Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Hà Tú Trâm
NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI
γ-AMYLASE VI SINH VẬT DẠNG HÒA TAN
VÀ DẠNG CỐ ĐỊNH
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh – 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Hà Tú Trâm
NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI
γ-AMYLASE VI SINH VẬT DẠNG HÒA TAN
VÀ DẠNG CỐ ĐỊNH
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PSG.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU
Thành phố Hồ Chí Minh - 2012

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin trân trọng bày tỏ lời cám ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến
PGS. TS Đồng Thị Thanh Thu, người đã khơi gợi đề tài cũng như đã tận tình
hướng dẫn khoa học, luôn quan tâm và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá
trình thực hiện luận văn này.
Xin ghi nhớ công ơn các Thầy Cô Khoa Sinh học, các Thầy Cô Phòng Sau
Đại học Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt
kiến thức quý báu cho học viên chúng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu
tại trường.
Xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô thuộc bộ môn Sinh hóa
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt
nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu và các đồng nghiệp Trường THPT
Chuyên Lê Hồng Phong, quận 5, Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua. Đặc biệt tôi trân trọng bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc đến Thầy Trần Ngọc Danh và Thầy Lê Văn Thanh đã luôn quan
tâm, động viên và trợ giúp cho tôi trong thời gian theo học lên thạc sĩ.
Xin được gửi lời cảm ơn đến các bạn Lê Hồng Phú, Phan Thị Phương Dung,
Trần Quốc Tuấn, em Trương Thị Quỳnh Trâm, Trần Thị Ngọc Diệp đã cùng chia sẻ
kiến thức, kinh nghiệm cũng như giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đến ba mẹ, những người
đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ và luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con
trong cuộc sống. Xin được gửi lời tri ân đến những người thân yêu trong gia đình
luôn hỗ trợ, động viên tôi trong học tập và nghiên cứu.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2012
Hà Tú Trâm

i
MỤC LỤC
PHẦN MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................4
1.1. Đặc điểm giống mốc Aspergillus và Asp. niger....................................................4
1.1.1. Vị trí phân loại Asp. niger [7]..........................................................................4
1.1.2. Đặc tính sinh học và dinh dưỡng Asp. niger [12]............................................4
1.1.2.1. Đặc tính sinh học của Asp. niger [12]......................................................4
1.1.2.1. Đặc tính dinh dưỡng của Asp. niger [12] .................................................5
1.1.3. Ứng dụng của nấm mốc Asp. niger [18]..........................................................6
1.2. Đặc điểm nấm men Sac. cerevisiae [14]...............................................................6
1.2.1. Đặc điểm nấm men ..........................................................................................6
1.2.1.1. Vị trí phân loại Sac. cerevisiae [14].........................................................6
1.2.1.2. Đặc tính sinh học và dinh dưỡng Sac. cerevisiae [14] [20] .....................6
1.2.2. Các ứng dụng của nấm men Sac. cerevisiae [14]............................................7
1.3. Sơ lược về enzyme và γ-amylase ..........................................................................7
1.3.1. Giới thiệu về enzyme.......................................................................................7
1.3.1.1.Khái niệm chung về E[11][2]....................................................................8
1.3.1.2. Nguồn nguyên liệu thu nhận E.................................................................8
1.3.1.3. Phương pháp thu nhận E [17]...................................................................9
1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp E của vi sinh vật [20]....10
1.3.2. Giới thiệu về γ-amylase [37][13]...................................................................11
1.3.2.1. Cấu trúc γ-amylase [37] .........................................................................11
1.3.2.2. Đặc tính [30]...........................................................................................12
1.3.2.3. Nguồn nguyên liệu thu nhận [35][39]....................................................13
1.4. Enzyme cố định (immobilized enzyme).............................................................13
1.4.1. Khái quát sự cố định E [19]...........................................................................13
1.4.2. Vật liệu cố định enzyme [19].........................................................................13
1.4.2.1. Vật liệu vô cơ [16][5].............................................................................13

ii
1.4.2.2. Vật liệu hữu cơ [19][21].........................................................................13
1.4.3. Một số phương pháp chủ yếu tạo Ecđ [19][22][25] .......................................14
1.4.3.1. Phương pháp vật lí [19][4] .....................................................................15
1.4.3.2. Phương pháp hóa học [19][24]...............................................................15
1.4.3.3. Phương pháp nhốt enzyme trong khuôn gel [19]...................................15
1.4.3.4. Phương pháp microcapsule (phương pháp tạo vi túi) [19].....................16
1.4.3.5. Phương pháp siêu lọc [19]......................................................................16
1.4.4. Lựa chọn phương pháp cố định .....................................................................17
1.4.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định E [19]............................................17
1.4.5.1. Ảnh hưởng của chất mang [19]..............................................................17
1.4.5.2. Ảnh hưởng của pH [19]..........................................................................18
1.4.6. Ứng dụng Ecđ và các thành tựu nghiên cứu về Ecđ [23][27][28][29]............18
1.4.6.1 Ứng dụng trong y học [19]......................................................................18
1.4.6.2. Ứng dụng trong kỹ thuật sinh hóa [19][36]............................................19
1.4.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp [19]..........................................................19
1.4.6.4. Ứng dụng trong bảo vệ môi trường [19] ................................................20
trước khi đưa ra môi trường bên ngoài...............................................................20
1.5. Sự thủy phân tinh bột và ứng dụng sản phẩm sau thủy phân........................20
1.5.1. Đại cương về tinh bột [31].............................................................................20
1.5.2. Đặc tính tinh bột sắn và tinh bột bắp [1][10].................................................22
1.5.2.1. Đặc tính tinh bột sắn [1][10] ..................................................................22
1.5.2.2. Đặc tính tinh bột bắp [14][31]................................................................22
1.5.3. Các phương pháp thủy phân tinh bột [1][10] ................................................23
1.5.3.1. Thủy phân tinh bột bằng acid [10][32]...................................................23
1.5.3.2. Thủy phân tinh bột bằng enzyme [11][33].............................................23
1.5.4. Các sản phẩm thủy phân tinh bột và ứng dụng [14]......................................24
PHẦN 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............26
2.1. Nguyên vật liệu ....................................................................................................26
2.1.1. Nguyên liệu....................................................................................................26

iii
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ....................................................................26
2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................26
2.2.1. Phương pháp giữ giống Asp. niger [20].........................................................26
2.2.2. Quan sát các đặc điểm hình thái của chủng giống Asp. niger [12][20].........27
2.2.2.1. Quan sát đại thể [12][20]........................................................................27
2.2.2.2. Quan sát vi thể bằng kĩ thuật làm phòng ẩm[20] ...................................27
2.2.3. Phương pháp định lượng mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu
[9][12][20]....................................................................................................................28
2.2.4. Phương pháp khảo sát thời gian nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi cấy
Asp. niger thu γ – amylase [8]......................................................................................29
2.2.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp γ – amylase từ Asp. niger
[3][7][9]........................................................................................................................30
2.2.5.1. Thời gian nuôi cấy..................................................................................30
2.2.5.2. Thành phần môi trường thay đổi............................................................30
2.2.6. Phương pháp thu nhận γ – amylase từ Asp. niger [9][14][25] ......................30
2.2.7. Xác định hoạt độ γ – amylase theo phương pháp so màu với DNS [9].........31
2.2.7.1. Nguyên tắc..............................................................................................31
2.2.7.2. Cách tính.................................................................................................31
2.2.8. Định lượng protein hòa tan trong CPE theo phương pháp Lowry [12][26]..31
2.2.8.1. Nguyên tắc..............................................................................................31
2.2.8.2. Hóa chất..................................................................................................32
2.2.8.3. Cách tiến hành........................................................................................32
2.2.8.4. Cách tính.................................................................................................32
2.2.9. Xác định hoạt độ riêng của các chế phẩm enzyme [9] ..................................33
2.2.10. Lựa chọn phương pháp cố định γ-amylase [9][19]......................................33
2.2.10.1. Cố định γ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị
......................................................................................................................................33
2.2.10.2. Cố định γ-amylase lên chất mang là Celite (Diatomite) bằng phương
pháp hấp phụ [14].........................................................................................................34

iv
2.2.11. Phương pháp sử dụng γ-amylasecđ từ Asp. niger và thương mại để thủy
phân các loại tinh bột [12][15].....................................................................................35
2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng tái sử dụng của CPE γ-amylasecđ ............35
2.2.13. Ứng dụng sản phẩm sau thủy phân tinh bột để lên men thu sinh khối nấm
men [6], [9], [12]..........................................................................................................36
2.2.13.1. Thu nhận và định lượng glucose tạo thành trong dung dịch sau thủy
phân tinh bột.................................................................................................................36
2.2.13.2. Lên men thu sinh khối giàu protein......................................................36
2.2.14. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm [12] ..............................................37
2.2.14.1. Xác định giá trị trung bình ...................................................................37
2.2.14.2. Tính toán độ lệch mẫu và độ lệch chuẩn..............................................37
2.2.15. Phương pháp xây dựng đường chuẩn và hệ số góc a dựa trên phần mềm
excel [4]........................................................................................................................38
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.....................................................................39
3.1. Bảo quản giống và định danh nấm mốc Asp. niger..........................................39
3.2. Kết quả quan sát đại thể và vi thể chủng giống Asp. niger..............................39
3.3. Định lượng mật độ bào tử trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.....................40
3.4. Xác định hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo phương pháp so
màu DNS .....................................................................................................................40
3.4.1. Hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo sự thay đổi thành phần
môi trường....................................................................................................................40
3.4.1.1. Ảnh hưởng thành phần môi trường khi cơ chất cảm ứng là bột bắp......41
3.4.1.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường khi cơ chất cảm ứng là bột năng....42
3.4.2. Hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo thời gian nuôi cấy .........43
3.5. Nuôi cấy nấm mốc theo điều kiện tối ưu tuyển chọn về thời gian và thành
phần môi trường chất cảm ứng.................................................................................44
3.6. Thu nhận CPE γ-amylase từ môi trường Asp. niger trên môi trường bán rắn
(trong điều kiện tối ưu trên)......................................................................................45
3.7. Hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger........45

