
nền tảng vững chắc giúp tôi thực hiện luận văn cũng như công việc của mình
sau này.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới những người bạn lớp K51B
Công nghệ Sinh học, các anh chị, các bạn và các em sinh viên đã và đang là
thành viên trong nhóm Ung thư thực nghiệm, Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi –
Lý sinh, Khoa Sinh học đã luôn ở bên cạnh, chia sẻ với tôi những khi tôi gặp
khó khăn trong công việc và cuộc sống. Tôi rất may mắn có được những
người bạn, những người anh chị em thực sự như vậy.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm, ĐH
Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ và TS. Phương Thiện Thương, Viện
Dược liệu Trung ương đã cung cấp mẫu để chúng tôi thực hiện nghiên cứu
này.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình đã luôn ủng
hộ và tin tưởng tôi, góp ý và tôn trọng những lựa chọn của tôi trong suốt
thời gian tôi học tập xa nhà, giúp tôi có một chỗ dựa vững chắc hoàn thành
những lựa chọn của mình.
Luận văn được thực hiện dưới sự tài trợ kinh phí từ đề tài Trọng điểm
Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số QGTĐ 10.28
Hà Nội, tháng 12 năm 2012
Học viên

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG................................................................................................viii
DANH MỤC HÌNH MINH HỌA.............................................................................. ix
BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT.............................................................................xiii
MỞ ĐẦU..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN..................................................................................... 3
1.1. T ng u n ung hư..............................................................................3
1.1.1. Một số đặc điểm củ ung hư ...................................................3
1.1.2. Các gi i đoạn phá riển củ ung hư........................................5
1.2. Các m h nh sàng ọc huốc chống ung hư ............................................8
1.2.1. Nu i cấy cơ u n......................................................................8
1.2.2. Nu i cấy tế bào.........................................................................8
1.2.3. Nu i cấy khối cầu đ bào ung hư (mu ice u r umor
spheroid)…………………........................................................................................10
1.2.4. M h nh in i o......................................................................12
1.3. Mộ số ng ế bào ung hư...................................................................14
1.3.1. D ng ế bào ung hư biểu m ruột kết ở người - HCT116.....14
1.3.2. D ng ế bào ung hư biểu m c tử cung ở người - Hela.......14
1.3.3. D ng ế bào ung hư biểu m ú ở người - MCF7 ................15
1.3.4. D ng ế bào ung hư ú ở người - KPL4 ...............................16
1.4. Chế ph m Hono io M gno o Derrone à huốc T o .....................16
1.4.1. Hono io (H) à M gno o (M)..............................................16
1.4.2. Derrone (D) ............................................................................19

1.4.3. Taxol (Paclitaxel)...................................................................20
1.5. Enzyme Aurora kinaza ..........................................................................22
CHƯƠNG 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 25
2.1. Đối ượng nghiên cứu............................................................................25
2.2. Máy móc ụng cụ .................................................................................25
2.3. Hó chất sử dụng...................................................................................26
2.4. Phương pháp hoạ hó à nhân nu i các ng ế bào in vitro...............27
2.5. Phương pháp hử độc ính MTS ............................................................28
2.6. Phương pháp hử độc ính rên m h nh spheroi .................................30
2.7. Phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang.......................................31
CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 33
3.1. Kế u h o sá độc ính củ Hono io M gno o à Derrone rên m
h nh 2D……………..................................................................................................33
3.1.1. Với ng HCT116..................................................................33
3.1.2. Với ng He ........................................................................38
3.1.3. Với ng MCF7 .....................................................................41
3.1.4. Với ng KPL4 ......................................................................44
3.2. Kế u nghiên cứu ác động củ Hono io rên m h nh 3D hối cầu đ
bào MCF7…………..................................................................................................51
3.2.1. Kết qu hí nghiệm heo õi sự ăng rưởng khối spheroid
MCF7………………………. ...................................................................................51
3.2.2. Kết qu hí nghiệm kiểm r ác động củ Hono io ên uá
r nh ạo khối spheroid MCF7...................................................................................54
3.2.3. Kết qu hí nghiệm kiểm r ác động củ Hono io ên sự
ăng rưởng của khối spheroid MCF7 .......................................................................56

3.3. Kết qu nghiên cứu nh hưởng củ Hono io ên hệ vi sợi actin .........59
3.4. Kết qu nghiên cứu nh hưởng củ Derrone ên sự phosphory hó
Histon H3 tại vị rí Serine 10 ....................................................................................62
KẾT LUẬN............................................................................................................... 66
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 68

Luận văn cao học Danh mục bảng
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao ..........................................................................25
Bảng 2: Thiết bị sử dụng...........................................................................................26
Bảng 3: Hóa chất sử dụng ........................................................................................26
Bảng 4: Dải nồng độ cuối cùng của thuốc thử trong giếng......................................28
Bảng 5: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng HCT116 sau 48h ủ với với Honokiol,
Magnolol và Taxol ....................................................................................................35
Bảng 6: Giá trị IC50 của Honokiol, Magnolol và Taxol với dòng HCT116 .............38
Bảng 7: Chỉ số tăng sinh A(%) Hela với Honokiol và Taxol....................................39
Bảng 8: Giá trị IC50 của Honokiol và Taxol với dòng Hela.....................................41
Bảng 9: Chỉ số tăng sinh A(%) của MCF7 với Honokiol và Taxol ..........................43
Bảng 10: Giá trị IC50 của Honokiol (H) và Taxol với dòng TBUT MCF7...............44
Bảng 11: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng KPL4 với Honokiol, Magnolol, Derrone
và Taxol.....................................................................................................................47
Bảng 12: Giá trị IC50 của Honokiol, Magnolol, Derrone và Taxol với dòng KPL4 50
Bảng 13: Tổng hợp giá trị IC50 và chỉ số tương quan R2
của Honokiol, Magnolol,
Derrone và Taxol ......................................................................................................50
Bảng 14:Thể tích của khối spheroid MCF7 qua 25 ngày sau khi hạ giọt treo.........52
Bảng 15: Thể tích trung bình khối spheroid MCF7 trong 15 ngày theo dõi ủ với
Honokiol....................................................................................................................58

Luận văn cao học Danh mục hình minh họa
Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm
ix
DANH MỤC HÌNH MINH HỌA
Hình 1: Sáu đặc trưng cơ bản của ung thư.................................................................3
Hình 2: Thận chuột được sử dụng để sàng lọc thuốc .................................................8
Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy.....................................9
Hình 4: Mô hình cấu trúc cơ bản của khối u invivo và khối cầu đa bào ung thư ....10
Hình 5: Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 ở người.............................14
Hình 6: TBUT vú MCF7 được nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro ................................15
Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd. Et wils (trái) và cấu trúc
phân tử của hai đồng phân Honokiol và Magnolol (phải) .......................................16
Hình 8: Cơ chế tác động của Honokiol (H) và Magnolol (M) lên con đường truyền
tin dẫn đến apoptosis của tế bào...............................................................................18
Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L., Fabaceae và công thức cấu tạo
Derrone .....................................................................................................................19
Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol..............................................................................20
Hình 11: Cơ chế tác động của Taxol lên tế bào gây apoptosis ................................22
Hình 12: Hình ảnh mô phỏng liên kết của Taxol với vi sợi tubulin..........................22
Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza..................................................................24
Hình 14: Các dòng TBUT được bảo quản trong bình đựng Nito lỏng.....................27
Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x).....................33
Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) và 10µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................33
Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol ở nồng độ 5µg/mL (trái) và 50µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................34

Luận văn cao học Danh mục vi t t t
x
Hình 18: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Taxol nồng độ 0,003µg/mL (trái);
0,3µg/mL (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x)..............................................................34
Hình 19: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Honokiol (H)
...................................................................................................................................36
Hình 20: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Magnolol (M)
...................................................................................................................................36
Hình 21: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Taxol ..........37
Hình 22: Tế bào Hela mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x)...........................38
Hình 23: Tế bào Hela sau 48h ủ Honokiol ở nồng độ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................38
Hình 24: Tế bào Hela ủ Taxol nồng độ 0,003 (trái), 0,3 (giữa) và 30µg/mL (phải)
(100x) ........................................................................................................................39
Hình 25: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của Hela với Honokiol (H)....40
Hình 26: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của Hela với Taxol ................40
Hình 27: Tế bào MCF7 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) ........................41
Hình 28: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Honokiol ở nồng độ 5 (trái); 20 (giữa) và
50µg/mL (phải) (100x)..............................................................................................42
Hình 29: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái), 0,3 (giữa), và
30µg/mL (phải) (100x)..............................................................................................42
Hình 30: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của MCF7 với Honokiol (H) .43
Hình 31: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của MCF7 với Taxol..............44
Hình 32: Tế bào KPL4 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) .........................45
Hình 33: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................45

xi
Hình 34: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Magnolol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................45
Hình 35: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Derrone NĐ 5 (trái) và 20µg/mL (phải)
(100x) ........................................................................................................................46
Hình 36: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái); 0,3 (giữa) và 30µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................46
Hình 37: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Honokiol (H) ..48
Hình 38: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Magnolol (M) .48
Hình 39: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Derrone (D)....49
Hình 40: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Taxol...............49
Hình 41: Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 sau 25
ngày kể từ khi hạ giọt treo.........................................................................................52
Hình 42: Khối spheroid MCF7 trong 25 ngày quan sát kể từ khi hạ giọt treo ........53
Hình 43: Khối spheroid MCF7 ở mẫu ĐCSH sau 5 (a) và 7 (b) ngày, ủ với
Honokiol NĐ 5µg/mL sau 5 (c) và 7 (d) ngày và không tạo khối khi ủ Honokiol NĐ
10µg/mL (e)...............................................................................................................55
Hình 44: Khối spheroid MCF7 mẫu ĐCSH sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo....56
Hình 45: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 10µg/mL sau 5, 9, 13 và 15
ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) .............................................56
Hình 46: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 20µg/mL sau 5, 9, 13 và 15
ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) .............................................57
Hình 47: Các khối spheroid dưới tác động của Honokiol trở nên lỏng lẻo về mặt
cấu trúc, các tế bào bên ngoài bong tróc ra khỏi khối từ ngày thứ 9 sau khi hạ giọt
treo (400x).................................................................................................................57

xii
Hình 48: Đồ thị tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 dưới ảnh hưởng của
Honokiol (H) .............................................................................................................58
Hình 49: Ảnh hưởng của Honokiol lên hình thái tế bào Hela. Tế bào đối chứng
(trái); Tế bào Hela ủ với Honokiol NĐ 10 µg/mL (phải); màu đỏ: actin; màu lam:
nhân tế bào................................................................................................................60
Hình 50: Sự rối loạn phân bố của F-actin dưới tác động của Honokiol tại NĐ 10
µg/mL sau 48h ủ........................................................................................................60
Hình 51: Tế bào Hela sau 24h ủ với Honokiol tại NĐ 20µg/mL..............................61
Hình 52: Sự biểu hiện H3PS10 tại các kỳ khác nhau trong quá trình phân chia của
tế bào.........................................................................................................................64
Hình 53: So sánh biểu hiện của H3PS10 tại các mẫu tế bào xử lý với Derrone (b);
Magnonol (c); Honokiol (d) và mẫu đối chứng (a). .................................................65

xiii
BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT
VIẾT TẮT VIẾT ĐẦY ĐỦ
ADN Acid deoxiribinucleic
ARN Acid ribonucleic
c-FLIP FLICE-like inhibitory protein
D Derrone
ĐCDM Đối chứng ung m i
ĐCSH Đối chứng sinh học
DMEM Du becco’s mo ifie E g e me ium
FBS Huyế h nh h i bê – Fetal bovine serum
FLICE Caspase 8
H Honokiol
HCT116 Human colorectal carcinoma cell line
HeLa Henrietta Lacks' 'Immortal' cell line
KHV Kính hiển vi
KPL4 Human breast cancer cell line
M Magnolol
MCF7 Human breast adenocarcinoma cell line
MTS
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-
carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-
tetrazolium)
NĐ Nồng độ

xiv
NST Nhiễm sắc thể
PBS Đệm phosphate saline – Phosphate buffered saline
PMS Phenazine methosulfate
TBUT Tế bào ung hư
TNF Tumor necrosis factor
TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand

Luận văn cao học Mở đầu
1
MỞ ĐẦU
Ung hư à nguyên nhân gây chế hàng đầu ở các nước có n n kinh tế phá
triển à hứ hai ở các nước đ ng phá riển. Gánh nặng ung hư ở các nước đ ng
phá riển ăng ên o hậu qu của sự ăng ân số già hó ân số cũng như sự du
nhập lối sống có i m năng gây ung hư như hú huốc á í ận động à hực ph m
“Tây hó ”. Theo T chức Y tế thế giới – WHO có ho ng 12.7 triệu c ung hư à
7,6 triệu ca tử ong o ung hư được ghi nhận rong năm 2008 rong đó 56% số ca
à 64% rường hợp tử ong à ở các nước đ ng phá riển. Cũng heo dự báo của
WHO, tới năm 2020, số người mắc ung hư rên oàn cầu có hể ăng ên đến 15
triệu ca mới mỗi năm. Tỷ lệ chế o ung hư có hể chiếm 25% t ng số ca tử vong.
Theo số liệu c ng bố tại Hội th o Quốc gi ph ng chống ung hư năm 2010 Việt
N m có 126.300 c mắc mới. Căn bệnh n n y này đ ng ăng nh nh so ới 10 năm
rước [1].
Vốn à mộ đấ nước được hiên nhiên ưu đãi nằm rong ùng nhiệ đới gió
mù Việ N m có một th m thực vậ cùng phong phú à đ ạng với hơn 12.000
oài hực vật bậc c o hác nh u. Từ nhi u thế kỷ nay, thực vậ h ng chỉ à nguồn
cung cấp inh ưỡng cho con người mà c n à những phương huốc chữa bệnh hết
sức uý giá b o gồm thuốc chống ung hư nói riêng à các bệnh hác nói chung.
Bởi vậy, nghiên cứu m r các hợp chất từ nguồn ược liệu hiên nhiên có h năng
chữ ung hư à mộ hướng nghiên cứu được nhi u nhà hoa học à hầy thuốc đầu
ư ập rung nghiên cứu trong nhi u năm n y.
Trong u hướng này chúng i iến hành nghiên cứu hoạ ính háng u của
ba chất Hono io M gno o được ách chiết từ cây Hậu phác Magnolia officinalis
Rehd. Et wils, Magnoliaceae à Derrone được ách chiết từ cây V ng nem
Erythrina orientalis L. Murr., Fabaceae do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp
cho nhóm Nghiên cứu Ung hư hực nghiệm, Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa
học Tự Nhiên Đại học Quốc gi Hà Nội nhằm mục đích:

Luận văn cao học Mở đầu
2
Kh o sá nh hưởng của ba chất Honokiol, M gno o à Derrone ên
sự tăng rưởng của một số ng ế bào ung hư nu i cấy đơn ớp 2D.
Nghiên cứu nh hưởng củ Hono io ên m h nh 3D hối cầu đ bào
các tế bào ung hư.
Bước đầu nghiên cứu cơ chế ác động của Hono io ên hệ thống vi
sợi à ác động của ba chấ ên hoạ động của enzyme Aurora kinaza ở
tế bào ung hư.

Luận văn cao học Tổng quan
3
CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1. T n an n h
1.1.1. Một số đặc điểm của ung thư
Trong uá r nh đ gi i đoạn h nh hành hối u, tế bào ung hư (TBUT) thu
nhận à biểu hiện nhi u đặc điểm rong đó có sáu kh năng sinh học n i bật tạo nên
đặc ính phức tạp v mặt t chức của bệnh, bao gồm: duy r ín hiệu ăng sinh; rốn
ránh các yếu tố ức chế khối u; chống lại sự chết của tế bào; cho phép nhân ên gần
như bất tử; c m ứng h nh hành mạch máu à hoạ hó uá r nh âm ấn à i căn.
Nguyên nhân sâu của những đặc điểm đặc rưng này à sự bất n của hệ gen
trong TBUT dẫn đến những biến đ i v mặt di truy n đồng thời cũng hỗ trợ các
chức năng rên. Ngoài r những nghiên cứu gần đây đ xuất hêm h i đặc rưng
hác củ ung hư b o gồm sự ái ập r nh r o đ i năng ượng à sự trốn ránh hệ
thống miễn dịch. Tuy nhiên cần những nghiên cứu sâu hơn để h i đặc rưng mới
này được c ng nhận rộng rãi [14].
Hình 1: Sáu đặc trưng cơ bản của ung thư

4
V mặ h nh hái TBUT có sự h y đ i há rõ né so ới tế bào b nh hường:
 V nhân: Nhân ăng ích hước đ ạng, nhi u hùy đặc biệ có những
nhân h ng lồ phân chi mạnh gọi à nhân uái nhân chi . Màng nhân
ày ên à đường vi n h ng đ u.
 V tỷ lệ giữ nhân à nguyên sinh chấ : Nhân o ên rong hi nguyên
sinh chất hẹp lại.
 V nguyên sinh chấ : Có nhi u t n hương hoái hó như nhi u hang,
hốc… Nguyên sinh chất chứ các chất chế tiết, thể ùi.
 Kh ng c n h năng ức chế tiếp úc nên ễ bong ra khỏi u.
V mặt chức năng TBUT biệ hó ém h ng hực hiện được những chức
năng b nh hường à ễ hoại tử. Đặc biệ chúng iế r các chất chỉ điểm được gọi
à m r er như µFP CA125 (ung hư buồng trứng) CA25 (ung hư đại ràng) HCG
(ung hư nhau thai inh hoàn)…
Khi u n sá uần thể TBUT các nhà ho học đã đư r ba học thuyế hác
nhau nhằm gi i hích nguồn gốc quần thể này:
 Thuyế đơn ng: Là u n niệm inh điển cho rằng khối u phá sinh ừ
một tế bào mẹ nhân ên. Ví ụ: Ở bệnh bạch cầu tủy rên phụ nữ đen
thấy đồng nhất loại tế bào hương n NST số 10. Các ế bào này đ u tiết
men Glucose-6-phosphate dehydroglubuline.
 Thuyế đ ng: Dự rên ết qu u n sá h nh hái à chức năng cho
thấy t chức ung hư có nhi u loại tế bào nên hi chu n đoán ế bào học
dễ nhầm lẫn à có nhi u marker sinh học.
 Thuyết v ém n định gen của TBUT: Có hể b n đầu à mộ ng o
gen ung hư h ng n định nên có các ế bào biến dị sinh r hàng oạ các
tế bào hỗn hợp. Ví ụ: u lympho ác ính ế bào ớn, tế bào nhỏ hoặc các
loại ung hư ph i thể hỗn hợp ung hư m iên ết thể hỗn hợp.

5
1.1.2. Các giai đoạn phát triển của ung thư
Theo Doug s à Rober Weinberg uá r nh iến triển củ ung hư có hể
chi àm 6 gi i đoạn chính:
 Gi i đoạn khởi phá : Các TBUT nhận được các ín hiệu húc đ y sự ăng
sinh à phân bào. Các ín hiệu này có hể xuất hiện do sự h y đ i củ các yếu
tố ngoại bào hoặc do sự h y đ i bên rong hệ thống truy n ín hiệu nội bào
dẫn tới sự ăng sinh à phân bào. Thậm chí rong một số rường hợp đặc biệt,
các ín hiệu ích hích phân bào có hể được tạo ra từ chính các TBUT. Khi đó
tế bào được ích hích phân chi h ng giới hạn. Quá r nh này iễn ra nhanh
à hoàn ất trong mộ ài giây h ng hể đ o ngược được. Trong cuộc đời một
con người có nhi u tế bào rong cơ hể có hể tr i u uá r nh hởi phá
nhưng h ng ph i tất c các ế bào đ u phá sinh bệnh. Đ số các ế bào hởi
phá hoặc h ng iến triển, hoặc chế đi hoặc bị cơ chế miễn dịch hiệu hó .
 Gi i đoạn húc đ y: Các ế bào rở nên “ c m” mộ cách bấ hường với
các ín hiệu ức chế phân bào. Trong các ế bào b nh hường, sự phân bào
hường được ích hoạt bởi các ín hiệu nhấ định; à ồn tại song song với
chúng à các ín hiệu ức chế phân bào. B nh hường h i cơ chế này cùng tồn
tại à phối hợp với nhau ở mức cân bằng ậy sự phân bào iễn ra n định
à có chức. Ở các TBUT h sự ngăn c n phân bào bị ê iệ hi đó ế bào sẽ
u n được chuyển từ ph G1 s ng S để tiến hành s o chép ADN à bước ào
mộ chu r nh ế bào mới bất kể các s i hỏng ADN có được khắc phục hay
h ng. Các ế bào s u gi i đoạn ăng rưởng này sẽ tiếp tục phá riển hành
các hối u ác ính.
 Gi i đoạn chuyển biến: Như đã biết, protein p53 giữ i r u n rọng
rong uá r nh b o vệ cơ hể chống lại sự ích ũy s i hỏng ADN có hể gây
nguy hiểm cho cơ hể. Khi p53 bị mất chức năng này h con đường apoptosis
của tế bào h ng hoạ động. V ậy tế bào hỏng có hể sống à iếp tục nhân
ên nh nh chóng. Những tế bào này có u hướng tạo r các hế hệ tế bào con

6
có mức độ sai hỏng c n c o hơn chính nó. Hậu qu à mỗi tế bào con h nh
hành đ u có nguy cơ chuyển hành các TBUT. Như ậy có hể nói h năng
hoá hỏi cơ chế chế heo chương r nh à “cột mốc” u n rọng để một
TBUT phá riển hành hối u ác ính.
 Gi i đoạn n ràn: Các TBUT có h năng s o chép ận. Ở người, mỗi
tế bào som hường chỉ có h năng s o chép rung b nh ho ng 60 – 70 lần.
Tuy nhiên các TBUT có hể ượ uá số lần phân bào này nhờ việc ADN phần
đầu mú nhiễm sắc thể được éo ài nhờ hoạ động mạnh của enzyme ADN
telomeraza. Khi các TBUT đạ đến gi i đoạn này chúng được gọi à các ế bào
bất tử. Gi i đoạn này có hể ngắn ài háng hoặc cũng có hể éo ài ài năm.
Trong gi i đoạn này hối u bành rướng gi ăng có hể từ 100 đến 1 triệu tế
bào nhưng ẫn c n uá nhỏ để các phương pháp ho học phá hiện được.
 Gi i đoạn củng cố: Các ế bào phá riển hệ thống tự nu i ưỡng. Các m
rong cơ hể đ bào đ u cần một hệ thống mạch máu cung cấp chất dinh
ưỡng. Các ế bào hối u ti n ác ính hường ăng rưởng chậm o chúng được
nu i ưỡng bởi hệ tuần hoàn b nh hường. Nhưng ở các TBUT, khi khối u phá
triển đến một mức nhấ định h uất hiện sự h nh hành mạch máu mới. Lúc
này các hối u được nu i ưỡng à phá riển rất mạnh. Đây à mộ bước
“củng cố” các TBUT ác ính h nh hành mạch máu mới nu i ưỡng các hối u,
giúp hối u phá riển mạnh mẽ à gây nguy hiểm cho cơ hể.
 Gi i đoạn âm ấn à i căn: Ở gi i đoạn này các TBUT có h năng
âm ấn ào các ùng m hác à h nh hành hối u mới. Hơn 90% số bệnh
nhân bị ung hư đ u chế ào gi i đoạn hi các TBUT đã i căn ới các phần
hác nh u củ cơ hể. Khi các hối u i căn các TBUT rời khỏi khối u nguyên
phá à i chuyển dọc heo đường máu hoặc đường bạch huyết tới các ị rí
hác nh u rong cơ hể rước hi chúng rú ngụ ở vị rí mới à h nh hành hối
ung hư mới. Di căn heo đường bạch huyế hường gặp nhi u rong ung hư
biểu m có hể n ràn heo đường bạch huyết tại chỗ à đ i hi àm ắc, rồi