v
3.7.1. Hàm lượng protein trong CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger
......................................................................................................................................46
3.7.2. Hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger........46
3.8. Sử dụng CPE γ-amylase hòa tan từ canh trường Asp. niger để thủy phân các
loại tinh bột khác nhau ..............................................................................................46
3.9. Xác định hoạt độ riêng γ-amylase thương mại Dextrozyme theo phương
pháp so màu DNS.......................................................................................................49
3.9.1. Xác định hoạt độ chung CPE - TM theo phương pháp so màu DNS............49
3.9.2. Xác định hàm lượng protein của CPE - TM theo phương pháp Lowry........50
3.9.3. Xác định hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thương mại...............................50
3.10. Sử dụng CPE γ-amylase thương mại Dextrozyme GA để thủy phân các loại
tinh bột khác nhau .....................................................................................................51
3.10.1. Sử dụng CPE γ-amylase – TM để thủy phân tinh bột tan ...........................51
3.10.2 Sử dụng CPE γ-amylase – TM để thủy phân bột năng.................................52
3.11. Cố định CPE γ-amylase từ Asp. niger lên chất mang là diatomite bằng
phương pháp hấp phụ và lên chất mang là chitosan bằng phương pháp cộng hóa
trị..................................................................................................................................53
3.11.1. Hiệu suất gắn protein lên các chất mang .....................................................53
3.11.2. Hiệu suất cố định hoạt độ CPE γ-amylase...................................................54
3.12. Cố định CPE γ-amylase thương mại lên chất mang là diatomite bằng
phương pháp hấp thụ và lên chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị ...............55
3.12.1. Hiệu suất gắn protein lên các chất mang .....................................................55
3.12.2. Hiệu suất cố định hoạt độ CPE γ-amylase thương mại ...............................56
3.13. Sử dụng CPE γ-amylase cố định để thủy phân các loại tinh bột khác nhau
......................................................................................................................................56
3.13.1. Sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định để thủy phân các loại tinh bột
khác nhau......................................................................................................................56
3.13.2. Sử dụng CPE γ-amylase thương mại cố định để thủy phân các loại tinh bột
khác nhau......................................................................................................................60

vi
3.14. Khảo sát khả năng tái sử dụng CPE γ-amylase cố định................................63
3.14.1. Khảo sát khả năng tái sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định.........63
3.14.2. Khảo sát khả năng tái sử dụng CPE γ-amylase cố định thương mại...........66
3.15. Kết quả ứng dụng sản phẩm sau thủy phân tinh bột để lên men thu sinh
khối giàu protein ........................................................................................................68
3.15.1. Kết quả sử dụng CPEcđ từ Asp. niger và thương mại thủy phân bột năng tạo
dung dịch đường...........................................................................................................68
3.15.2. Kết quả thu nhận sinh khối nấm men giàu protein từ dung dịch thủy phân
tinh bột..........................................................................................................................70
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................71
4.1. Kết luận................................................................................................................71
4.1.1. Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho nấm mốc Asp.niger sinh tổng hợp
enzyme γ- amylase có hoạt tính cao là:........................................................................71
4.1.2. Thu nhận CPE γ-amylase từ môi trường nuôi cấy Aspergillus niger............71
4.1.3. Hoạt độ CPE γ-amylase – TM......................................................................71
4.1.4. Xác định nồng độ glucose tạo thành khi thủy phân một số loại tinh bột bởi
CPE γ- amylase TM và từ Asp. niger hòa tan.............................................................72
4.1.4.1. CPE từ Asp. niger...................................................................................72
4.1.4.2. CPE thương mại .....................................................................................72
4.1.5. Hiệu suất cố định CPE γ- amylase từ Asp. niger và TM trên một số chất
mang.............................................................................................................................72
4.1.5.1. CPE từ Asp. niger...................................................................................72
4.1.5.2. CPE thương mại .....................................................................................72
4.1.6. Xác định nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột bởi
CPE γ- amylase từ Asp. niger và TM cố định trên một số chất mang ........................73
4.1.6.1. Thủy phân các loại tinh bột bởi CPEcđ từ Asp. niger.............................73
4.1.6.2. Thủy phân các loại tinh bột bởi CPEcđ TM............................................73
4.1.7. Xác định khả năng tái sử dụng của chế phẩm enzyme γ- amylase từ Asp.
niger và TM để thủy phân bột năng............................................................................73

vii
4.1.7.1. CPE từ Asp. niger...................................................................................73
4.1.7.2. CPE thương mại .....................................................................................74
4.1.8. Kết quả sử dụng CPEcđ từ Asp. niger thủy phân bột năng tạo glucose .........74
4.1.8.1. CPEcđ từ Asp. niger ................................................................................74
4.1.8.2. CPEcđ TM...............................................................................................74
4.1.9. Kết quả thu nhận sinh khối nấm men giàu protein từ dịch thủy phân bột năng
bởi CPE γ- amylase thương mại và từ Asp. niger........................................................74
4.2. Đề nghị..................................................................................................................75
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................71
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................72
PHẦN 5: PHỤ LỤC ...................................................................................................77

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CT : Canh trường
CPE : Chế phẩm enzyme
CPEht : Chế phẩm enzyme hòa tan
CPEcđ : Chế phẩm enzyme cố định
CPE – TM : Chế phẩm enzyme thương mại
DNS : 3,5 – dinitrosalicylic axit
dd : dung dịch
E : Enzyme
Ecđ : Enzyme cố định
HL : Hàm lượng
HS : Hiệu suất
pHopt : pH tối ưu
Pr : Protein
OD : Giá trị mật độ quang
OD0 : Giá trị mật độ quang mẫu đối chứng
ODT : Giá trị mật độ quang mẫu thật
ODTB : Giá trị mật độ quang trung bình
topt : Nhiệt độ tối ưu
TN : Thí nghiệm

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Tương quan giữa mật độ quang OD và mật độ bào tử................................. 40
Bảng 3.2: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là
bột bắp ......................................................................................................... 41
Bảng 3.3: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là
bột năng ....................................................................................................... 42
Bảng 3.4: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger theo thời gian nuôi cấy.. 44
Bảng 3.5: Hoạt độ chung của CPE γ-amylase từ canh trường Asp. niger .................... 45
Bảng 3.6: Hiệu suất thu nhận CPE γ-amylase từ canh trường Asp. niger ................... 45
Bảng 3.7: Hàm lượng protein trong CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp.
niger............................................................................................................. 46
Bảng 3.8: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng
CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan.................................................. 47
Bảng 3.9: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng CPE
γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan.......................................................... 48
Bảng 3.10: Hoạt độ chung của CPE γ-amylase - TM .................................................. 49
Bảng 3.11: Hàm lượng Protein trong CPE γ-amylase - TM......................................... 50
Bảng 3.12: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng
CPE γ-amylase - TM dạng hòa tan.............................................................. 51
Bảng 3.13: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng
CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan ............................................................. 52
Bảng 3.14: Lượng protein CPE γ-amylase cố định và hiệu suất gắn γ-amylase lên
diatomite và chitosan................................................................................... 54
Bảng 3.15: Tổng đơn vị hoạt độ γ-amylase cố định và hiệu suất hoạt độ γ-amylase cố
định .............................................................................................................. 54
Bảng 3.16: Lượng protein CPE γ-amylase – TM cố định và hiệu suất gắn cố định
protein γ-amylase lên diatomite và chitosan................................................ 55

Bảng 3.17: Tổng đơn vị hoạt độ γ-amylase - TM cố định và hiệu suất cố định γ-
amylase ........................................................................................................ 56
Bảng 3.18: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột
khác nhau bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng cố định trên chất mang
chitosan........................................................................................................ 57
khác nhau bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng cố định trên chất mang
diatomite ...................................................................................................... 58
khác nhau bằng CPE γ-amylase - TM cố định trên chất mang chitosan ..... 60
khác nhau bằng CPE γ-amylase - TM cố định trên chất mang diatomite ... 62
Bảng 3.22: Hiệu suất sử dụng CPE từ Asp. niger cố định trên chitosan....................... 63
Bảng 3.23: Hiệu suất sử dụng CPE từ Asp. niger cố định trên diatomite..................... 64
Bảng 3.24: Hiệu suất sử dụng CPEcđ_chitosan thương mại ........................................ 66
Bảng 3.25: Hiệu suất sử dụng CPEcđ_diatomite thương mại ....................................... 67
Bảng 3.26: Kết quả sử dụng CPEcđ từ Asp. niger và thương mại thủy phân bột năng
tạo glucose .................................................................................................. 69
Bảng 3.27: Kết quả thu nhận sinh khối nấm men giàu protein .................................... 70

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1: Cấu trúc không gian γ-amylase .................................................................... 12
Hình 1.2: Quá trình thủy phân tinh bột của các enzyme amylase ................................ 12
Hình 1.3: Cấu tạo tinh bột............................................................................................. 21
Hình 1.4: Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi E vi sinh vật .................................... 24
Hình 1.5: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất sinh khối nấm men ............................. 25
Hình 3.1: Mặt trước của khuẩn lạc Asp. niger .............................................................. 39
Hình 3.2: Mặt sau của khuẩn lạc Asp. niger ................................................................. 39
Hình 3.3: Khuẩn ty của Asp. niger................................................................................ 39
Hình 3.4: Hệ bào tử đính của Asp. niger....................................................................... 39

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Trang
Đồ thị 3.1: Tương quan giữa mật độ OD và mật độ bào tử .......................................... 40
Đồ thị 3.2: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng
Đồ thị 3.3: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng
Đồ thị 3.4: So sánh nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột
tan và bột năng bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan............... 49
Đồ thị 3.5: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng
Đồ thị 3.6: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng
Đồ thị 3.7: So sánh nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột
tan và bột năng bằng CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan........................... 53
Đồ thị 3.8: Hiệu suất sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên chitosan và
trên diatomite............................................................................................... 65
Đồ thị 3.9: Hiệu suất sử dụng CPE γ-amylase – TM cố định trên chitosan và trên
diatomite ...................................................................................................... 68

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là
bột bắp ....................................................................................................... 41
Biểu đồ 3.2: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là
bột năng .................................................................................................... 42
Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của hai loại môi trường nuôi cấy nấm mốc Asp. niger đến
hoạt độ γ-amylase...................................................................................... 43
Biểu đồ 3.4: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger theo thời gian nuôi cấy44
Biểu đồ 3.5: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột
bởi CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên chitosan............................ 57
bởi CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên diatomite .......................... 59
bằng CPE γ-amylase thương mại cố định trên chitosan............................ 61
bằng CPE γ-amylase thương mại cố định trên diatomite.......................... 62
Biểu đồ 3.9: Khả năng tái sử dụng CPEcđ_chitosan từ canh trường Asp. niger ........... 64
Biểu đồ 3.10: Khả năng tái sử dụng CPEcđ_diatomite từ canh trường Asp. niger ....... 65
Biểu đồ 3.11: Khả năng tái sử dụng CPEcđ_chitosan thương mại................................ 66
Biểu đồ 3.12: Khả năng tái sử dụng CPEcđ_diatomite thương mại.............................. 67
Biểu đồ 3.13: Kết quả sử dụng CPEcđ từ Asp .niger và TM thủy phân bột năng tạo
glucose....................................................................................................... 67