7
n đến mạch bạch huyế ùng. Trong phương hức i căn heo đường kế cận,
các TBUT đi heo mạch máu à hần kinh, theo lối í hi bị c n trở như ung
hư ạ ày n u ớp thanh mạc ào bụng đến buồng trứng… Di căn heo
đường máu hường gặp nhi u ở ung hư m iên ế . Khi đó ế bào ế húc ở
mao mạch à ăng rưởng ở đó. Như ậy kết qu i căn à sự h nh hành các
khối u thứ cấp ở vị rí có hể cách rất xa vị rí hối u nguyên phá b n đầu. Khi
ung hư đã iến triển đến gi i đoạn này h sự kiểm soá à đi u trị cực kỳ hó
hăn. Đây à gi i đoạn cuối cùng à nguy hiểm nhấ rong uá r nh phá riển
củ ung hư. Với khối u ành ính, gi i đoạn này h ng y ra. Các ế bào
trong khối u ành ính sinh s n chậm à bám ào các m iên ết tại chỗ, khối
u có r nh giới rõ ràng à h ng gây c m giác đ u cho người bệnh nếu ích
hước khối u h ng uá o h y chèn ép ào ây hần inh. Do đó hối u ành
h ng gây nguy hiểm cho người bệnh à ễ chữa trị [14, 32, 36].
Kể từ hi ung hư uất hiện, lịch sử oài người đã sử dụng à phá riển nhi u
phương pháp hác nh u để chống lại căn bệnh này như gi i phẫu, vậ ý rị liệu hó
trị liệu, miễn dịch trị liệu đi u trị hướng đích…
Trước đây huốc chống ung hư được đư ào nhóm phương pháp hó rị
liệu, trị liệu hóc m n à miễn dịch trị liệu. Trong đó hó rị liệu lại bao gồm nhi u
nhóm hác nh u ùy theo cấu rúc hó học à cơ chế ác động như nhóm y hó
nhóm háng sinh nhóm chống chuyển hó nhóm ức chế topoisomeraza I à II
nhóm ức chế phân bào các hợp chấ p inum à các hợp chấ hác. Tuy nhiên
nhóm cuối cùng này ẫn đ ng ngày càng mở rộng nên các nhà ho học đã đ xuất
cách hức phân oại mới dự rên đích ác động. Cụ thể các nhà ho học cho rằng
thuốc chống ung hư có hể ác động ở nhi u mức độ hác nh u: TBUT, nội m
chất n n ngoại bào h y hệ thống miễn dịch. TBUT có hể trở hành đích ác động ở
mức độ ADN, ARN hay protein. Hầu hế các ác nhân hó rị liệu ương ác ới
ADN của TBUT rong hi các háng hể đơn ng à các phân ử nhỏ được thiết kế
để ác động ở mức độ protein, mức độ nội m à mức độ chất n n ngoại bào. Dù ở
mức độ nào các hợp chấ để được phá riển hành huốc sử dụng cho người đ u cần

8
tr i qua mộ uá r nh sàng ọc nghiêm ngặt rên nhi u đối ượng cũng như uy m
hác nh u. Trong lịch sử phá riển ĩnh ực sàng ọc thuốc, đã có một số m h nh
được sử dụng như:
1.2. C c h nh n ọc h c ch n n h
1.2.1. Nuôi cấy cơ quan
Đây à oại m h nh được sử dụng từ những năm 1950. Các cơ u n được
ách r hỏi cơ hể đem nu i cấy in vitro. S u đó chúng được ương ác ới các hợp
chất cần thử. Ưu điểm củ m h nh này à uy r được ính nguyên ẹn củ m
cũng như mối quan hệ giữa tế bào ới tế bào nhờ vậy mà nó có ính ương đồng cao
với đi u kiện in vivo. Tuy nhiên o những hó hăn trong hác biệt v mẫu mà
việc đánh giá hiệu qu của thuốc có nhi u sai số, do vậy việc sử dụng m h nh này
bị hạn chế à hó để áp ụng ào sàng ọc thuốc uy m ớn [4].
Hình 2: Thận chuột được sử dụng để sàng lọc thuốc
1.2.2. Nuôi cấy tế bào
Như đã biế các hử nghiệm độc ính b n đầu được tiến hành rên sinh
thiết khối u nu i cấy nhân ạo rong m i rường có hành phần h ng ác định, do
vậy uá r nh định ượng rấ hó hăn. Năm 1950, nhờ sự phá riển củ c ng nghệ
nu i cấy tế bào hành ạng đơn ớp 2D rong đĩ Pe ri hủy tinh hoặc nhựa, kết hợp

9
với sự phá riển củ m i rường có hành phần ác định v mặ hó học nên uy
r nh sàng ọc thuốc được tiến hành đơn gi n hơn rên các tế bào nu i cấy 2D này.
Sử dụng các loại thuốc nhuộm protein sẽ cho phép chúng ác định được mối
quan hệ đáp ứng li u giữ các ng ế bào hác nh u ới các nồng độ thuốc thử
hác nh u [39].
Các tế bào hi được phân ập đem nu i cấy in vitro hường phá riển hành
dạng hoặc r i n i, hoặc bám ính, hoặc hỗn hợp c 2 loại. Các oại TBUT sống r i
n i như ế bào u ympho TBUT máu h y ế bào ung hư m iên ết Sarcoma-180.
Các ế bào này phá riển giống những h n đ o nhỏ r i n i rong m i rường nu i
cấy. Nhi u tế bào sống ở dạng bám ính như nguyên bào sợi, TBUT c tử cung
HeLa, TBUT ú KPL4… Một số tế bào sống ở dạng hỗn hợp c bám ính c r i
n i như TBUT biểu m ph i 3LL [11, 27, 39].
Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy
Sử dụng m h nh tế bào 2D có nhi u ưu điểm như hời gi n sàng ọc ngắn,
cho phép h o ác ới nhi u ng ế bào nhi u hợp chấ hác nh u à i nồng độ
rộng cùng mộ úc. Tuy nhiên m h nh này có nhược điểm à ương ác giữa TBUT
với hợp chất chỉ theo một chi u, thiếu sự ương ác giữa TBUT với hệ miễn dịch

10
cũng như của hệ miễn dịch với hợp chấ . Như ậy m h nh này h ng m phỏng
được đi u kiện in vivo củ cơ hể [39].
1.2.3. Nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư (multicellular tumor spheroid)
M h nh nu i cấy khối cầu đ bào ung hư gọi tắ à m h nh spheroi à
một khối h nh cầu được tạo nên ừ TBUT. Để tạo được m h nh này người ta tiến
hành nu i cấy giọ reo các TBUT. Dưới ác dụng của trọng lực cùng ới các iên
kết giữ các ế bào các TBUT tập trung lại à iên ết với nhau tạo nên các hối
cầu nhỏ. S u đó các hối cầu nhỏ này được đư ào các đĩ nu i cấy chứ m i
rường nu i cấy ương ứng đã phủ một lớp giá đỡ bên ưới [11, 39].
Hình 4: Mô hình cấu trúc cơ bản của khối u invivo và khối cầu đa bào ung thư
Cấu rúc của một khối spheroid bao gồm:
 Lớp ng ngoài: Gồm kho ng từ 2-3 lớp tế bào sống phân chi mạnh
xếp hí nh u. Độ ày mỏng của lớp này ùy huộc từng ng ế bào hác

11
nh u ùy đi u kiện m i rường à ùy nguồn tế bào b n đầu ùng để tạo
spheroid.
 Lớp trung gian: Gồm những tế bào ẫn sống nhưng đã ngừng phân chi .
Các ế bào củ ùng này có hể h nhập để hành những tế bào củ ng
ngoài hoặc ng rong ùy thuộc đi u kiện nu i cấy (có mạch máu hoặc
h ng nồng độ g ucozơ pH…). V i r củ ùng này há u n rọng
rong các hí nghiệm đi u trị ung hư bằng hó chất, xạ trị.
 Lớp rong cùng: à õi hoại tử, bao gồm những tế bào đã chết, có nhân
kế đặc lại nên ánh sáng u ng học h ng hể uyên u được, ậy lớp
này có màu đen hi u n sá ưới ính hiển i. Độ ày mỏng của lớp này
ùy huộc ào ừng gi i đoạn hác nh u của uá r nh sinh rưởng khối
spheroid [34].
So với m h nh nu i cấy tế bào đơn ớp h cấu rúc của spheroid gần giống
với hệ thống in vivo hơn. Các nghiên cứu gần đây cho hấy các tế bào được nu i cấy
rong m h nh 3D biểu hiện các đặc ính hác so ới khi nu i cấy 2D. Những sự
hác biệ này được coi như à yếu tố giúp m h nh 3D ph n ánh ố hơn sự ương ác
giữ các TBUT với m i rường in vivo như:
 V đặc điểm h nh hái: Các TBUT nu i cấy 2D có h nh hái r i rộng
h ng ự nhiên c n các TBUT nu i cấy 3D có sự iên ết chặt chẽ ba
chi u, co cụm giống với khối u in vivo.
 V tốc độ ăng rưởng: Các TBUT nu i cấy 3D phá riển chậm hơn so
với hi nu i cấy 2D. Tốc độ phá riển ở m h nh 3D ph n ánh các m
h nh oán học động học của khối u in vivo tốt hơn so ới m h nh 2D.
 Các TBUT rong m h nh 3D cũng biểu hiện uá r nh đường phân nhi u
hơn à có sự hác biệt trong biểu hiện ở các gene chịu rách nhiệm trong
uá r nh ăng sinh mạch máu như VEGF ( scu r en o he i grow h
factor), chemokine, IL-8 à các gene chịu rách nhiệm rong uá r nh i

12
nhập à âm hực của tế bào b o gồm Rho GTP se à FAK (foc
adhesion kinaza).
 Các TBUT được nu i cấy 3D thể hiện ính háng mạnh hơn hoặc nhạy
c m hơn ới một số liệu pháp hó rị so với hi nu i cấy 2D ùy huộc
ào oại tế bào à oại thuốc. Sự hác biệ rong độ nhạy này ở m h nh
3D có hể đặc rưng cho phương hức các TBUT đó đáp ứng với các
phương hức hó rị liệu ở mức độ in vivo [24].
Như ậy các hối cầu nhỏ này sẽ à m h nh ố hơn để đánh giá độc ính
bởi lẽ chúng có cấu rúc ba chi u à m phỏng được sự khuếch án huốc ào các
m . Spheroi c n cho phép đánh giá uá r nh âm nhập của thuốc ào các hối u
h ng có mạch máu đồng thời cũng đánh giá được ác động của O2, CO2 à sự âm
nhập củ các chấ inh ưỡng rong m i rường ào các m này. Gần đây các nhà
khoa học đã iến hành đồng nu i cấy 3D các TBUT với các ế bào b nh hường cũng
có mặ rong i m i rường của khối u. Khi đó các ác động của thuốc ên các ế
bào ành ung u nh hối u có hể được kiểm chứng. Hầu hế các nghiên cứu được
thực hiện rên spheroi cũng được thực hiện rên các ng ế bào [24, 28, 30, 39,
47].
1.2.4. Mô hình in vivo
Thực nghiệm cho thấy rằng các TBUT của khối u ác ính rên cá hể này có
thể cấy truy n cho các cá hể hác cùng ng à các TBUT này cũng có kh năng
phá riển à giết chết vật chủ mới. Tất c các ế bào b nh hường củ động vậ có
ương sống rưởng hành à các ế bào ở khối u của thực vậ giun r n động vật da
g i à các ạng sống thấp hác h ng có h năng này. Chỉ có các ạng sống t
chức cao như cá ưỡng cư b sá chim à động vậ có ú có h năng bị khối u ác
ính. Rõ ràng ung hư à mộ căn bệnh c đại, các nhà ho học đã m hấy bằng
chứng ung hư m iên ế ương ở ương hủng long từ hơn b y mươi triệu năm
rước. Do đó iệc sử dụng các m h nh động vậ để thay thế con người trong việc
nghiên cứu ung hư à sàng ọc thuốc à đi u hoàn oàn có cơ sở khoa học [39].

13
Có nhi u oài động vậ được sử dụng để ây ựng m h nh in vivo như hỏ,
mèo chuộ cá gà… Trong số đó chuộ được sử dụng rộng rãi hơn c do sự ương
đồng v mặt di truy n với con người cũng như sự tiện lợi hi nu i à chăm sóc
rong ph ng hí nghiệm. Chuột dễ sinh s n à đặc biệ à có sự n định hi ùng để
gây ạo khối u thực nghiệm.
M h nh in vivo có ưu điểm n i bậ à đánh giá được chính ác ác động của
thuốc ên hối u cũng như ên cơ hể do sự ương ác của c ba yếu tố: hệ miễn dịch,
khối u à huốc quyế định. Tuy nhiên uá r nh sàng ọc rên m h nh này ốn
nhi u thời gi n hơn so ới các m h nh hác à cần có sự heo õi chặt chẽ hường
uyên củ người àm hí nghiệm [40].
Như ậy có hể thấy ù sử dụng bấ m h nh nào cũng sẽ có những ưu
nhược điểm riêng. Nhưng ễ thấy rằng m h nh nu i cấy tế bào 2D in vitro có h
năng ự động hó c o có hể sử dụng nhi u máy móc h y hế cho người àm hí
nghiệm đồng thời rú ngắn được thời gi n h o ác rên nhi u ng ế bào ới nhi u
hợp chấ hác nh u. Do vậy m h nh này rấ phù hợp để sử dụng cho sàng ọc
thuốc uy m ớn, nhấ à ới sự phá riển mộ ượng lớn các huốc có độc ính như
hiện nay. Mặ hác s u uá r nh sàng ọc uy m ớn chúng sẽ thu nhận được
các hợp chấ có độc ính như mong muốn. Lúc này m h nh 3D đóng i r như
m h nh rung gi n cho phép iến hành các hử nghiệm m phỏng m i rường in
vivo rong cơ hể với chi phí rẻ hơn ễ àng iến hành ở đi u kiện ph ng hí
nghiệm u n sá được rõ ràng à nh nh hơn cơ chế hâm nhập à ác động của
thuốc ào m h nh hối u mà ại ránh được các ấn đ v đạo đức rên các hử
nghiệm động vậ . S u đó m h nh in vivo sẽ trở hành mộ m h nh sàng ọc thứ cấp
cho phép đánh giá chính ác ác động của thuốc ên hối u rong cơ hể. Việc sử
dụng m h nh in vitro như m h nh sàng ọc sơ cấp sẽ cho phép chúng iết kiệm
thời gi n cũng như inh phí hi sàng ọc một số ượng lớn, lựa chọn ra những hợp
chấ iêu biểu có ác ụng để tiến hành hử in vivo.

14
1.3. M n b n h
1.3.1. Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết ở người - HCT116
HCT116 à ng ung hư biểu m ruột kết củ người, sống ở trạng hái bám
ính hi nu i cấy in vitro. HCT116 có ph n ứng ương ính ới keratin khi nhuộm
immunopero i se có mộ đột biến ở codon 13 ở proto-oncogene r s à có hể sử
dụng như đối chứng ương rong ph n ứng PCR kiểm r đột biến ở co on này.
Dạng ưỡng bội củ HCT116 có 45 NST chiếm 62% à ạng đ bội chiếm 6.8%.
Kết qu phân ích nhuộm G-band cho thấy 50% số tế bào HCT116 hiếu NST Y.
Hình 5: Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 ở người
1.3.2. Dòng tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung ở người - Hela
He à ng ế bào ung hư biểu m c tử cung ở người (Cervix
enoc rcinom ) được ách ừ khối u ung hư c tử cung của một phụ nữ đen b
mươi mốt tu i. He có các m r er đặc hiệu à sống bám ính rong đi u kiện nu i
cấy in vitro. 98% tế bào He có chứa một nhiễm sắc thể âm giữa nhỏ à 100% à
aneuploidy. Thời gi n nhân đ i củ He à 23h.
Tính đến n y đã có bốn marker nhiễm sắc thể (NST) điển h nh của Hela
được ghi nhận, bao gồm: M1 – à mộ ùng ái sắp xếp giữ cánh ài à âm động
của NST số 1 à cánh ài của NST số 3; M2 – à một t hợp củ cánh ngắn NST số

15
3 à cánh NST số 5; M3 – à mộ NST ương ự (isochromosome) củ cánh ngắn
NST số 5; M4 - gồm cánh ài NST số 11 à mộ cánh của NST số 19. Nhuộm băng
G cho thấy tế bào He có một b n sao của M1, một b n sao của M2, bốn đến năm
b n sao củ M3 à h i b n sao củ M4. He có ph n ứng ương ính ới keratin
khi nhuộm immunopero i se à có chứ r nh ự di truy n củ irus u nhú 18 của
người (human papilloma virus 18 – HPV-18); biểu hiện p53 thấp à pRB
(retinoblastoma suppressor) ở mức b nh hường.
1.3.3. Dòng tế bào ung thư biểu mô vú ở người - MCF7
Hình 6: TBUT vú MCF7 được nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro
MCF7 à ng ế bào ung hư biểu m ú hu ừ dịch màng ph i (vị rí i
căn) của một phụ nữ sáu mươi chín tu i có đặc ính bám ính ới thời gi n nhân
đ i à 29h rong đi u kiện in vitro. MCF7 có một số đặc ính của biểu m động vật
có ú đã biệ hó b o gồm kh năng ử ý es r io h ng u các hụ thể estrogen
trong tế bào chấ à h năng ạo khối cầu. MCF7 bị ức chế sinh rưởng bởi TNF-α.
V mặt kiểu nhân h ng hường số ượng NST điển h nh củ MCF7 à 82 có hể
o động từ 66 – 87 NST. D ng ế bào này có ho ng 29 – 34 marker NST, trong
đó 24 – 28 m r er à uất hiện hường uyên ở kho ng 30% tế bào.

16
1.3.4. Dòng tế bào ung thư vú ở người - KPL4
KPL4 à ng ế bào ung hư ú ở người được phân ập từ dịch màng ph i ác
ính của một bệnh nhân ung hư ú đã i căn s ng ung hư ạng iêm. D ng ế
bào này biểu hiện Erb B-1, Erb B-2 à Erb B-3. KPL4 có h năng gây u ở chuột
sạch miễn dịch. KPL4 được đánh giá à hữu dụng trong việc phá riển các chiến
ược chống lại bệnh ung hư ú có biểu hiện uá mức các hụ thể họ Erb B.
1.4. Ch h H n Ma n De ne h c Taxol
1.4.1. Honokiol (H) và Magnolol (M)
Vỏ cây à rễ củ các oài thuộc họ Ngọc lan Magnoliaceae đã được sử dụng
như mộ phương huốc c truy n ở Hàn Quốc, Trung Quốc à Nhật b n để đi u trị
nhi u chứng bệnh hác nh u b o gồm chứng o âu đột quỵ o ăng huyế áp sốt
hương hàn rầm uấ đ u đầu à các chứng iên u n đến thần inh hác. Trong số
các hợp chấ ách chiế được từ các oài cây này các nhà ho học đặc biệ chú ý
đến hai chấ Hono io à M gno o . Đây à h i đồng phân của một hợp chất chứa
gốc pheno được ách chiết từ vỏ cây Hậu phác Magnolia officinalis Rehd. Et wils,
c n gọi à Hậu phác bắc.
Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd. Et wils (trái) và cấu trúc phân tử
của hai đồng phân Honokiol và Magnolol (phải)
Honokiol (3,5'-diallyl-4,2'-dihydroxybiphenyl) chiếm kho ng 1-5% trọng
ượng vỏ cây à M gno o (5,5'-diallyl-2,2'-dihydroxybiphenyl) chiếm kho ng 2-

17
10% đ u có c ng hức cấu tạo à C18H18O2 với trọng ượng phân ử M = 266,33
Theo các nhà ho học, hoạ ính của hai chấ này có được à nhờ các nhóm chức
hy ro y à y ic.
M gno o hường được sử dụng để đi u trị đ u cấp ính ho chứng lo lắng à
các chứng iên u n đến dạ ày. Các ết qu khoa học đã c ng bố cho thấy
M gno o có hoạ ính háng hu n háng iêm chống o y hó chống ung hư
b o vệ tế bào hần kinh vỏ khỏi đi u kiện thiếu oxy (hypoxia). Trong hi đó
Honokiol - đồng phân của Magnolol - hác với Magnolol ở cách sắp xếp của một
nhóm chức y rên ng pheno . Đây à mộ điểm quan trọng quyế định hoạ ính
sinh học củ Hono io . Các nhà ho học cũng phá hiện thấy Hono io có ược
ính rộng như háng iêm chống đ ng máu chống rối loạn nhịp tim, b o vệ thần
kinh, chống o y hó . Các nghiên cứu hác cũng cho hấy Hono io có hể sử dụng
như ác nhân chống stress, chất ức chế ung hư ti m năng à các hư hỏng do oxy
hó gây r . Magnolol gây apoptosis ở nhi u ng TBUT như ung hư ph i CH-27,
HL-60 ung hư ạ ày COLO 205 ung hư g n HepG2 rong hi Hono io gây
apoptosis ở các ng TBUT buồng trứng SKOV3 ung hư máu Mo 4B ế bào ung
hư ruột kết RKO, TBUT ph i CH27, tế bào nội m chuyển dạng SVR à có hoạt
ính chống ung hư à ung hư m iên ết mạch SVR in vivo rên m h nh chuột
nhắt [3, 17, 21, 45, 46].
Thực hiện các nghiên cứu chuyên sâu hơn v cơ chế c m ứng apoptosis của
Magnolol các nhà ho học đã chỉ ra rằng ưới ác động củ M gno o F s được
hoạ hó à cytochrome c được chuyển từ ty thể ra tế bào chấ h ng u chênh ệch
nồng độ ion Ca2+
tự do trong bào ương à uá r nh đi u h âm của Bcl-2 (B-cell
lymphoma 2). Th ng u sự hoạ hó F s và sự gi i phóng cy ochrome c, caspase-8
à caspase-9 được hoạ hó , từ đó éo heo chuỗi ph n ứng u i ng củ các
c sp se à ẫn đến apoptosis. Xử ý ế bào ới ZB4 ( ác nhân àm gián đoạn cơ chế
đáp ứng F s) cũng àm gi m ác động của caspase-8 c m ứng bởi Magnolol, từ đó
àm gi m ác suất x y r pop osis. Tuy nhiên đến n y các nhà ho học vẫn chư

18
tr lời được liệu Magnolol hoạ hó F s rực tiếp h y nó ích hoạt hoạ động của
một phối tử Fas rồi s u đó phối tử này mới hoạ hó F s [22, 38, 46].
Hình 8: Cơ chế tác động của Honokiol (H) và Magnolol (M) lên con đường truyền tin dẫn
đến apoptosis của tế bào
Trong hi đó Hono io được chứng minh à có ác động đi u h âm c-FLIP
(FLICE- i e inhibi ory pro ein c n gọi à cFLAR) ở TBUT, dẫn đến àm TBUT
mẫn c m hơn với các con đường apoptosis c m ứng bởi c TRAIL (TNF-related
apoptosis-inducing ligand) à F s. Chỉ sử dụng Honokiol sẽ ức chế ở mức độ vừa
ph i sự ăng rưởng củ các TBUT ph i ở người trong khi nếu kết hợp với TRAIL,
nó sẽ àm gi m mạnh mẽ kh năng sống của tế bào à c m ứng apoptosis tố hơn so
với chỉ sử dụng TRAIL. Quá r nh apoptosis c m ứng bởi F s hi Hono io được sử
dụng kết hợp với một phối tử Fas hoặc mộ háng hể háng F s cũng có ết qu
ương ự.