1
PHẦN MỞ ĐẦU
Enzyme (E) là một loại chất xúc tác sinh học, hiện nay E được sử dụng rộng
rãi trong nhiều quy trình công nghệ sản xuất công nghiệp như: công nghệ thực
phẩm, y học, dược phẩm, sản xuất thức ăn gia súc và bảo vệ thực vật, xử lý môi
trường,…Việc ứng dụng E đã trở thành một trong những chiến lược quan trọng nhất
nhằm đưa ra những quy trình phản ứng hóa học thân thiện với môi trường, đồng thời
giúp tiết kiệm nguyên liệu và năng lượng.
E có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật và
vi sinh vật. Trong đó, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều đặc tính ưu việt hơn
enzyme từ động vật hay thực vật.
Mặc dù E được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực vì có nhiều đặc tính
ưu việt, nhưng trên thực tế sản xuất, việc sử dụng E vẫn còn những giới hạn nhất
định. Bên cạnh chi phí cao cho việc tách chiết và tinh sạch E, khó khăn lớn nhất là
tính kém bền vững và độ nhạy với nhiệt độ, pH,… của chúng, nên hiệu quả sử dụng
không cao. Vì vậy mà E có thời gian tồn tại ngắn, chi phí cao cho việc tách E ra
khỏi sản phẩm phản ứng và việc phục hồi các trung tâm hoạt động để tái sử dụng
gặp nhiều khó khăn.
Một trong những kỹ thuật thông dụng và hiệu quả nhất để khắc phục những
mặt hạn chế trên là sự cố định E. Kỹ thuật này giúp cố định cấu trúc không gian mà
không làm giảm hoạt lực của E. Từ đó tạo nhiều chế phẩm E không hòa tan có khả
năng tái sử dụng nhiều lần, phục vụ cho từng mục đích sản xuất cụ thể, đặc biệt
thích hợp cho các quá trình tự động hóa trong sản xuất liên tục. Nhìn chung, kỹ
thuật cố định E chắc chắn đã và đang là một hướng phát triển đầy tiềm năng của
ngành công nghệ E.
Trong các E có nhiều ứng dụng thực tiễn của lĩnh vực công nghệ thực phẩm
là hệ enzyme amylase. Đề tài của chúng tôi nhằm nghiên cứu tạo ra chế phẩm γ –

2
amylase cố định thủy phân tinh bột tạo sản phẩm là α-glucose có giá trị cao. γ –
amylase có khả năng cắt các loại liên kết 1, 4 hay 1, 6 – O – glycoside, khả năng
thủy phân triệt để tạo sản phẩm cuối cùng chủ yếu là glucose và sau phản ứng có thể
dễ dàng tách E ra khỏi sản phẩm.
Nhìn chung, qua nhiều nghiên cứu ứng dụng các Ecđ trong sản xuất ở trong
và ngoài nước đó đã mở ra một câu hỏi, liệu rằng chế phẩm γ – amylase cố định có
thể trở thành một trong những nguồn chế phẩm E đầy tiềm năng cho ngành công
nghiệp sản xuất α – glucose từ nguyên liệu tinh bột không?
Do đó, để góp phần đánh giá thêm tiềm năng ứng dụng này của enzyme cố
định, chúng tôi xin được tiến hành đề tài “Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi
γ-amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định” với các nhiệm vụ cụ thể như
sau:
- Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy nấm mốc Asp. niger để thu γ – amylase có
hoạt tính cao.
- Sử dụng một phương pháp mới trong kỹ thuật sử dụng E đó là phương
pháp cố định E.
- Cố định γ – amylase trên chất mang vô cơ diatomite và chất mang hữu cơ
chitosan.
- Xác định hoạt độ các loại enzyme:
 γ - amylase hòa tan từ Asp. niger.
 γ – amylase hòa tan thương mại.
 γ – amylase cố định từ Asp. niger và thương mại.
- Nghiên cứu sự thủy phân một số loại tinh bột của các loại enzyme hòa tan và
cố định.

3
- So sánh hiệu quả sự thủy phân tinh bột bởi ba loại enzyme trên.
- Chứng minh hiệu quả sử dụng Ecđ qua sự tái sử dụng trong thủy phân tinh bột.
- Bước đầu tạo sinh khối nấm men trên dung dịch đường sau thủy phân.

Phaàn 1
Toång quan
taøi lieäu

4
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm giống mốc Aspergillus và Asp. niger
Từ lâu nấm mốc Aspergillus đã được dùng phổ biến trong sản xuất tương,
chao, nước chấm,…hay được dùng để đường hóa các nguồn nguyên liệu tinh bột
trong sản xuất rượu, sản xuất sinh khối,… Trong đó, một số nấm mốc đường hóa
thường dùng như: Asp. oryzae, Asp. niger, Asp. awamori, Asp. usamii,…
Giống mốc Aspergillus có hệ sợi nấm không màu hoặc vàng nhạt. Sợi nấm
phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào. Tế bào có hạch nhân. Cuống đính bào tử
không phân nhánh dài và thẳng, đầu có cuống nhỏ. Tất cả cuống nhỏ có hình chai, khi
trưởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống. Những chuỗi đính bào tử xếp đối
xứng tỏa tròn trên chóp nang giống đóa hoa cúc.
1.1.1. Vị trí phân loại Asp. niger [7]
Giới: Eumycophyta (Nấm) – Ngành: Ascomycota – Lớp: Eurotiomycetes –
Bộ: Eurotiales – Họ: Eurotia – Chi: Aspergillus – Loài: Aspergillus niger
1.1.2. Đặc tính sinh học và dinh dưỡng Asp. niger [12]
1.1.2.1. Đặc tính sinh học của Asp. niger [12]
Asp. niger thường gọi là mốc đen. Sợi nấm đa bào có vách ngăn, phân nhánh,
không màu, một số trường hợp trở nên nâu hay sẫm màu. Cuống sinh thể bình phình
ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu 20-30 µm, màu nâu đen. Thể bình gồm 2
lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai. Thể bình mang bào
tử bụi phồng lên ở ngọn, các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng.
Trên môi trường nuôi cấy thích hợp, Asp. niger cho khuẩn lạc với vô số bào tử
đính màu trắng, khi trưởng thành chuyển sang màu đen. Bào tử có hình cầu, kích
thước khoảng 4,0-5,0μm, xù xì không đều với những gờ rõ. Mặt trái khuẩn lạc màu
vàng nhạt, khi trưởng thành có thể tạo đường rãnh phóng xạ trên bề mặt thạch.

5
Nấm mốc Aspergillus nói chung và Asp. niger nói riêng có mặt khắp nơi trong
tự nhiên do có khả năng phân giải nhiều nguồn cơ chất khác nhau nhờ hệ enzyme
phong phú như amylase, invertase, pectinase, maltase, gluco-oxydase,…
1.1.2.1. Đặc tính dinh dưỡng của Asp. niger [12]
* Nguồn carbon
A.niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đường monosaccharide, disaccharide
như glucose, fructose, maltose, sucrose, hay polysaccharide như tinh bột,...
* Nguồn nitrogen
Khi sử dụng nguồn nitrogen từ NaNO3 và NH4NO3 để bổ sung vào môi trường
nuôi cấy bán rắn thì hoạt tính γ-amylase của nấm mốc cũng tăng đáng kể.
* Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của
A.niger. Chúng sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6-80
C và tối đa là 45-470
C, tối
ưu ở 28-350
C.
* Độ pH
Khoảng pH mà A.niger sinh trưởng tốt là ở môi trường hơi acid pH= 3,5- 5,5.
Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid,
trung tính hay kiềm. Aspergillus sp. tổng hợp amylase cao nhất ở pH môi trường từ
4,8 – 5,0.
* Chất cảm ứng
Trong các môi trường nuôi cấy Asp. niger sinh tổng hợp amylase, người ta đều
bổ sung thêm cơ chất chứa nguồn cacbon như tinh bột, dextrin, maltose nhằm kích
thích khả năng sinh amylase của nấm mốc.
* Ngoài ra, cần bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy nấm mốc một số chất
vô cơ khác như MnSO4 0.05%, KH2PO4 1%, KCl 0.05% và độ ẩm môi trường khoảng
50-55% là thích hợp nhất cho mốc phát triển tốt.

6
1.1.2. Ứng dụng của nấm mốc Asp. niger [18]
Từ lâu, con người đã biết sử dụng A.niger để sản xuất acid hữu cơ. Đặc biệt
Asp. niger có khả năng tổng hợp acid citric rất mạnh, lượng acid citric sử dụng trên
thị trường hiện nay được sản xuất bằng phương pháp lên men tới 90%.
Ngoài ra, Aspergillus niger là chủng nấm mốc được sử dụng khá phổ biến trong
công nghệ sản xuất E. Tùy điều kiện nuôi cấy mà chủng nấm mốc này có thể sinh ra
các loại E như: amylase, invertase, maltase, protease, pectinase và cellulase,…
Aspergillus niger được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học để sản xuất
phụ gia thực phẩm, các enzyme dùng trong công nghiệp và dược phẩm, cũng như có
tiềm năng ứng dụng phân hủy sinh học.
1.2. Đặc điểm nấm men Sac. cerevisiae [14]
1.2.1. Đặc điểm nấm men
Nấm men luôn được xem là một trong những nhóm vi sinh vật gần gũi với con
người. Tế bào nấm men rất giàu protein – được coi là nguồn protein đơn bào rất quý
giá, là nguồn dinh dưỡng gián tiếp qua chăn nuôi tới con người. Ngoài ra, các sản
phẩm lên men từ nấm men như rượu, bia và các dạng đồ uống có cồn khác cũng rất
được ưa chuộng.
1.2.1.1. Vị trí phân loại Sac. cerevisiae [14]
Giới: Eumycophyta (Nấm) – Ngành: Ascomycota – Lớp: Ascomycetes – Bộ:
Endomycetes – Họ: Saccharomycetaceae – Chi: Saccharomyces – Loài:
Saccharomyces cerevisiae.
1.2.1.2. Đặc tính sinh học và dinh dưỡng Sac. cerevisiae [14] [20]
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, hô hấp tùy tiện,
sinh sản bằng cách nảy chồi, dị dưỡng bằng các hydratcarbon, trước hết là đường.
Kích thước tế bào nấm men khoảng 8 - 15 μm, có hình thái đa dạng và cấu tạo
gồm: vỏ (hoặc thành), màng, tế bào chất, nhân, một hoặc 2 không bào và những giọt

7
mỡ, hạt glycogen. Ở một số nấm men, vỏ tế bào có khả năng kết dính giúp gắn kết các
tế bào với nhau, có ý nghĩa lớn trong sản xuất cồn vì thuận tiện cho quá trình lọc dịch
lên men và thu hồi chủng giống để tái sử dụng.
Trong giống Saccharomyses, quan trọng nhất là loài Sac. cerevisiae được dùng
nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Thành phần chất khô của tế bào nấm men có
nhiều chất dinh dưỡng có giá trị như: protein và các chất có nitơ khác chiếm 50% ,
chất béo 1,6%, hydratcarbon 33,2%, mô tế bào 7,6%, tro 7,6%. Nấm men được chú ý
nhiều, vì không những trong tế bào của chúng có nhiều chất dinh dưỡng có giá trị mà
chúng còn có khả năng tăng sinh khối và các đặc điểm sinh lý phù hợp với điều kiện
sản xuất công nghiệp [14]
Trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối, ngoài glucid từ 5-7% và chất khoáng
thường có đủ sẵn trong môi trường cũng cần bổ sung thêm nguồn Nitơ từ ure hay
amonsunfat với lượng từ 0.15-0.2g/lít canh trường. Nếu thiếu nitơ nấm men sẽ phát
triển chậm, thời gian lên men kéo dài, hiệu suất lên men giảm. Ngoài ra, có thể bổ
sung thêm nguồn phospho là diamonphosphate, nguồn K từ KCl, nguồn Mg –
MgSO4, nguồn chất sinh trưởng như cao ngô, cao nấm men,…Các thành phần môi
trường được hòa tan, lọc bỏ cặn, điều chỉnh pH tới 4,8 – 5,2 bằng HCl hay H2SO4
[14]
1.2.2. Các ứng dụng của nấm men Sac. cerevisiae [14]
Hiện nay, việc ứng dụng kỹ thuật di truyền trong lĩnh vực nghiên cứu nấm men
đã tạo ra nhiều chủng, giống mới mang đặc tính ưu việt như: tuyển chọn các chủng
nấm men bia có khả năng kết lắng cao, tạo chủng nấm men mới có hoạt tính phân giải
β-glucan cao, hay tạo một chủng nấm men có hoạt tính cellulase cao nhờ việc chuyển
một gene cellulase từ Trichoderma recset vào Saccaromyces,…Từ đó, những chủng
nấm men mới với những đặc tính ưu việt này được ứng dụng hiệu quả vào ngành
công nghệ thực phẩm.
1.3. Sơ lược về enzyme và γ-amylase
1.3.1. Giới thiệu về enzyme

8
1.3.1.1.Khái niệm chung về E[11][2]
E là chất xúc tác sinh học có khả năng xúc tác với độ đặc hiệu cơ chất rất cao,
có bản chất là protein. Sự có mặt của E trong các phản ứng hóa học sẽ làm giảm năng
lượng hoạt hóa của phản ứng, làm tăng nhanh tốc độ phản ứng để đạt đến cân bằng
phản ứng.
1.3.1.2. Nguồn nguyên liệu thu nhận E
E có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau
a/ Nguồn động vật [11]
Đây là nguồn E được phát hiện và thu nhận sớm nhất. Người ta đã thu nhận từ
tụy tạng, màng nhầy dạ dày heo, dạ dày bê, gan, mật,…nhiều loại E như: trypsin,
pepsin, rennin, ribonuclease, amylase,…
b/ Nguồn gốc thực vật [11]
Một số loại E được thu nhận từ thực vật như: Urease từ cây đậu rựa (Canavalin
ensifirmis), bromelin từ cây họ dứa (Bromalaceae), papain từ nhựa đu đủ (Carica
Papaya. L), hệ E β-amylase từ hạt ngũ cốc và một số loại củ chứa tinh bột nảy mầm.
c/ Nguồn vi sinh vật [17]
Đây là nguồn E phong phú nhất, có ở hầu hết các loài vi sinh vật như: nấm
mốc, vi khuẩn, và một số loại nấm men. Người ta có thể phân lập các giống vi sinh
vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ
tổng hợp ưu thế một loại E nhất định cần thiết nào đó.
So với việc thu nhận E từ các nguồn động vật, thực vật thì vi sinh vật vẫn là
nguồn thích hợp nhất để sản xuất E ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống
vì những lợi ích chính sau:
- Chủ động về nguồn giống và nguyên liệu nuôi cấy.
- Có chu kỳ sinh trưởng ngắn nên có thể thu hoạch nhiều lần quanh năm.

9
- Có thể chủ động điều khiển sinh tổng hợp E dễ dàng theo định hướng sử
dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi.
- Hiệu quả kinh tế cao hơn.
1.3.1.3. Phương pháp thu nhận E [17]
Các chế phẩm E được sử dụng ở các dạng khác nhau theo mức độ tinh khiết.
Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa E được sử dụng
trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất như rượu, nước chấm,…Với những
nghiên cứu khoa học, y học,… lại cần sử dụng chế phẩm E tinh khiết để xác định khối
lượng phân tử, cấu trúc E và chữa bệnh.
a/ Thu dịch E [17]
Đối với các loại E nội bào, phải nghiền nát tế bào bằng nhiều cách như nghiền
với cát, nghiền với vụn thủy tinh, tạo áp suất thẩm thấu cao từ muối, dung môi hữu
cơ,…hay kết tủa E bằng các chất điện ly thích hợp.
Đối với trường hợp E ngoại bào, có thể tách sinh khối và cặn bã khỏi canh
trường bằng cách lọc li tâm, lọc ép có sử dụng tác nhân trợ kết tủa,…
b/ Thu nhận chế phẩm E thô [11] [17]
Chế phẩm E thô là chế phẩm E chưa được tinh chế có nồng độ chất khô thấp 4-
6g/l, có thể chứa một vài loại E chủ yếu, một số loại protein không phải E, các chất ổn
định và các tạp chất khác.
Sau khi thu dịch E từ canh trường nuôi cấy, bước đầu cô đặc chân không ở
nhiệt độ 40-450
C để đạt nồng độ chất khô 30-35g/l. Tiếp theo bổ sung thêm chất bảo
quản như NaCl, glycerin, benzoat,…rồi sấy phun ở 1200
C sẽ thu được chế phẩm E
dạng bột. Cũng có thể kết tủa E từ dung dịch sau cô đặc bằng các dung môi thích hợp
như aceton, ethanol, …Sau khi li tâm tách kết tủa có thể trộn thêm các chất ổn định
rồi sấy khô và nghiền mịn để thu được chế phẩm dạng bột.
c/ Thu chế phẩm E tinh khiết [11] [17]

10
E tinh khiết có hoạt độ chung và hoạt độ riêng cao hơn nhiều so với chế phẩm
ban đầu, nhưng quy trình làm sạch rất phức tạp, công phu và tốn kém. Việc tinh chế E
có thể tiến hành bằng nhiều phương pháp qua nhiều giai đoạn:
- Hòa tan chế phẩm E thô vào nước hay dung dịch muối,…kết tủa trở lại
bằng ethanol, aceton hay (NH4)2SO4 rồi dùng phương pháp thẩm tích, thẩm
thấu ngược hay lọc gel để loại các muối vô cơ.
- Tách E bằng phương pháp hấp phụ chọn lọc: cho dịch E chảy từ từ qua cột
chất hấp phụ (thường là hydrat oxit-nhôm, silicagel), các E khác nhau sẽ
được hấp phụ với khả năng khác nhau, sau đó dùng các dung dịch đệm
thích hợp để chiết rút E ra khỏi cột.
- Tách E bằng phương pháp trao đổi ion: dựa vào sự trao đổi ion giữa E có
điện tích với các ion cùng dấu của nhựa (các dẫn xuất cellulose, …). Dùng
dung dịch chất điện giải đẩy khỏi nhựa các E vừa liên kết với chúng. Như
vậy, các E khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác
nhau, trong đó phần chiết chứa E cần thu với nồng độ cao nhất.
1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp E của vi sinh vật [20]
Ngoài yếu tố di truyền, quá trình sinh tổng hợp E còn phụ thuộc nhiều vào các
yếu tố sinh trưởng như nhiệt độ, pH, thành phần dinh dưỡng, cơ chất cảm ứng,…
a/ Giống vi sinh vật [20]
Chủng giống vi sinh vật thuần khiết, có chất lượng tốt, đảm bảo được các yêu
cầu của sản xuất phải có những đặc tính cơ bản sau:
- Tạo sản phẩm chính năng suất cao, không sinh độc tố.
- Khả năng thích ứng và phát triển nhanh, thời gian thu sản phẩm ngắn và dễ
dàng, hiệu suất thu hoạch cao.
- Luôn bảo tồn được các đặc tính di truyền quý trong quá trình sử dụng cũng
như bảo quản.

11
b/ Ảnh hưởng của nhiệt độ [20]
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp E của vi sinh vật
cũng như tính chất của E được tổng hợp. Nhiệt độ thích hợp cho các loại nấm mốc
phát triển là 22-320
C, vi khuẩn là 35-450
C.
c/ Ảnh hưởng của pH môi trường [11]
pH ban đầu của môi trường thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật khác
nhau sẽ không giống nhau. Đối với nấm mốc, pH thích hợp trong khoảng 3.8-5.6 còn
đối với vi khuẩn là 6.2-7.4. Lưu ý trong quá trình nuôi cấy, tùy thành phần môi trường
và các sản phẩm trao đổi chất trong quá trình sống của vi sinh vật mà pH môi trường
có thể chuyển sang acid hay kiềm.
d/ Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy [11]
Đây là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động sống cũng như khả năng sinh
tổng hợp E của vi sinh vật. Vì vậy, khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành
phần định tính và định lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp E mong muốn là cao
nhất. Môi trường nuôi vi sinh vật cần đảm bảo chứa đủ các chất C, N, H, O và các
khoáng vi lượng khác như Fe, Mn, K,…
1.3.2. Giới thiệu về γ-amylase [37][13]
Hệ E amylase là một trong số các hệ E được sử dụng rộng rãi nhiều trong công
nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Hiện nay người ta biết có 3 loại E amylase,
trong đó, γ-amylase ở vị trí hàng đầu về hiệu lực thủy phân tinh bột và các sản phẩm
trung gian.
1.3.2.1. Cấu trúc γ-amylase [37]
Có tên hệ thống α-1,4-glucan-glucohydrolase, mã số EC 3.2.1.3, còn được gọi
là glucoamylase hay amyloglucosidase.