19
Trong tất c các pro ein iên u n đến uá r nh pop osis đã được kiểm tra
h c-FLIP à pro ein uy nhấ được đi u h âm nh nh chóng bởi Honokiol ở tất c
các ng ế bào. Đi u này cho hấy đi u h âm c-FLIP à mộ bước chủ chốt của
uá r nh ác động của Honokiol dẫn đến apoptosis c m ứng bởi thụ thể chết [2, 12,
15, 46]. Cấu rúc 2 ng phenol chứ 2 nhóm y giúp ăng ái ực của Honokiol
với các ế bào nội m ; nó hoạ động như ác nhân chống o y hó ức chế sự o y hó
của lipoprotein có tỷ trọng thấp à uá r nh pop osis c m ứng bởi glucose ở tế bào
nội m củ người nhờ các hoạ ính mạnh trong việc àm sạch các gốc tự do [5-8,
20, 19, 22, 23, 25, 26, 33, 38, 42, 44].
1.4.2. Derrone (D)
Cây V ng nem c n được gọi bằng nhi u ên gọi hác à cây á V ng H i
đồng b Thích đồng b có ên ho học à Erythrina orientalis L. Murr., thuộc họ
Đậu Fabaceae. Loài này phân bố rộng từ Ð ng Á ới châu Phi. Ở châu Á oài này
ph biến ở Ấn Độ, Trung Quốc Thái L n C mpuchi Lào Việt Nam, Malaixia,
Indonesia à Philippin. Đây à một trong những vị thuốc ân gi n ở Việ N m à
nhi u nước hác rên hế giới, có ác ụng n hần hạ huyế áp háng hu n à
chống oãng ương.
Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L., Fabaceae và công thức cấu tạo Derrone
Derrone (5,4-dihydroxy-7,8-(2,2-di- methylpyrano)isoflavone) có c ng hức
hó học à C20H16O5, M = 336,1 à hợp chất được ách chiết từ cây V ng nem
Erythrina orientalis (L.) Murr.,. Trong c ng r nh nghiên cứu được c ng bố ào

20
háng 6 năm 2012 Hayet Edziri à cộng sự đã chứng minh Derrone có ác động
háng hu n với vi khu n Pseudomonas aeruginosa à Escherichia coli với nồng
độ trong kho ng từ 7,81 – 15,62 µg/mL. Ngoài r Derrone cũng hể hiện ính háng
nấm mạnh với các oài huộc họ Candida ở nồng độ 7,81 µg/mL à có ính độc với
ng ế bào ung hư g n HepG2. Tuy nhiên các cơ chế chuyên sâu ác động của
Derrone ên ế bào ẫn c n chư được biế rõ [10, 18].
1.4.3. Taxol (Paclitaxel)
Taxol (C47H51NO14, M = 853,906 g/mol) lần đầu iên được đ cập đến với ên
gọi Caltuvocus – cây Thủy ùng ừ thời L Mã c đại. Một số bài huốc ân gi n
cũng sử dụng các ịch chiế này như à chấ độc hoặc thuốc chữa bệnh. Lịch sử hiện
đại nghiên cứu v Taxol bắ đầu từ năm 1962 hi iến sĩ Arthur S. Barclay thu thập
vỏ của Taxus brevifolia à một trong số các mẫu củ oài này hể hiện độc ính ới
tế bào. Năm 1967 Monroe E. W à M nsu h C. W ni huộc Viện ung hư Ho
Kỳ ách chiết được chấ này ừ vỏ cây Taxus brevifolia à đặ ên à T o . S u này
hi được phá riển hành hương ph m bởi Bristol-Myers Squibb (BMS), Taxol
được đ i ên hành Paclitaxel.
Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol
Năm 1971 cấu rúc phân ử của Taxol được phá hiện nhờ các phân ích inh
thể bằng tia X bởi chính Monroe à W ni. Năm 1979 iến sĩ Horwi z à cộng sự
c ng bố các phá hiện của họ v ương ác giữa Taxol với các i ống: nó có h

21
năng húc đ y uá r nh h nh hành i ống bằng cách bám à àm b n vi ống, từ đó
h y đ i lịch r nh đã định sẵn củ uá r nh phân bào gây r sự chết cho TBUT lẫn
tế bào b nh hường. Các hử nghiệm âm sàng ới Taxol bắ đầu từ háng 4 năm
1984 à cho đến nay, Taxol đ ng được sử dụng để đi u trị ung hư ph i ung hư
buồng trứng ung hư ú ung hư chuyển dạng Kaposi sarcoma [29, 35].
Các nghiên cứu chuyên sâu cho hấy Taxol có h năng iêu iệt TBUT
h ng u các con đường độc lập với p53; ác động này sẽ được ăng cường hiệu
qu với các ế bào bị đột biến p53 hơn à ới các ế bào có iểu gen p53 dại. Ngoài
ra, Taxol có u hướng c m ứng chặn tế bào đi ừ G2 s ng M rong chu r nh ế bào
à gây r pop osis ở các ế bào bị chuyển dạng, nhưng chỉ gây r ừng ở G1 với
các ế bào h ng bị chuyển dạng. Tất c các đặc ính này giúp Taxol có hể ác động
biệ hó ới các TBUT mà hại với các ế bào hường [35, 43].
V cơ chế ác động ên ế bào ẫn đến pop osis cũng như các ác nhân c m
ứng apop osis hác cơ chế của Taxol cũng iên u n đến họ protein Bcl-2. Taxol có
thể đi u chỉnh biểu hiện củ các hành iên rong họ pro ein này à gây r biến đ i
sau dịch mã củ các phân ử Bcl-2. Taxol đi u h âm Bc -XL à đi u h ương
B à B . Ngoài ra, Taxol cũng c m ứng sự phosphory hó Bc -2 từ đó c m ứng
pop osis. Các nghiên cứu gần đây cũng cho hấy sự phosphory hó Bc -2 chỉ xuất
hiện ở các ế bào đã được dừng ở phase G2/M sau khi xử ý ới Taxol. Đi u này gợi
cho thấy sự phosphory hó Bcl-2 chỉ xuất hiện như à hệ qu của sự dừng phân bào
tế bào. Các nhà ho học cũng chỉ ra rằng, hoạ hó JNK/SAPK cần cho gi i đoạn
sớm củ uá r nh pop osis khởi phá bởi Taxol. Ngoài r Taxol cũng c m ứng
apoptosis xuất hiện sau khi ngừng phân bào ới cơ chế u i ng sự n định các i
sợi ubu in mà hiện nay vẫn chư được biế rõ [35, 43].

22
Hình 11: Cơ chế tác động của Taxol lên tế bào gây apoptosis
Hình 12: Hình ảnh mô phỏng liên kết của Taxol với vi sợi tubulin
1.5. Enzyme Aurora kinaza
Aurora kinaza thuộc nhóm những pro ein đi u khiển uá r nh phân bào.
Chúng b o gồm b pro ein hành iên có ên gọi Auror A Auror B à Auror C.
Các pro ein này iên u n đến uá r nh h nh hành à phân chi rung thể uá r nh
iên ế các inetochore với các i sợi (micro ubu e) à sự sắp xếp củ hoi sắc.
V ậy, những pro ein này đóng mộ i r u n rọng rong uá r nh phân chi

23
của nhiễm sắc thể à sự n định v nhân ế bào [41]. Sự quan âm đến các pro ein
này ăng ên hi các nhà ho học nhận thấy sự ương u n giữa sự biểu hiện uá
mức củ các pro ein này rong rất nhi u loại ung hư ới sự bấ hường của bộ
nhiễm sắc thể [2]. Gen uy định Aurora A nằm rên nhiễm sắc thể 20 củ người tại
vị rí 20 13. Sự biểu hiện uá mức củ pro ein này ần đầu iên được phá hiện ở
ung hư ruộ nguyên phá . Đây chính à bằng chứng đầu iên cho hấy mối iên u n
giữ Auror à ung hư. Auror hoạ động như gen gây ung hư hi chuyển nhiễm
ào các ng tế bào nguyên bào sợi Rat1 ở chuột cống hay NIH3T3 ở chuột nhắt.
Gen Aror A h ng những được ăng cường trong nhi u ng ế bào mà c n ở 52%
ung hư rực ràng nguyên phá à 12% ung hư ph i nguyên phá [13].
Auror B cũng biểu hiện uá mức ở các ng ế bào ách ừ ung hư ruột [9].
Hơn nữa, sự biểu hiện uá ngưỡng của Aurora B trong tế bào nu i cấy ích hích sự
phân chi nhiễm sắc thể mộ cách bấ hường. Những tế bào h nh hành sẽ à những
tế bào nhân uái ( neup oi y) à có hể húc đ y sự h nh hành ung hư ở chuột
[31]. Tại kỳ giữ à ỳ sau củ uá r nh phân bào Auror B tạo hành phức hợp
với các pro ein hách (p ssenger pro eins) như Sur i in INCENP TD60 à
Borealin. Những pro ein này cũng biểu hiện vượt mức ở một số loại ung hư như
ung hư rực ràng ung hư ruộ ung hư ú… à một số ng ế bào chuyển dạng.
Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng Sur i in à INCENP à cơ chất cho hoạ ính
enzym củ Auror B đồng thời chúng cũng à ác nhân ích hích hoạ ính của
pro ein này [37]. Như ậy rong các ng ế bào ung hư hoạ ính của Aurora B
phụ thuộc ào sự biểu hiện củ chính b n hân nó à các pro ein iên u n.
Aurora C biểu hiện uá mức ở ung hư uyến ti n liệ à một số ng ế bào
ung hư hác [41]. Đi u đó chứng tỏ rằng nó có hể có i r rong ung hư ế bào
soma. Mặc ù ậy, sự hiểu biết v chức năng củ pro ein này ần c n rấ nghèo nàn.
Những đi u rên chứng tỏ Aurora kinaza à một mục iêu rong đi u trị ung
hư à o ậy việc m iếm các chất ức chế hoạ ính của Aurora kinaza à rất cần
thiết. Mộ ài chất ức chế đã được nghiên cứu à c ng bố như ZM447469 (2003)

24
Hesperadin (2004), VX-680 (2004) and PHA-680632 (2006), Benzo[e]pyridoindole
(2008) (Hình 13). Trong số đó VX680 có ác ụng ức chế sự phá riển ung hư in
vivo à hiện n y đ ng được em é để thử nghiệm âm sàng. Tuy nhiên những chất
ức chế này có một số ác ụng phụ à ính đặc hiệu chư c o. VX680 à một chấ có
nhi u triển vọng nhất hiện nay trong việc ức chế hoạ ính củ Auror nhưng đồng
thời nó cũng ức chế FLT-3 LcK à kinaza đột biến BcrAbl T315I. Mặ hác hoạt
ính của chấ này c n phụ thuộc ào p53. Hơn nữ rong uá r nh phá riển u
hường xuất hiện các đột biến ung u nh các ị rí (si es) đi u khiển hoạ ính
kinaza. Do vậy, việc nghiên cứu à m iếm các chất ức chế đặc hiệu hơn à rất cần
thiết [16].
Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza
( ): các ạng khung cấu rúc củ các chất ức chế; (b): các chất ức chế đã c ng bố