12
Hình 1.1: Cấu trúc không gian γ-amylase [38]
γ-amylase gồm 2 dạng cấu trúc khác nhau là γ-amylase I (thành phần cacbonhydrat
chiếm khoảng 18%) và γ-amylase II (thành phần cacbonhydrat chiếm khoảng 10%), nhưng
đều là những chuỗi glyco-protein. Trong phân tử γ-amylase có chứa D-glucose, D-maltose,
D-galactose giúp ổn định cấu trúc E, ngoài ra còn giúp tạo liên kết với cơ chất là các phân tử
polysaccharide, từ đó tạo thuận lợi cho quá trình thủy phân. Số lượng acid amin tham gia vào
chuỗi polypeptid cấu tạo nên phân tử γ-amylase thu nhận từ nấm mốc Asp. niger và Asp.
awamori vào khoảng 650-700 acid amin. Trong không gian, phân tử γ-amylase được chia
làm ba vùng gồm: vùng SBD (Starch binding domain-vùng gắn kết với tinh bột), vùng CD
(Catalyse domain-vùng xúc tác), vùng Linker có độ dài khoảng 100Å giúp liên kết hai vùng
trên lại với nhau.
1.3.2.2. Đặc tính [30]
γ-amylase là E ngoại bào, thuộc nhóm exo-α-1,4 D-glucohydrolase, có khả năng phân
cắt nối α-1,4 lẫn nối α-1,6 glycoside để biến đổi 100% tinh bột đến sản phẩm cuối cùng là
glucose. Đa số γ-amylase đều thuộc loại “chịu axit”, pHopt=3,5-5,5 t0
opt= 50-600
C, mất hoạt
tính ở t > 700
C.
Hình 1.2: Quá trình thủy phân tinh bột của các enzyme amylase [39]

13
1.3.2.3. Nguồn nguyên liệu thu nhận [35][39]
Những chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cao γ-amylase được sử
dụng trong công nghiệp là: Asp. niger, Asp. awamori, Asp. usamii, …Các vi sinh vật
khác cũng có tổng hợp γ-amylase nhưng lượng nhỏ hơn.
1.4. Enzyme cố định (immobilized enzyme)
1.4.1. Khái quát sự cố định E [19]
Enzyme cố định (hay còn được gọi là E không tan) là E có sự tham gia hoạt
động trong không gian bị giới hạn. Sự giới hạn hoạt động vốn linh hoạt của E bằng
cách gắn nó vào một pha cách ly, tách rời khỏi pha lỏng tự do và ở đó nó vẫn có khả
năng tiếp xúc được với các phân tử cơ chất, chất hoạt hóa (effector) hay chất ức chế
(inhibitor). Pha gắn E thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polymer
ưa nước.
1.4.2. Vật liệu cố định enzyme [19]
Không có vật liệu cố định nào thích hợp cho tất cả các loại E và cũng không có
E nào thích hợp với tất cả các loại vật liệu cố định. Vì vậy, việc nghiên cứu đặc điểm,
tính chất của vật liệu cố định là cần thiết cho sự chọn lựa phương pháp cố định E.
Vật liệu cố định E và tế bào có thể được chia thành hai loại: vật liệu vô cơ và
vật liệu hữu cơ.
1.4.2.1. Vật liệu vô cơ [16][5]
Vật liệu vô cơ thường rất bền với môi trường xung quanh, có cấu tạo dạng xốp,
nhiều lỗ nên dễ hấp phụ E, nhất là với phương pháp hấp phụ vật lý.
Các vật liệu vô cơ thông dụng như bột thủy tinh, silicagel, các oxyt kim loại
như oxyt nhôm, oxyt magie,…Trong đó, có một vật liệu bền, rẻ tiền và dễ kiếm được
ứng dụng phổ biến trong sản xuất công nghiệp là diatomite, tên thương mại là celite.
1.4.2.2. Vật liệu hữu cơ [19][21]

14
Vật liệu hữu cơ dùng làm chất mang để cố định E được chia làm hai loại là
polymer sinh học và polymer tổng hợp hóa học. Chúng thường có các nhóm hoạt
động hóa học như: -NH2, -COOH, -OH, -SH,…nên dễ kết gắn với E nhưng độ bền
với tác động môi trường không cao, đặc biệt với các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh
vật xâm nhập và tấn công.
Một số chất mang là polymer sinh học sử dụng rộng rãi hiện nay là cellulose,
agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng. Ngoài ra, chitin, chitosan cũng
được xem là những vật liệu đầy hứa hẹn cho cố định E và tế bào vì rất phổ biến trong
tự nhiên, rẻ tiền, là vật liệu có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, tạo gen, kháng
khuẩn tốt, có sự hiện diện một lượng lớn các nhóm chức tự nhiên là –NH2. Chitosan
có thể cố định E bằng phương pháp hấp phụ, phương pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt E,
nhốt tế bào trong gel chitosan. Tuy nhiên, chitin và chitosan có tính chất kị nước, độ
trương và diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ nên hạn chế khả năng tiếp xúc của cơ chất với
Ecđ, đặc biệt trong trường hợp cơ chất có khối lượng phân tử lớn. Nếu khắc phục được
nhược điểm này thì chitin và chitosan sẽ là những vật liệu lý tưởng đầy hứa hẹn cho
cố định E và tế bào.
Chất mang là polymer tổng hợp hóa học cũng khá phong phú như
polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polystyren,
polyethylen ghép với vinyl monomer,…Nhóm chất mang này có ưu điểm chung là
bền, có tính chất cơ lý tốt, kháng khuẩn tốt, độ trương tốt, một trong số chúng còn có
khả năng điều chỉnh được kích thước lỗ. Bên cạnh đó, chúng còn tồn tại một số nhược
điểm nhất định như là giá thành còn cao, khả năng tương hợp sinh học kém, gây ô
nhiễm môi trường do quá bền vững, chậm phân hủy trong tự nhiên.
1.4.3. Một số phương pháp chủ yếu tạo Ecđ [19][22][25]
E cố định được nghiên cứu và ứng dụng từ những năm 1950. Để chế tạo E cố
định có thể dùng các phương pháp hấp phụ, liên kết hóa trị để gắn E. Chất dùng để
gắn kết E gọi là chất mang, hiện nay người ta thường dùng 2 nhóm chất mang là vô
cơ như Carbon hoạt tính, celite, … và hữu cơ như cellulose, tinh bột, sephadex,

15
agarose,…Chế phẩm E không tan có thể ở dạng bột, hạt, phiến, màng mỏng. Trong
một số trường hợp không cần thiết phải gắn E vào chất mang mà có thể giữ nó ở bên
trong mạng lưới polyme. Mạng lưới này không cho phép E thoát ra khỏi mạng nhưng
vẫn đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra qua lại dễ dàng.
1.4.3.1. Phương pháp vật lí [19][4]
Qui trình thực hiện phương pháp khá đơn giản: chất hấp phụ như cellulose,
dextran, thủy tinh xốp, silicagel, … được trộn lẫn với E, ủ trong một khoảng thời gian
cho phép rồi lọc, rửa phần E không hấp thụ. Sự hấp phụ xảy ra nhờ tương tác của các
liên kết ion kị nước, hydrogen và lực Vande Waals …
Đối với một số chất mang vô cơ như thủy tinh xốp, silicagel và silochrom cần
phải trải qua giai đoạn xử lí bề mặt trước khi sử dụng nhằm loại bỏ sự hấp phụ không
đặc hiệu và đảm bảo độ bền và độ chọn lọc cao của đoạn gắn E.
Ưu điểm của phương pháp này là hoạt tính E cố định thường cao. Tuy nhiên,
nhược điểm là hoạt tính không ổn định lâu dài, E có thể bị giải hấp phụ do sự thay đổi
pH, nhiệt độ và thành phần ion.
1.4.3.2. Phương pháp hóa học [19][24]
Cố định E bằng liên kết cộng hóa trị với các polymer đã được hoạt hóa là một
trong những phương pháp cố định E phổ biến nhất, đảm bảo liên kết vững chắc của E
với chất mang. Điều kiện cơ bản để gắn E vào chất mang không hòa tan hoặc gắn các
phân tử E riêng biệt vào nhau bằng liên kết cộng hóa trị là làm thế nào để các nhóm
có thể hiện hoạt tính của E không bị tham gia vào phản ứng.
Các polymer thường dùng trong phương pháp này là cellulose, alginic acid,
chitin, collagen và keratin; những chất mang polymer tổng hợp có polymer của acylic
acid, polyurethane, các dẫn xuất N-vinylpyrrolidon,...
1.4.3.3. Phương pháp nhốt enzyme trong khuôn gel [19]
Để bao được E trong khuôn gel, tiến hành trùng hợp hóa các gel khi có mặt
enzyme. E thường được nhốt trong gel của polyacrylamide, calcium alginate,

16
polyvinylpirolindon, polyhydroxymethacylate, và một số gel khác. Kết quả thu được
là các E bị nhốt vào trong các lỗ gel. Lỗ gel nhỏ thì E sẽ được giữ chặt ở trong lỗ gel.
Có thể nghiền nhỏ gel đã có E bằng cách đồng hóa hoặc ép qua rây rồi đem sấy khô ở
nhiệt độ thấp.
Hiệu quả của việc nhốt và hoạt độ riêng của Ecđ phụ thuộc vào thành phần và
hoạt tính của gel. Nhược điểm của phương pháp này là Ecđ có thể bị giảm hoạt tính do
sự phân bố không đều của E trong gel. Thực nghiệm cho thấy chỉ những E nằm gần
bề mặt gel là tiếp xúc được với cơ chất và tham gia xúc tác phản ứng.
1.4.3.4. Phương pháp microcapsule (phương pháp tạo vi túi) [19]
Đây là một hướng cố định E bằng phương pháp vật lí được sử dụng rộng rãi
hiện nay. Là quá trình tạo vi túi có màng không thẩm thấu đối với E và chất có trọng
lượng phân tử cao nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm dễ dàng thẩm thấu qua. Phương
pháp này cho phép giữ E trong dung dịch gần giống với tự nhiên và sử dụng E nhiều
lần vì có thể tách và thu nhỏ nó dễ dàng khỏi sản phẩm của quá trình phản ứng bằng
cách lọc.
Phương pháp tạo microcapsule rất tiện lợi để cố định các hệ polyenzyme (đa
enzyme). Bên cạnh việc tạo microcapsule bằng màng bán thấm còn có thể tạo
microcapsule bằng màng lỏng. Màng lỏng là một pha không tan trong nước cấu tạo từ
các chất có hoạt tính bề mặt, dung môi hữu cơ và các chất ổn định, pha này chứa các
giọt nhũ có kích thước từ vài μm đến vài mm có chứa dung dịch hay huyền phù của E.
1.4.3.5. Phương pháp siêu lọc [19]
Enzyme được giữ lại trong các màng, các sợi siêu lọc. Những sợi này được chế
tạo từ những polymer tự nhiên hoặc tổng hợp. Sự cố định có hiệu quả E trong vật liệu
xốp có kích thước lỗ ở thành sợi từ 5-10µm có thể thực hiện bằng cách làm đầy thể
tích sợi bằng dung dịch E và ủ trực tiếp E trong đó. Khi hệ trên hoạt động thì cơ chất
sẽ đi qua những lỗ của sợi (phương pháp tái hồi lưu) hoặc dưới áp suất đi qua lỗ vào
của lớp vỏ, trong khi lỗ ra đóng (phương pháp rửa ngược).