Luận văn cao học Phương pháp nghiên cứu
25
CHƯƠNG 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đ ợn n h ên cứ
- Các ng TBUT HCT116, He MCF7 à KPL4 o Nhóm nghiên cứu
Ung hư hực nghiệm – Bộ m n Tế bào M Ph i à Lý sinh – Khoa
Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gi Hà
Nội cung cấp.
- Mẫu Honokiol (H), Magnolol (M) à Derrone (D) do Viện Dược liệu
Trung ương cung cấp, dạng dung dịch đồng nhấ ưu rữ ở nồng độ
20.000µg/mL rong ung m i DMSO.
- Đối chứng ương T o ạng hương ph m 30mg/5mL ương đương
6.000µg/mL.
2.2. M y óc ụn cụ
Bảng 1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao
Tên Hãn ản xuất
Buồng đếm tế bào Thom s Đức
Coverglass Trung Quốc
Đĩ 96 giếng Corning, Mỹ
Đĩ nu i cấy tế bào 35, 100mm Corning, Mỹ
Lame, lamelle Trung Quốc
Ống Falcon 15, 50mL Corning, Mỹ
Ống y âm 1 5mL Corning, Mỹ

26
Pipet nhựa 1mL, 2mL, 5mL, 10mL Corning, Mỹ
Tube b o qu n Corning, Mỹ
Bảng 2: Thiết bị sử dụng
Kính hiển vi huỳnh quang Axio Plan 2 Carl Zeiss – Đức
Kính hiển i ser ué LSM 510 Carl Zeiss – Đức
Kính hiển i soi ngược Axiovert 40 CFL Carl Zeiss – Đức
Máy đọc ELISA BioLab – Mỹ
Máy y âm Uni ers 320 He ich Đức
Pipett aid Gibson
Tủ ấm 5% CO2 Shell Lab, Mỹ
Tủ hood Esco Mỹ
Tủ n nhiệt Gra Operation SS40-1 Đức
2.3. Hóa chất ử ụn
Bảng 3: Hóa chất sử dụng
Alexa antimouse 488 Invitrogen, Mỹ
Anti-Histon H3PS10 Antibody Invitrogen, Mỹ
Antitubulin antibody Invitrogen, Mỹ
Blue trypan Mỹ
BSA Merc Đức
Ce Ti er 96®A ueous Non-
Radioactive Cell Proliferation Assay
Promega, Mỹ

27
DMEM Invitrogen, Mỹ
Ethanol Trung Quốc
FBS Invitrogen, Mỹ
Hoestch 3334 Invitrogen, Mỹ
Paraformaldehyde Merc Đức
PBS Invitrogen, Mỹ
Peniciline/Streptomicin Invitrogen, Mỹ
Red Phalloidine Invitrogen, Mỹ
Trypsin Invitrogen, Mỹ
Tryton X Merc Đức
2.4. Ph ơn h h ạ hóa nhân n c c n b in vitro
 Tế bào được cất giữ trong Nito lạnh đem rã đ ng rong ủ n nhiệt 37ºC.
Chuyển dung dịch chứa tế bào ào ống falcon 15 mL đã có chứa dung dịch
PBS, y âm 1000 rpm rong 5 phú bỏ dịch n i, thu cặn tế bào.
Hình 14: Các dòng TBUT được bảo quản trong bình đựng Nito lỏng
 Phân án ế bào ắng ào 5-7 mL m i rường nu i cấy hích hợp, sục đ u rồi
cho ào đĩ pe ri 100 mm hoặc ch i nu i cấy T25 ủ trong tủ ấm 37ºC 5%
CO2. Kiểm r hàng ngày, h y m i rường 2 ngày/lần, khi tế bào mọc ín

28
75-90% b mặ đĩ h hu hoạch hoặc tiến hành cấy chuyển tế bào s ng đĩ
nu i cấy mới.
 Thu tế bào ừ đĩ nu i cấy bằng cách ủ với dung dịch Trypsin-EDTA 1X
rong 5 phú ở 37ºC 5% CO2. Trung h Trypsin bằng cách b sung với m i
rường nu i cấy đã b sung FBS hú ịch ào ống y âm đem y âm 1000
rpm trong 5 phú .
 Kiểm tra tỷ lệ tế bào chết bằng cách nhuộm với Blue trypan trong 3-5 phú
rồi đếm rên buồng đếm tế bào. Nếu tỷ lệ chết < 10% t ng số tế bào h tế
bào được xem à đủ khỏe mạnh ùng để cấy chuyển tiếp tục hoặc ùng cho
các mục đích hí nghiệm tiếp theo.
2.5. Ph ơn h hử đ c ính MTS
Nguyên ý:
MTS (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) – 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) – 2 -
(4-sulfophenyl) - 2H - e r zo ium) hi có mặt PMS (phenazine methosulfate) sẽ
được tế bào chuyển hó , tạo ra một s n ph m form z n n rong m i rường nu i
cấy tế bào hấp thụ ánh sáng ối đ ở bước sóng 490-500 nm rong đệm PBS. Lượng
formazan tạo ra sẽ được định ượng bằng ượng ánh sáng ở bước sóng 490nm bị hấp
thụ à ỷ lệ thuận với ượng tế bào sống rong m i rường nu i cấy đó. Phương pháp
MTS hường được coi à phương pháp MTT 1 bước có ính iện lợi cao do chỉ cần
b sung thẳng chấ ào m i rường nu i cấy tế bào mà h ng cần bất kỳ bước rửa
hay chu n bị nào hác.
Quy r nh hí nghiệm
Bảng 4: Dải nồng độ cuối cùng của thuốc thử trong giếng
Mẫu C1 (µg/mL) C2 (µg/mL) C3 (µg/mL) C4 (µg/mL) C5 (µg/mL)
H, M, D 5 10 20 40 50
Taxol 0,003 0,03 0,3 3 30
(Tương ứng nồng độ DMSO cuối cùng ở giếng à 0,125%, lặp 4 lần/nồng độ)

29
 Chu n bị tế bào: Với mỗi ng ế bào chu n bị dung dịch tế bào s o cho
có 5.000TB/180 µL/giếng rên đĩ 96 giếng. Trộn nhẹ để tế bào phân án
đ u rong các giếng u n sá iểm r ưới KHV đ o chi u, ủ ở 37o
C,
5% CO2 rong 24h để tế bào n định à bám ào b mặ đĩ .
 Chu n bị dung dịch thuốc rung gi n à ủ chất: Pha dung dịch trung gian
ương ứng có nồng độ cao gấp 10 lần nồng độ cuối cần thử trong giếng.
B sung 20 µL dung dịch rung gi n ương ứng rồi lắc nhẹ để thuốc phân
bố đ u trong giếng, ủ 48h ở 37o
C, 5% CO2 u n sá à ghi ại h nh nh
hàng ngày.
 Ủ MTS à đo mậ độ quang học: Chu n bị dung dịch MTS/PMS với tỷ lệ
1PMS:20 MTS. Thêm 30 µL hỗn hợp rên ào mỗi giếng đ ng chứa 200
µL dung dịch m i rường nu i cấy đã được b sung thuốc à ủ với tế bào
trong 48h. Ủ hỗn hợp rên rong 3h ở đi u kiện 37o
C, 5% CO2 rồi tiến
hành đo mậ độ quang học ở bước sóng 490nm. Dùng phần m m Excel
để xử ý số liệu ính chỉ số IC50 – Là giá rị nồng độ chất thử tại đó chất
thử có h năng gây chết 50% tế bào.
 Chỉ số IC50 của một chất với mộ ng ế bào được ính từ nghiệm
phương r nh hồi quy biểu diễn ương u n giữ à nồng độ hoặc log
nồng độ chất thử đó à y à chỉ số ăng sinh A (%) củ ng ế bào đó hi
được ủ với chất thử ở các nồng độ hác nh u hi y = 50 (%).
 A (%) được ính heo c ng hức:
o A (%) = V/Vh x 100%
V: Chỉ số OD đo được ở trong giếng hí nghiệm
Vh: Chỉ số OD đo được ở trong giếng đối chứng ung m i

30
2.6. Ph ơn h hử đ c ính ên h nh spheroid
 Tạo giá hể cho khối spheroid bằng agarose 1,5% cho ào các giếng của
đĩ 96. Chờ g rose đ ng ại tiến hành ạo giọ reo rên nắp đĩ 96 ới
mậ độ 5.000TB/giọt treo.
 S u 2 ngày tạo giọt treo hi u n sá hấy các ế bào ưới ác ụng của
trọng lực đã tạo hành cụm, tiến hành hạ giọ reo ào các giếng ương
ứng đã có giá hể agarose 1,5% à m i rường nu i cấy phù hợp.
Với hí nghiệm heo õi ốc độ sinh rưởng của khối spheroid
 Theo õi hàng ngày à h y m i rường, chụp nh 2 ngày/ ần cho đến khi
khối spheroi phân rã.
 Đo ích hước khối spheroi à ính hể ích hối bằng phần m m
AxioVison L.E. R4.5, dựng đường cong sinh rưởng để biết quy luậ ăng
rưởng của khối spheroid.
Với thí nghiệm kiểm tra ác động của H ên h năng ạo khối
spheroid
 Sau khi tạo giá hể, tiến hành ạo giọ reo rên nắp đĩ 96 giếng với mật
độ 5,000TB/giọt treo heo các nhóm mẫu hí nghiệm ương ứng bằng m i
rường có chứa H nồng độ (NĐ) 5µg/mL à m i rường có chứa H NĐ
10µg/mL.
 S u 2 ngày iến hành hạ giọt treo xuống các giếng chứ m i rường hoặc
m i rường chứa H với nồng độ ương ứng.
 Theo õi hàng ngày à h y m i rường, chụp nh 2 ngày/ ần
AxioVison L.E. R4.5, dựng đường cong sinh rưởng của khối spheroid ở
ba mẫu hác nh u à so sánh sự hác biệt xem liệu H có nh hưởng đến
uá r nh ạo khối spheroi h y h ng.

31
Với thí nghiệm heo õi ác động của H ên uá r nh ăng rưởng khối
spheroid
 Sau khi tạo giá thể, tạo giọt treo à hạ giọt treo ào các giếng ương ứng
đã có giá hể agarose 1,5% à m i rường nu i cấy hường các hối
spheroi h nh hành được nu i rong m i rường 37o
C, 5% CO2.
 S u 5 ngày hạ giọt treo, tiến hành chi các giếng có chứ các hối
spheroi đồng đ u phá riển khỏe mạnh hành b nhóm mẫu: Đối chứng
sinh học (ĐCSH), mẫu ủ H NĐ 10µg/mL, à mẫu ủ H NĐ 20µg/mL.
 Theo õi hàng ngày h y m i rường ương ứng à chụp nh 2 ngày/ ần
AxioVison L.E. R4.5, dựng đường cong sinh rưởng của khối spheroid,
so sánh sự hác biệt xem H có ác động ên uá r nh sinh rưởng của
khối spheroi h y h ng.
2.7. Ph ơn h nh ễn ịch h ỳnh an
Nồng độ thuốc thử:
 H: 10 µg/mL à 20 µg/mL (với hí nghiệm kiểm r ác động ên c in)
 H, M, D: 10 µg/mL ( ới hí nghiệm kiểm r ác động ên Auror in z )
 Taxol: 0,3 µg/mL
Quy r nh hí nghiệm
 Chu n bị 4 đĩ nu i cấy tế bào 35 mm, mỗi đĩ chứa 04 coverglass. B
sung ào mỗi đĩ ung ịch chứa TBUT He nu i ới mậ độ
500.000TB/2,25mL m i rường. Các đĩ được chia hành 4 mẫu hí
nghiệm ương ứng gồm: ĐCSH H NĐ 10µg/mL, H NĐ 20µg/mL à
Taxol 0,3µg/mL
 S u 24h nu i cấy cho tế bào n định, bám uống b mặt coverglass, tiến
hành ủ thuốc với các nồng độ đã ự kiến.