17
Phương pháp này đã được sử dụng để cố định các glucoamylase,
glucoisomerase, galactosidase.
1.4.4. Lựa chọn phương pháp cố định
Xác định phương pháp cố định E đóng vai trò quan trọng trong thao tác cố
định E. Sự lựa chọn ban đầu thường được thực hiện bằng thực nghiệm. Để quá trình
cố định có kết quả cần phải để ý đến các yếu tố sau:
- E phải cố định trong những điều kiện diễn ra phản ứng.
- Các chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang chủ yếu chỉ tương tác với các
nhóm chức năng nằm ngoài tâm hoạt động của E. Nếu điều kiện trên không thực hiện
được thì chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang phải có kích thước lớn không cho
phép nó xâm nhập vào tâm hoạt động của E.
- Tâm hoạt động phải luôn được bảo vệ, đôi khi có thể che tầm hoạt động bằng
cách bổ sung vào hỗn hợp phản ứng cơ chất đã được bão hòa bởi E.
- Biện pháp rửa tách E không được gắn phải cẩn thận, không gây ảnh hưởng
xấu đến E đã được gắn.
- Khi lựa chọn hệ số cố định, cần phải để ý đến phản ứng cụ thể. Cần tính đến
cách tính cơ học của chất mang. Điều này quan trọng hơn với những chất mang được
sử dụng trong những cột lớn.
1.4.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định E [19]
1.4.5.1. Ảnh hưởng của chất mang [19]
Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ hóa, điện tích,
tính háo nước và kị nước, … đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng E được liên kết,
đến tính bền và hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất E không tan.
Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo thành dẫn
xuất E và ảnh hưởng tới khả năng chất mang hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi
trường phản ứng.

18
Sự định vị E giúp cho dẫn xuất E không tan có tính bền nhiệt cao hơn E tan.
Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của E trong các dung môi, làm đứt
mối liên kết hydro và liên kết kị nước.
1.4.5.2. Ảnh hưởng của pH [19]
Điện tích của chất mang có ảnh hưởng đáng kể đến pH tối ưu của E không tan.
pH tối ưu của E không tan có thể bị chuyển dịch về phía kiềm hay acid so với pH tối
ưu của enzyme hòa tan.
1.4.6. Ứng dụng Ecđ và các thành tựu nghiên cứu về Ecđ [23][27][28][29]
Enzyme cố định lần đầu tiên được ứng dụng ở qui mô công nghiệp vào năm
1969 do Chibata và các cộng sự. Aminoacylase được cố định trên DEAE – sephadex
nhờ liên kết ion để chuyển hóa hỗn hợp D, L – acid amin thành L – acid amin.
Mosbach (1970) đã cố định tổ hợp cả ba loại enzyme là β – galactosidase,
hexokinnase và gluco-6-phosphat dehydrogenase bằng liên kết cộng hóa trị với các
hạt sephadex. Tế bào vi sinh vật cố định lần đầu tiên được ứng dụng ở qui mô công
nghiệp cũng được thực hiện bởi Chibat (1973), Chibata và công sự đã cố định E.coli
trong gel polyacrylamide để sản xuất acid L-aspartic từ amonium fumarat nhờ hoạt
tính aspartase rất cao của E.coli.
Từ những thành công bước đầu này đã mở ra những ứng dụng to lớn của Ecđ và
tế bào cố định với y học và công nghiệp.
1.4.6.1 Ứng dụng trong y học [19]
Enzyme cố định đã có những thành tựu to lớn trong y học, đặc biệt để chữa các
bệnh di truyền do thiếu E hoặc hoạt độ của E tương ứng không đủ mạnh chẳng hạn
như bệnh plenylxeton niệu hoặc bệnh suy thận mãn tính. Nếu đưa trực tiếp E không
thuần khiết vào để chữa bệnh có thể dẫn đến dị ứng hoặc phản ứng miễn dịch. Chang
vào năm 1954 đã tạo ra vi tiểu cầu bán thấm có gắn urease, nhờ đó E có thể tồn tại lâu
trong cơ thể do cơ chất và sản phẩm phản ứng dễ dàng đi qua màng, còn E thì biệt lập

19
với môi trường xung quanh. Nhờ đó tạo được trong cơ thể một nồng độ có hiệu quả
cao của E thiếu mà vẫn không gây phản ứng phụ.
Một ứng dụng khác của urease gắn trong vi tiểu cầu được sử dụng có hiệu quả
để loại ure của máu trong chạy thận nhân tạo. Vi tiểu cầu chứa catalase có thể thay thế
một cách hiệu quả các catalase thiếu trong cơ.
Sử dụng Ecđ còn đem lại nhiều triển vọng trong chữa bệnh hiểm nghèo như ung
thư. Đưa vi tiểu cầu có gắn L-asparaginase vào cơ thể có khả năng ức chế sự phát
triển của một số khối u ác tính bởi sự phát triển của các khối u này phụ thuộc vào sự
có mặt của L-asparagin.
Ngoài ra, Ecđ còn là công cụ đắc lực trong chẩn đoán bệnh như enzyme horse
radish peroxidase được cố định trên polystyren cùng với kháng thể hay kháng nguyên
gây bệnh giúp chẩn đoán nhanh và chính xác – kỹ thuật ELISA. Các chế phẩm này
được thương mại hóa như các test ELISA chẩn đoán siêu vi B.
1.4.6.2. Ứng dụng trong kỹ thuật sinh hóa [19][36]
Ecđ là công cụ phân tích sinh hóa có giá trị. Năm 1970, Bernty đã dùng
glucooxidase gắn bằng đồng hóa trị ở trong cột polystirol để xác định tự động
glucose. Khi đặt điện cực E tiếp xúc với dung dịch nghiên cứu có chứa cơ chất của E,
trong lớp điện cực sẽ xảy ra phản ứng E. Với ứng dụng này, người ta đã xác định liên
tục nồng độ glucose nhờ glucooxidase không tan. Và cũng trên nguyên tắc đó, nhà
khoa học Clark đã đề ra phương pháp xác định metanol và etanol trong nước và trong
hơi nước nhờ điện cực có chứa alcoloxydoreductase cố định.
1.4.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp [19]
Enzyme cố định có ứng dụng trong công nghiệp khá đa dạng, đem lại hiệu quả
kinh tế cao cho nhà sản xuất. Các ngành công nghiệp: bia, rượu, nước giải khát, chế
biến sữa, sản xuất hóa chất, …đều có nhiều ứng dụng Ecđ trong qui trình sản xuất.
Các lĩnh vực đã sử dụng ở qui mô công nghiệp:
- Sản xuất hỗn hợp glucose – fructose từ tinh bột thông qua glucoisomerase.

20
- Tách hỗn hợp L – aminoacid và D – aminoacid nhờ L – aminoacylase để sản
xuất L – aminoacid.
- Thu nhận D – aminoacid nhờ aspartare.
- Sinh tổng hợp L – succinic acid nhờ fumarase.
- Thu nhận 6 – APA (6 – aminopenicillinamidase) nhờ penicillinamidase.
- Thu nhận sữa không có lactose (sữa phi – lacto) nhờ lactase.
1.4.6.4. Ứng dụng trong bảo vệ môi trường [19]
Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu, bia, chế biến đường, … chất
thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu hữu cơ. Do
đó có thể sử dụng Ecđ để xử lí nước thải sinh học nhằm làm giảm thiểu hàm lượng hữu
cơ trước khi đưa ra môi trường bên ngoài.
Ở Việt Nam, những nghiên cứu cố định E chỉ mới bắt đầu trong vài năm gần
đây, kết quả thu được cũng còn rất hạn chế. Năm 1994-1995 Viện Sinh học Nhiệt đới
Thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu cố định glucoisomerase trên các hạt Silochrom
B2 hoạt hóa bằng glutaraldehyde. Hiện nay Viện cũng đang nghiên cứu sử dụng chế
phẩm glucoisomerase cố định của Novo (Đan Mạch) để sản xuất siro fructose, tuy
nhiên mới chỉ ở qui mô phòng thí nghiệm.
Những năm gần đây, Phòng Công nghệ bức xạ, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà
Lạt đã có nhiều công trình nghiên cứu cố định enzyme, tế bào và các chất có hoạt tình
sinh học khác bằng kỹ thuật bức xạ như cố định glucoamylase, protease, vi khuẩn tả
(Vibro cholerae), tế bào nấm men (Saccharomyces serevisae), vi khuẩn xử lí nước
thải trên polymer tổng hợp được chế tạo bằng kỹ thuật bức xạ.
1.5. Sự thủy phân tinh bột và ứng dụng sản phẩm sau thủy phân
1.5.1. Đại cương về tinh bột [31]

21
Tinh bột là polysaccarit chủ yếu có trong hạt, củ, thân cây và lá cây, phân tử
lượng cao gồm các đơn vị α-glucose được nối nhau bởi các liên kết α- glycoside, có
công thức phân tử là (C6H10O5)n.
Tinh bột không phải một hợp chất đồng thể mà gồm hai polysaccarit khác
nhau: amilose và amilopectin. Tỉ lệ amylose/amylopectin xấp xỉ ¼. Tuy nhiên, tỉ lệ
này có thể thay đổi phụ thuộc thời tiết, mùa vụ, tùy loại tinh bột và kĩ thuật canh tác.
Amylose: cấu tạo mạch thẳng gồm những đơn vị α – glucose (200 – 1000 gốc)
liên kết nhau bằng liên kết 1,4-O-glycoside. Hàm lượng amylose có ý nghĩa rất lớn
đến tính chất tinh bột, có liên quan mật thiết với các tính chất chức năng như độ nhớt,
độ dẻo, dai, phồng nở...và vì vậy ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng của tinh bột.
Tinh bột có hàm lượng amylose cao có cấu trúc hồ bột cứng dễ bẻ gãy trong khi tinh
bột có hàm lượng amilose thấp (100% là amylopectin) cho loại hồ bột mềm hơn và
dai hơn.
Amylopectin: cấu tạo có mạch nhánh và mạch thẳng kết hợp nhau do các α –
glucose liên kết nhau bằng liên kết 1,4-O-glycoside tạo các đoạn mạch thẳng, còn liên
kết 1,6-O-glycoside tạo các đoạn mạch nhánh. Tỷ lệ các liên kết α-D-(1-6) so với các
liên kết α-D-(1-4) trong amylopectin ước tính khoảng từ 5 đến 6%.
Khi bị đun nóng trong nước, các hạt tinh bột thủy phân, cấu trúc bị phá vỡ và
giải phóng amylose và amylopectin. Các phân tử hầu hết đều tan trong nước và cho
độ nhớt cao, tạo ra một dung dịch đồng nhất hay còn gọi là hồ tinh bột tùy theo mật
độ tinh bột.
Hình 1.3: Cấu tạo tinh bột