32
 Cố định mẫu khi thấy phần lớn các tế bào đã có biến đ i h nh hái rõ rệt
ưới ác động của chất thử à ẫn đ ng bám ở rên đĩ .
 Nhuộm mẫu heo các bước như s u:
o Cố định mẫu bằng PFA 4% ở nhiệ độ ph ng rong 10 phú .
o Đục màng ế bào bằng TrytonX 0,5% ở nhiệ độ ph ng rong 10 phú .
o Block các iên ế h ng đặc hiệu à bộc lộ các iên ế đặc hiệu bằng
cách ủ mẫu với BSA 5% ở nhiệ độ ph ng rong 30 phú .
- Với hí nghiệm kiểm r ác động ên i sợi actin:
o Nhuộm háng hể 1 anti alpha-tubulin trong 1h ở nhiệ độ ph ng
ránh sáng. S u đó nhuộm háng hể 2 M488 rong 30 phú ở nhiệ độ
ph ng ránh sáng.
o Nhuộm trực tiếp actin bằng Red-phalloidine trong 1h ở nhiệ độ
ph ng ránh sáng.
o Nhuộm nhân bằng Hoechs 3334 rong 10 phú ở nhiệ độ ph ng
ránh sáng.
o Qu n sá ưới KHV huỳnh u ng à ghi lại h nh nh phân ích.
- Với hí nghiệm kiểm r ác động ên sự phosphory hó His one H3:
o Nhuộm háng hể 1 anti histone H3 antibody trong 1h ở nhiệ độ
ph ng ránh sáng. S u đó nhuộm háng hể 2 M488 rong 30 phú ở
nhiệ độ ph ng ránh sáng.
o Nhuộm nhân bằng Hoechst 3334 trong 10 phú ở nhiệ độ ph ng
ránh sáng.
o Qu n sá ưới KHV huỳnh quang à ghi ại h nh nh phân ích.

Luận văn cao học K t quả và thảo luận
33
CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. K ả hả đ c ính c a H n Ma n De ne ên
h nh 2D
3.1.1. Với dòng HCT116
Sau 48h ủ với các chấ hí nghiệm, tiến hành chụp nh mẫu ưới KHV đ o
chi u hu được kết qu như s u: các ế bào HCT116 có ích hước nhỏ h nh ạng
ài.
Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x)
Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) và 10µg/mL (phải)
(100x)
Kh ng có sự hác biệ đáng ể giữa mẫu ĐCDM ủ DMSO 0,125% với mẫu
ĐCSH. S u 48h ủ, ngay ở nồng độ thứ nhấ (5µg/mL) H đã có ác ụng rõ rệt: 80%
các ế bào co r n ại. Ở nồng độ thứ h i (10µg/mL) các ế bào chỉ c n à các chấm

34
r n nhỏ à h ng c n sự hác biệ rõ rệt v h nh hái ới 3 nồng độ 20µg/mL
40µg/mL à 50µg/mL c n ại.
Magnolol (M) ác động rõ rệ đến tế bào HCT116 heo u hướng ương tự
ngay từ nồng độ 5µg/mL à cũng h ng có sự hác biệ rõ rệt v h nh hái ở 4 nồng
độ 10 µg/mL 20µg/mL 40µg/mL à 50µg/mL c n ại.
Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol ở nồng độ 5µg/mL (trái) và 50µg/mL (phải)
(100x)
Với Taxol, sau 48h ủ, ở nồng độ thứ nhất 0,003µg/mL tế bào đã có u hướng
co lại so với mẫu ĐCSH. Xu hướng này ăng rõ rệt theo chi u ăng nồng độ các ế
bào co ại hành ạng r n à nhỏ dần từ nồng độ 0,03µg/mL, 0,3µg/mL, 3µg/mL
đến 30µg/mL.
Hình 18: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Taxol nồng độ 0,003µg/mL (trái); 0,3µg/mL
(giữa) và 30µg/mL (phải) (100x)
Sau khi thực hiện ph n ứng kiểm r độc ính của chất bằng phương pháp
MTS đo mậ độ quang học ở bước sóng 490nm chúng i sử dụng phần m m

35
E ce để xử ý số liệu đo OD hu được. Kết qu ính chỉ số ăng sinh A (%) với
ng HCT116 được thể hiện ở b ng sau:
Bảng 5: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng HCT116 sau 48h ủ với với Honokiol, Magnolol
và Taxol
Chấ C (µ /mL) Lg(C) A(%)
Honokiol
5,00 0,7 30,03
10,00 1,00 17,25
20,00 1,30 17,54
40,00 1,60 18,97
50,00 1,7 20,47
Magnolol
5,00 0,7 18,88
10,00 1,00 16,99
20,00 1,30 17,16
40,00 1,60 18,27
50,00 1,7 19,64
Taxol
0,003 -2,52 74,79
0,03 -1,52 72,52
0,30 -0,52 63,79
3,00 0,48 19,18
30,00 1,48 18,37
Sử dụng phầm m m Excel, tiến hành ẽ đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng
li u củ ng TBUT HCT116 ới các chấ H M à T o ự rên b ng số liệu
A(%) chúng i hu được các đồ thị như s u:

36
Hình 19: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Honokiol (H)
Hình 20: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Magnolol (M)

37
Hình 21: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Taxol
Dự rên ết qu chỉ số ăng sinh A (%) à các đồ thị rên có hể thấy các chỉ
số OD ương đồng với kết qu u n sá h nh nh sơ bộ rên KHV đ o chi u. Với H,
chỉ số A(%) gi m xuống c n 30% ở nồng độ thứ nhấ 5µg/mL à h ng có sự hác
biệ rõ rệt v chỉ số A(%) ở các nồng độ c n ại (17; 17; 18 à 20%). Đi u này có
thể gi i hích à o các ế bào đã bị ức chế tối đ ng y từ nồng độ thứ hai. Tương ự
với M, ngay ở nồng độ thứ nhấ 5µg/mL tế bào cũng đã bị ức chế tối đ à h ng có
sự hác biệ rõ rệt v chỉ số A(%) giữa năm nồng độ này. Với Taxol, chỉ số A (%)
gi m dần theo chi u ăng nồng độ à bắ đầu gi m mạnh từ nồng độ thứ ba
0,3µg/mL (63,8%) xuống nồng độ thứ ư 3µg/mL (19%). Kh ng có sự hác biệ rõ
rệt giữa nồng độ thứ ư 3µg/mL à nồng độ thứ năm 30µg/mL o đến nồng độ thứ
ư các ế bào HCT116 đã bị ức chế tối đ .
Dự ào m h nh ương u n hồi quy ây ựng được dự rên mỗi đồ thị
bằng chương r nh E ce , chúng i hu được giá rị IC50 ương ứng với H M à
T o ương ứng như s u:

38
Bảng 6: Giá trị IC50 của Honokiol, Magnolol và Taxol với dòng HCT116
Chất G ị IC50 (µg/mL) Chỉ s ơn uan R2
Honokiol (H) 2 0,93
Magnolol (M) 0,2 0,97
Taxol 0,4 0,95
Các giá rị IC50 đ u có chỉ số ương u n R2
> 0,9 cho thấy có hể tin cậy được.
3.1.2. Với dòng Hela
Sau 48h ủ thuốc, tiến hành chụp nh mẫu ưới KHV đ o chi u. H nh nh thu
được cho thấy các ế bào He phá riển khỏe mạnh b nh hường, mậ độ vừa ph i
trong giếng. H nh nh cũng cho hấy h ng có sự s i hác giữ các giếng ĐCDM à
ĐCSH. Như ậy, DMSO trong thuốc h ng có nh hưởng rõ rệ đến tế bào He .
Hình 22: Tế bào Hela mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x)
Hình 23: Tế bào Hela sau 48h ủ Honokiol ở nồng độ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL (phải)
(100x)

39
Qu n sá ưới KHV cũng cho hấy mức độ nh hưởng của H ên ng He
xuất hiện rõ rệt bắ đầu từ nồng độ thứ b (20µg/mL) s u đó ăng ần nh hưởng
cho đến nồng độ thứ năm (50µg/mL).
Với mẫu Hela ủ Taxol, các ế bào có u hướng co dần lại hi ăng ần nồng
độ thuốc thử. Tác động củ T o có hể thấy rõ rệt ngay từ nồng độ thứ nhất
(0,003µg/mL) à đến nồng độ cuối cùng (30µg/mL) tế bào hành ạng chấm r n
nhỏ.
Hình 24: Tế bào Hela ủ Taxol nồng độ 0,003 (trái), 0,3 (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x)
Sử dụng phần m m Excel xử ý số liệu đo OD hu được kết qu chỉ số ăng
sinh A (%) như s u:
Bảng 7: Chỉ số tăng sinh A(%) Hela với Honokiol và Taxol
Chấ C (µ / L) Lg(C) A(%)
Honokiol
5,00 0,7 115,45
10,00 1,00 123,48
20,00 1,30 68,15
40,00 1,60 20,49
50,00 1,7 20,63
Taxol
0,003 -2,52 71,55
0,03 -1,52 53,08
0,30 -0,52 51,42
3,00 0,48 53,59
30,00 1,48 20,91
Tiến hành ây ựng đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng li u của TBUT
Hela với các chấ H à T o chúng i hu được các đồ thị như s u:

40
Hình 25: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của Hela với Honokiol (H)
Hình 26: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của Hela với Taxol
Chỉ số ăng sinh A (%) ính được à đồ thị hu được cho thấy với H, A (%)
gi m rõ rệt ở nồng độ thứ ba (20µg/mL) trong khi giữa nồng độ thứ ư (40µg/mL)
à nồng độ thứ năm (50µg/mL) h ng có sự hác biệ rõ rệt (20%). Đi u này ương

41
quan với kết qu u n sá ưới KHV đ o chi u à có hể suy luận rằng đến nồng độ
thứ ư (40µg/mL) thuốc đã có ác ụng ức chế tối đ . Với Taxol, chỉ số A (%) của
Hela cũng có u hướng gi m theo chi u ăng nồng độ thuốc thử à u hướng gi m
rõ rệt từ nồng độ thứ nhất (0,003µg/mL) đến nồng độ thứ 2 chỉ số ăng sinh đã
gi m c n ho ng 50% à đến nồng độ thứ 5 chỉ c n 20%. Sau khi ây ựng phương
r nh ương u n hồi quy bằng Excel, chúng i hu được giá rị IC50 như s u:
Bảng 8: Giá trị IC50 của Honokiol và Taxol với dòng Hela
Chất G ị IC50 (µg/mL) Chỉ s ơn an R2
Honokiol (H) 31,63 0,94
Taxol 4,3 0,99
C 2 giá rị IC50 này đ u có độ tin cậy cao (R2
>0,9).
3.1.3. Với dòng MCF7
Kết qu u n sá ưới KHV đ o chi u cho thấy mẫu ĐCSH à ĐCDM
h ng có sự hác biệ rõ rệt. Tế bào MCF7 có ích hước lớn đ ng ở trạng hái
khỏe mạnh à mậ độ vừa ph i.
Hình 27: Tế bào MCF7 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x)
Với ng MCF7 H chỉ có ác ụng ở các nồng độ cao, bắ đầu từ nồng độ
thứ ba (20µg/mL) trở đi. Tại các nồng độ này s u 48h ủ với mẫu các ế bào h ng
tr i rộng rên b mặ nu i cấy mà bị co r n ại iên ết lỏng lẻo, một số r i n i
rong m i rường nu i cấy. Nhi u tế bào h ng c n sáng màu mà nhăn nheo à rở

42
nên đậm màu. Đây chính à các ế bào chết. Số ượng các ế bào này ở nồng độ thứ
năm (50µg/mL) chiếm tỷ lệ lớn nhất so với các nồng độ c n ại.
Hình 28: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Honokiol ở nồng độ 5 (trái); 20 (giữa) và 50µg/mL
(phải) (100x)
Với mẫu ủ Taxol, sự biến đ i h nh dạng tế bào có hể u n sá được rõ ràng
ngay từ nồng độ đầu iên (0,003µg/mL), tiếp đó sự hác biệt v h nh hái u n sá
được à h ng ớn với 3 nồng độ sau (0,03µg/mL, 0,3µg/mL, 3µg/mL) nhưng đến
nồng độ thứ năm (30µg/mL) các ế bào hầu hế h ng c n độ bóng ở dạng r n ép
dẹ ào b mặ đĩ nu i cấy.
Hình 29: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái), 0,3 (giữa), và 30µg/mL (phải)
(100x)
Dùng phần m m Excel xử ý số liệu đo OD hu được kết qu chỉ số A (%)
ương quan với h nh nh u n sá được rên KHV đ o chi u.