22
1.5.2. Đặc tính tinh bột sắn và tinh bột bắp [1][10]
1.5.2.1. Đặc tính tinh bột sắn [1][10]
Hạt tinh bột sắn (củ khoai mì) có kích thước trung bình 5-35 nm, hình tròn.
Thành phần hoá học chính của củ sắn tươi (%): Nước: 70,25; Tinh bột: 20-34;
Protein: 0,8-1,2; Chất béo: 0,3-0,40; Cellulose: 1,1-3,1; Đường: 5,13; Hàm lượng
amilose: 25;…Trong củ sắn một hợp chất phaseolunatin chiếm tỉ lệ 0,001-0,04mg%
gây ngộ độc khi bị thủy phân giải phóng ra HCN.
Tỷ lệ amylose và amylopectin thông thường trong tinh bột sắn tương ứng là 20%
và 80% (tỷ lệ này có thể thay đổi tùy theo điều kiện canh tác và sinh trưởng). Trong
quá trình tổng hợp sinh học tinh bột, cấu trúc bán tinh thể của amylose và
amylopectin được xếp chặt vào bên trong các hạt tinh bột có kích thước từ 10 đến
35µm đối với củ sắn (Tongdang, 2001).
Tinh bột sắn có độ trong cao hơn các tinh bột ngũ cốc do sự liên kết yếu giữa
các phần tử tinh bột trong hạt. Độ nhớt của tinh bột sắn cũng đạt giá trị khá cao. Nhiệt
độ hồ hóa trung bình 67-75o
C. Hồ bột sắn thường dai là do hàm lượng amylose tương
đối thấp (20-25%) và do cấu trúc của amylopectin.
1.5.2.2. Đặc tính tinh bột bắp [14][31]
Bắp là cây trồng chiếm 36% sản lượng trên thế giới. Bên cạnh vai trò lương
thực, nguồn tài nguyên tự nhiên, tái sinh được, đa dụng và có tính tự hoại này đang có
nhiều ứng dụng khác trong thương mại. Tinh bột, thành phần chính có trong bắp, là
một polysaccharide hình thành từ nhiều nhóm đường đơn α-glucose với liên kết
carbon 1-4 tạo thành mạch dài chứa 500-2000 đơn vị đường đơn glucose.
Hạt tinh bột bắp (bắp vàng) có kích thước trung bình 5-20μm, hình đa giác, tròn.
Có thành phần (%) hóa học chính như sau: amylose: 20; protein: 6-10; độ ẩm trung
bình khoảng 9,5; chất tro: 1,6; chất béo: 5,1; cellulose: 4.1; …Nhiệt độ hồ hóa khoảng
52-59o
C.

23
1.5.3. Các phương pháp thủy phân tinh bột [1][10]
Một tính chất quan trọng của tinh bột là quá trình thủy phân liên kết α-D (1,4);
(1,6)…- glycoside giữa các đơn vị glucose bằng acid hoặc bằng enzyme. Đặc trưng
của phản ứng này là sự giảm nhanh độ nhớt và sinh ra đường.
1.5.3.1. Thủy phân tinh bột bằng acid [10][32]
Dưới tác dụng của axit một phần các liên kết giữa các phân tử và trong phân tử tinh
bột bị đứt, làm giảm kích thước phân tử, tinh bột thu được những tính chất mới.
Acid được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất dextrin, maltodextrin và một
vài loại siro có đương lượng dextro (dextrose equivalent - DE) khoảng 40. Sản phẩm
có DE thấp thường bị thoái hóa do thủy phân không hoàn toàn, còn sản phẩm DE cao
hơn lại có độ ổn định màu và vị kém.
Sự thủy phân tinh bột bằng acid đã được sử dụng rộng rãi trong quá khứ.
Nhưng hiện nay gần như được thay thế bằng các quá trình thủy phân bằng E. Vì sử
dụng acid đòi hỏi các vật liệu chống ăn mòn, tăng độ màu và hàm lượng muối trong
sản phẩm, cần nhiều năng lượng để nâng nhiệt độ phản ứng và tương đối khó kiểm
soát. Ngoài ra, các acid mạnh dùng trong thủy phân không thân thiện với môi trường
và gây nhiều khó khăn cho xử lí nước thải.
1.5.3.2. Thủy phân tinh bột bằng enzyme [11][33]
Tinh bột có thể bị thủy phân bởi hệ E đặc hiệu với liên kết α-1,4 như hệ
enzyme amylase; hay bởi các enzyme đặc hiệu với liên kết α-1,6 như pululanase,…;
hay bởi các enzyme đặc hiệu với liên kết α-1,6 và liên kết α-1,4 như γ-amylase,…
Trong sản xuất công nghiệp các đặc điểm và các tính chất của các sản phẩm
thường phụ thuộc vào nguồn E được sử dụng, nồng độ E và thời gian thủy phân.
Quá trình thủy phân tinh bột từ E vi sinh vật tạo dung dịch đường có thể chia
làm 3 giai đoạn theo sơ đồ:

24
1.5.4. Các sản phẩm thủy phân tinh bột và ứng dụng [14]
Hiện nay, nấm mốc được dùng phổ biến để thu chế phẩm amylase đường hóa
các nguồn nguyên liệu tinh bột trong sản xuất rượu, bia, sinh khối nấm men, …
Trong công nghệ sản xuất sinh khối nấm men, sản phẩm thu được là những tế
bào chứa hàm lượng protein rất cao (40-60%), đồng thời còn chứa lượng không nhỏ
các chất béo, vitamin và các chất khoáng. Đặc biệt, protein vi sinh vật theo hàm lượng
axit amin, vitamin và mức độ hấp thụ còn vượt trội hơn nguồn protein động vật. Vì
vậy, việc dùng sinh khối nấm men khô làm nguồn protein-vitamin bổ sung trong khẩu
phần thức ăn chăn nuôi gia súc và gia cầm đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn. Sản
phẩm này thường được gọi là Men gia súc hay Men thức ăn chăn nuôi, hay nguồn
protein đơn bào (SCP) có ý nghĩa rất quan trọng đối với ngành kinh tế quốc dân.
Quy trình công nghệ sản xuất sinh khối nấm men từ sản phẩm đường hóa nguồn
nguyên liệu tinh bột nhờ Asp. niger được tóm tắt theo sơ đồ sau:
Hình 1.4: Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi E vi sinh vật [14]
Tinh bột
Dextrin hóa α - amylase
Glucoamylase
β - amylase
Pululanase
Oligosaccharid, maltose, α - glucose
Đường hóa
Dextrin mạch thẳng và mạch nhánh
GlucoisomeraseFructose Đồng phân hóa

25
Hình 1.5: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất sinh khối nấm men[14]
Asp. niger
Tinh bột
α - glucose
γ - amylase
Nhân giống
Nấm men
D-glucose, các muối vô cơ
Li tâm
Nuôi thu sinh khối
Môi trường dinh dưỡng
Xử lý
Sinh khối
Thải bỏ
Sấy khô
Thành phẩm

Phaàn 2
Vaät lieäu –
Phöông phaùp

26
PHẦN 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
- Vi sinh vật: Nấm mốc Asp. niger từ Bộ môn Sinh hóa trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Tp. HCM. Nấm men Saccharomyces cerevisiae thương phẩm (Hãng
Angel, Trung Quốc).
- Enzyme: γ-amylase hòa tan thương phẩm (Hãng Novo Đan mạch).
- Cơ chất: Bột năng (mua tại các chợ trong thành phố) và tinh bột tan (phòng
thí nghiệm sinh hóa trường Đại học KHTN cung cấp).
- Chất mang vô cơ diatomite (celite) và hữu cơ chitosan (phòng thí nghiệm
sinh hóa trường Đại học KHTN cung cấp).
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Các loại hóa chất và dụng cụ thí nghiệm do phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh
hóa Trường Đại học Sư phạm, Tp. HCM và phòng thí nghiệm Sinh hóa Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên cung cấp.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp giữ giống Asp. niger [20]
* Nguyên tắc
Nấm mốc Asp. niger có khả năng sinh bào tử nên có thể giữ giống bằng cách
cấy trên môi trường thạch nghiêng PGA (Potato glucose agar).
* Môi trường PGA gồm: Khoai tây: 100g; Glucose: 10g; Agar: 10g; Nước
cất: 500ml; pH = 6.5; Hấp khử trùng 1210
C, 15 phút.
* Cách tiến hành:
- Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát mỏng và nấu chín.
- Chiết dịch nấu khoai tây, nếu dịch có quá nhiều tinh bột phải lọc qua vải lọc.