43
Bảng 9: Chỉ số tăng sinh A(%) của MCF7 với Honokiol và Taxol
Honokiol
5,00 0,7 112,54
10,00 1,00 134,13
20,00 1,30 20,63
40,00 1,60 23,75
50,00 1,7 18,99
Taxol
0,003 -2,52 77,55
0,03 -1,52 82,57
0,30 -0,52 75,37
3,00 0,48 64,61
30,00 1,48 20,06
Với Honokiol, A (%) gi m rõ rệt từ nồng độ thứ h i (10 µg/mL) uống nồng
độ thứ b (20µg/mL) à ừ nồng độ thứ b này h ng có sự hác nh u rõ rệt v A
(%) với các nồng độ s u. Như ậy có hể thấy s ng đến nồng độ thứ b (20 µg/mL)
các ế bào MCF7 đã bị ức chế gần như hoàn oàn. Với mẫu T o h ng có sự hác
biệt v chỉ số ăng sinh A (%) ở bốn nồng độ đầu nhưng ừ nồng độ thứ ư (3
µg/mL) đến nồng độ thứ năm (30 µg/mL) h A (%) gi m mạnh nhất – ương u n
với kết qu u n sá được rên KHV đ o chi u.
Hình 30: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của MCF7 với Honokiol (H)

44
Hình 31: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của MCF7 với Taxol
Sử dụng phương r nh ương u n hồi quy dự rên đường cong sinh rưởng
dựng nên có chỉ số IC50 ương ứng của H à T o như b ng sau:
Bảng 10: Giá trị IC50 của Honokiol (H) và Taxol với dòng TBUT MCF7
Honokiol (H) 17,8 0,93
Taxol 5,6 0,97
C 2 chỉ số IC50 này đ u có R2
cao (>0,9) cho thấy có đủ độ tin cậy.
3.1.4. Với dòng KPL4
Sau 48h ủ chất, tiến hành u n sá ưới KHV đ o chi u. Kết qu sơ bộ cho
thấy h ng có sự hác biệ rõ rệt giữa mẫu ĐCSH à ĐCDM h y ở nồng độ này
DMSO h ng có nh hưởng rõ rệ đến h nh hái à sức sống của tế bào.

45
Hình 32: Tế bào KPL4 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x)
Hình 33: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL (phải)
(100x)
Hình 34: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Magnolol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL (phải)
(100x)

46
Hình 35: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Derrone NĐ 5 (trái) và 20µg/mL (phải) (100x)
Hình 36: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái); 0,3 (giữa) và 30µg/mL (phải)
(100x)
C ba chất Hono io M gno o à Derrone đ u có u hướng ác động àm ức
chế ăng sinh mạnh mẽ ng KPL4 ở nồng độ thứ b (20 µg/mL). Ở nồng độ này
h nh hái ế bào ở c ba mẫu h y đ i há giống nhau so với mẫu ĐCSH à các mẫu
ủ với nồng độ thấp hơn. Tuy nhiên đến nồng độ thứ năm (50 µg/mL) rong hi ới
H à M ế bào KPL4 ẫn heo u hướng gi m ích hước hành các chấm r n nhỏ,
ém sáng bóng rên n n m i rường nu i cấy h ới D h ng c n u n sá được
h nh ạng của tế bào nữ à uất hiện rất nhi u tinh thể kết tụ lại.
Với Taxol, KPL4 bị ác động àm biến đ i h nh hái rõ rệt ngay từ nồng độ
đầu iên (0,003 µg/mL). Mức độ biến đ i này được uy r ở ba nồng độ kế tiếp, chỉ
đến nồng độ thứ năm (30 µg/mL) h nh hái ế bào mới h y đ i rõ rệt một lần nữa.
Các ế bào úc này có ích hước rất nhỏ, mấ đi hẳn độ sáng bóng b nh hường.

47
Bảng 11: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng KPL4 với Honokiol, Magnolol, Derrone và
Taxol
Honokiol
5,00 0,7 101,63
10,00 1,00 120,87
20,00 1,30 26,25
40,00 1,60 24,19
50,00 1,7 25,14
Magnolol
5,00 0,7 94,25
10,00 1,00 75,65
20,00 1,30 24,77
40,00 1,60 23,72
50,00 1,7 24,27
Derrone
5,00 0,7 90,28
10,00 1,00 90,11
20,00 1,30 29,33
40,00 1,60 28,09
50,00 1,7 28,78
Taxol
0,003 -2,52 67,83
0,03 -1,52 57,64
0,30 -0,52 53,77
3,00 0,48 64,86
30,00 1,48 24,11
Kết qu đo chỉ số hấp thụ ánh sáng ại bước sóng 490 nm cũng cho ết qu
ương đồng. Ở c ba chấ H M à D chỉ số ăng sinh A (%) gi m mạnh mẽ nhất
(kho ng 20%) tại nồng độ thứ 3 (20 µg/mL) à h ng có sự hác biệt nhi u với hai
nồng độ c n ại (40 à 50 µg/mL). Trong hi đó chỉ số ăng sinh A (%) của KPL4
với Taxol gi m xuống kho ng 50% từ nồng độ thứ h i (0 03 µg/mL) à chỉ xuống
đến kho ng 20% ở nồng độ cuối cùng (30 µg/mL)

48
Hình 37: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Honokiol (H)
Hình 38: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Magnolol (M)

49
Hình 39: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Derrone (D)
Hình 40: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Taxol
Gi i phương r nh hồi quy thiết lập được bằng chương r nh E ce có giá
trị IC50 củ H M D à T o ới ng ế bào KPL4 như b ng ưới đây:

50
Bảng 12: Giá trị IC50 của Honokiol, Magnolol, Derrone và Taxol với dòng KPL4
Honokiol (H) 8,3 0,91
Magnolol (M) 14,8 0,96
Derrone (D) 17,8 0,93
Taxol 8,9 0,93
C 3 giá rị này đ u có R2
> 0,9 cho thấy có đủ độ tin cậy.
Như ậy có hể t ng hợp các giá rị IC50 của ba chất Honokiol, Magnolol,
Derrone à đối chứng Taxol với 4 ng ế bào HCT116 He MCF7 à KPL4 đã
thử độc ính bằng phương pháp MTS hu được sau khi xử ý bằng phần m m Excel
như sau:
Bảng 13: Tổng hợp giá trị IC50 và chỉ số tương quan R2
của Honokiol, Magnolol, Derrone
và Taxol
Chất
HCT116 Hela MCF7 KPL4
IC50
(µg/mL)
R2
IC50
(µg/mL)
R2
IC50
(µg/mL)
R2
IC50
(µg/mL)
R2
H 2 0,93 31,63 0,94 17,8 0,93 8,3 0,91
M 0,2 0,97 14,8 0,96
D 17,8 0,93
Taxol 0,4 0,95 4,3 0,99 5,6 0,97 8,9 0,93

51
Từ b ng t ng hợp giá rị IC50 rên chúng i đư r một số nhận é như s u:
- Tất c các giá rị IC50 này đ u có chỉ số ương u n R2
>0,9 đ m b o đủ độ
tin cậy.
- Hono io M gno o à Derrone hi hử rên cùng ng ế bào đ u cho giá rị
IC50 c o hơn so ới Taxol ngoại trừ với ng KPL4 Hono io cho giá rị
IC50 ương đương ới Taxol.
- Giữa 3 chấ hí nghiệm rên ng KPL4 Hono io có chỉ số IC50 chỉ bằng ½
so với 2 chấ M gno o à Derrone c n ại, cho thấy độc ính c o hơn củ nó
với ng tế bào này.
- Với Honokiol, chỉ số IC50 gi m dần đối với ng He MCF7, KPL4 à
HCT116 bước đầu cho thấy độc ính củ nó ăng ần ương ứng. Chỉ số IC50
hu được với He c o hơn chỉ số với MCF7 nằm trong kho ng à với
KPL4, HCT116 h thấp hơn các giá rị IC50 đã c ng bố [3, 20, 26].
- Với M gno o à Derrone giá rị IC50 hu được cũng nằm trong kho ng các
giá rị IC50 đã ừng c ng bố [10].
Từ kết qu hí nghiệm thử độc ính bằng phương pháp MTS này chúng i
lựa chọn Honokiol à ng ế bào ung hư ú MCF7 để tiến hành hí nghiệm kiểm
r ác động của chấ ên m h nh 3D m phỏng cấu rúc 3D in vivo của khối u do
đặc ính ạo khối cầu tốt củ ng MCF7.
3.2. K ả n h ên cứ c đ n c a H n ên h nh 3D h c đa
b MC
3.2.1. Kết quả thí nghiệm theo dõi sự tăng trưởng khối spheroid MCF7
Sau h i ngày tạo giọt treo với ng MCF7 tiến hành hạ giọ reo à heo õi
sự ăng rưởng của khối trong 25 ngày ể từ sau khi hạ giọt treo. Kết qu ghi nhận
được cho thấy khối spheroi MCF7 có u hướng phá riển mạnh v ích hước từ
ngày hứ 9 sau khi hạ giọ reo à ăng iếp cho đến ngày hứ 17 s u đó gi m dần
với tốc độ chậm hơn.

52
Bảng 14:Thể tích của khối spheroid MCF7 qua 25 ngày sau khi hạ giọt treo
N y V (mm3
)
5 3,13
7 3,37
9 3,94
11 6,11
13 8,88
15 13,64
17 16,48
19 14,10
21 13,79
23 13,50
25 12,43
Trong kho ng thời gi n này cấu trúc của khối spheroi cũng n định dần,
vi n đậm à rõ né hơn spheroi r n hơn; cấu rúc õi hoại tử xuất hiện từ ngày hứ
5 sau khi hạ giọt treo. Vi n phân cách giữ õi hoại tử với phần tế bào ăng sinh bên
ngoài hối rõ ần õi hoại tử ăng ần diện ích mộ cách ương u n ới sự ăng
thể ích hối. S u ngày hứ 17 đi cùng ới suy gi m ích hước à cấu rúc hối
spheroid trở nên bất n: vi n ngoài h ng c n rõ né hối r n mất dần, cấu rúc
iên ết giữ các ế bào rong hối trở nên ỏng lẻo dần à các ế bào bong ần ra
khối spheroid.
Hình 41: Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 sau 25 ngày kể
từ khi hạ giọt treo

53
a b
c d
e f
Hình 42: Khối spheroid MCF7 trong 25 ngày quan sát kể từ khi hạ giọt treo
(hình ảnh tại các thời điểm 5 (a), 9 (b), 13 (c), 17 (d), 21 (e) và 25 (f) ngày (400x)

Khả năng chống ung thư của các hoạt chất phân lập từ cây vông nem - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620

Khả năng chống ung thư của các hoạt chất phân lập từ cây vông nem - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Khả năng chống ung thư của các hoạt chất phân lập từ cây vông nem - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620

Similar to Khả năng chống ung thư của các hoạt chất phân lập từ cây vông nem - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620 (20)

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Khả năng chống ung thư của các hoạt chất phân lập từ cây vông nem - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620