27
- Cho agar vào dịch đang đun, khuấy liên tục cho đến khi agar tan hoàn toàn,
tiếp tục cho glucose vào, khuấy đều cho tan rồi đổ vào các ống nghiệm, đậy nút bông,
hấp khử trùng. Sau đó, đặt nghiêng các ống nghiệm tạo thạch nghiêng.
- Cấy chuyền từ ống giống sang các ống thạch nghiêng, nuôi ở t0
= 30-350
C
trong 2-3 ngày cho bào tử mọc đều bề mặt thạch nghiêng, bảo quản ở t0
= 5-90
C.
2.2.2. Quan sát các đặc điểm hình thái của chủng giống Asp. niger [12][20]
2.2.2.1. Quan sát đại thể [12][20]
Sau khi hoạt hóa giống ta tiến hành tạo khuẩn lạc khổng lồ theo các bước sau:
- Chuẩn bị môi trường Czapek Dox cải tiến (gồm : 1,5g KH2PO4; 3,5g
NaNO3; 20g glucose; 0,5g KCl; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,1g FeSO4.7H2O; 20g agar;
1000ml nước cất; khử trùng 1210
C, 1atm, 15 phút) đổ vào 2-3 đĩa petri dày khoảng
3mm.
- Dùng que cấy lấy bào tử từ ống giống thạch nghiêng rồi cấy chấm điểm vào
mặt thạch ở giữa hộp petri.
- Nuôi cấy ở nhiệt độ 300
C trong khoảng 7 ngày.
- Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm: hình thái, kích thước, màu
sắc khuẩn lạc, dạng sợi nấm mọc ở trên mặt thạch, đặc điểm mép khuẩn lạc, …
2.2.2.2. Quan sát vi thể bằng kĩ thuật làm phòng ẩm[20]
- Chuẩn bị môi trường Czapek Dox cải tiến đổ vào 2-3 đĩa petri dày khoảng
1mm. Khi thạch đã đông, dùng khoan nút chai vô trùng có d ≈ 9mm khoan các khối
thạch.
- Chuẩn bị các đĩa petri sạch, lame, lamelle, giấy thấm vô trùng.
- Đặt khối thạch lên lame. Cấy một ít bào tử nấm mốc lên bề mặt xung quanh
khối thạch. Đậy lamelle lại và cho vào hộp petri có sẵn giấy thấm được làm ẩm bằng
nước cất vô trùng.
- Sau 2-3 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng 30 – 320
C, gỡ lamelle ra, úp lên một
lame sạch khác. Gỡ bỏ khối thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ
giọt lactophenol, đậy lamelle lên trên ta được tiêu bản để quan sát các đặc điểm hình

28
thái nấm sợi ở vật kính x40: giá bào tử thể, thể bình, cuống thể bình, sợi nấm có hay
không có sự phân nhánh và vách ngăn, đặc điểm bào tử,…
2.2.3. Phương pháp định lượng mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng
cầu [9][12][20]
* Cấu trúc buồng đếm
Buồng đếm Goriaep là một phiến kính dày hình chữ nhật, ở phần giữa là lõm
phẳng, tại đây có kẻ một lưới gồm 4,5 hình vuông có diện tích tổng cộng là 1mm2
và
được chia thành 25 ô vuông lớn (1/25 mm2
/ 1 ô). Mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400
mm2
, mỗi ô lớn có thể tích là 4.10-6
ml.
* Cách tiến hành
Lắc mạnh dịch huyền phù, dùng pipetman nhỏ một giọt dịch huyền phù lên bề
mặt khung đếm. Đặt khung đếm lên bàn kính hiển vi. Đếm ít nhất 5 ô lớn, lấy trị số
trung bình (không quá 10 tế bào/1 ô nhỏ ≈ 2.5 < a <10).
* Cách tính kết quả:
Số tế bào trên 1ml mẫu phân tích (N):
N (tế bào/ml) =
Trong đó: a: số tế bào trung bình có trong một ô lớn.
v: thể tích một ô lớn = 4 x 104
.
K: hệ số pha loãng mẫu.
Vậy N (tế bào/ml) = = 0.25 x a x K x 106
.
* Định lượng tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang
a/ Nguyên tắc
Tế bào VSV là 1 thực thể nên khi hiện diện trong môi trường lỏng làm cản ánh
sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới và làm đục môi trường. Độ đục của huyền phù
tỉ lệ với mật độ tế bào. Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào 1 cách gián tiếp thông
qua đo độ đục bằng máy so màu ở bước sóng 610nm.

29
b/ Cách tiến hành
Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng
cách:
- Pha loãng 1 huyền phù chứa bào tử nấm mốc cần kiểm nghiệm có mật độ bất
kì thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD610nm đạt các giá trị lân cận
0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5. Đo OD610nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo
thực tế.
- Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi (dùng khung đếm hồng
cầu), xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này.
- Tính giá trị log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi độ
đục. Vẽ đường biểu diễn của log (N/ml) theo OD610nm.
* Xác định mật độ tế bào theo độ đục
- Đo độ đục của 1 huyền phù tế bào cần xác định mật độ.
- Từ trị số OD610nm đo được, suy ra trị số log(N/ml) và trị số mật độ N/ml
(N/ml = 10a
với a= log(N/ml)) từ đường chuẩn.
2.2.4. Phương pháp khảo sát thời gian nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi
cấy Asp. niger thu γ – amylase [8]
* Môi trường nuôi cấy: Cám: 70% - 75%; Trấu: 25%; Bột năng (hay bột
bắp): 1 - 5%.
* Dung dịch khoáng bổ sung vào môi trường tạo độ ẩm 50% gồm: NaNO3:
3g; K2HPO4: 1g; MgSO4: 0.5g; KCl: 0.5g; FeSO4: 0.1g; Nước cất: 1000ml; Khử
trùng 1210
C, 1atm, 15 phút.
- Hỗn hợp cám, trấu, bột năng (hay bột bắp) sau khi bổ sung dung dịch khoáng
được trộn đều rồi chia đều vào các erlen, bịt bông gòn.
- Dùng pipet hút 1 ml dung dịch huyền phù nấm mốc cấy vào mỗi erlen (30g
môi trường/1 erlen) (lượng bào tử cho vào khoảng 15x107
).
- Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng dùng tay lắc đều môi trường để giữ
độ xốp và thoáng khí.

30
2.2.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp γ – amylase từ Asp. niger
[3][7][9]
2.2.5.1. Thời gian nuôi cấy
- Tại mỗi thời điểm nuôi cấy (2; 2,5; 3; 3,5; 4 ngày), lấy 10g môi trường nuôi
cấy nấm mốc hòa trong 20 ml nước cất, để trên máy lắc 30 phút, nghiền rồi lọc qua
vải, sau đó li tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút.
- Thu lấy dịch ly tâm, lọc qua giấy lọc, thu dịch E thô.
- Pha loãng dịch E thô lần lượt 10 lần, 50 lần, 100 lần tùy vào thời điểm cần
khảo sát hoạt độ.
- Tiến hành phản ứng xác định hoạt độ E theo từng thời điểm nuôi cấy theo
mục 2.2.7.
- Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến đổi của hoạt độ γ – amylase theo thời gian nuôi
cấy khác nhau của chủng nấm mốc Asp. niger.
2.2.5.2. Thành phần môi trường thay đổi
- Lần lượt thay đổi tỷ lệ cám gạo và bột năng (hay bột bắp) trong thành phần
môi trường nuôi cấy theo các tỉ lệ: 75/1; 74/2; 73/3; 72/4; 71/5 (gram).
- Tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt độ γ – amylase theo sự thay đổi thành
phần môi trường của nấm mốc Asp. niger theo mục 2.2.4, 2.2.6 và 2.2.7.
2.2.6. Phương pháp thu nhận γ – amylase từ Asp. niger [9][14][25]
- Nuôi cấy nấm mốc trong khoảng thời gian và môi trường tối ưu.
- Tách chiết, thu nhận chế phẩm E bán tinh khiết được thực hiện bằng cách
sau: Môi trường nuôi nấm mốc được khuấy trộn với nước cất (tỷ lệ nước cất và môi
trường là 2:1), lọc qua vải lọc lấy dịch lọc, thu được phần dịch chứa E. Làm lạnh
nhanh dịch chiết E xuống còn 3-50
C, kết tủa E bằng cồn theo tỷ lệ 4 cồn : 1 dịch
enzyme (cồn cũng đã được làm lạnh 3-50
C). Ly tâm dịch tủa trong 15 phút ở tốc độ

31
6000 vòng/phút. Thu tủa, sấy ở nhiệt độ 35-400
C cho đến khi độ ẩm của tủa đạt 11-
14%. Thu được chế phẩm E khô. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh.
2.2.7. Xác định hoạt độ γ – amylase theo phương pháp so màu với DNS [9]
2.2.7.1. Nguyên tắc
Hoạt độ γ – amylase (gluco-amylase) được tính dựa trên lượng glucose tạo ra
khi thủy phân tinh bột bằng enzyme. Hàm lượng glucose được xác định bằng cách
đo mật độ quang của dung dịch tạo màu khi có mặt thuốc thử DNS (3, 5 dinitro
salicilic acid) tại bước sóng 530nm.
Một đơn vị hoạt tính γ – amylase xúc tác thủy phân tinh bột, giải phóng 1 μg
glucose trong 1 phút, ở điều kiện nhiệt độ 450
C, pH 5.
2.2.7.2. Cách tính
HđC =
Với: m: Hàm lượng glucose (μg/ml).
L: Độ pha loãng mẫu.
5: Thể tích dung dịch phản ứng (ml).
t: thời gian phản ứng (10 phút).
HđC: hoạt độ chung γ – amylase (UI/g_CPE).
2.2.8. Định lượng protein hòa tan trong CPE theo phương pháp Lowry [12][26]
Phương pháp này dùng để xác định lượng protein hòa tan có trong 1 gram
chế phẩm enzyme (hay 1ml chế phẩm enzyme lỏng), từ đó xác định hoạt tính riêng
của enzyme trên 1mg protein enzyme. Phương pháp này cũng được sử dụng để định
lượng protein trong các nguyên liệu khác.
2.2.8.1. Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lượng của những
acid amin này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng loại với nhau sẽ
chứa hàm lượng acid amin này như nhau.
m. L. 5
t

32
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo một phức chất có màu,
cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan, vì thế có thể dùng
phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein. Phương pháp này có độ nhạy
cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ 1μg/ml.
2.2.8.2. Hóa chất
Dung dịch albumin 0.1%: 0.1g albumin pha nước cất thành 100ml dung dịch.
Dung dịch A: 2g Na2CO3 hòa tan trong NaOH N/10 thành 100ml dung dịch.
Dung dịch B: cân 0.5g CuSO4 hòa tan trong dung dịch citrat natri 1% thành
100ml dung dịch.
Dung dịch C: chỉ pha để dùng ngay trong ngày gồm hỗn hợp của 2 dung dịch
A và B theo tỷ lệ 49/1.
2.2.8.3. Cách tiến hành
Hút 0.4ml dung dịch có chứa protein cho vào ống nghiệm sạch khô, thêm
2ml dung dịch C, lắc đều và để yên ở nhiệt độ thường trong 10 phút. Sau đó thêm
0.2ml thuốc thử Folin vào, lắc đều trong 5-10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml, đem
đo mật độ quang ở bước sóng 520nm.
2.2.8.4. Cách tính
* Dựng đường chuẩn
Thực hiện xây dựng đường chuẩn với một loại protein tinh khiết có sẵn,
thông thường dùng albumin tinh khiết. Hút 0.4ml dung dịch albumin chuẩn có nồng
độ theo thứ tự: 0; 50; 100; 150; 200; 250 μg/ml vào các ống nghiệm sạch khô đã
đánh số phân biệt. Thực hiện phản ứng tương tự như trên. Muốn vậy phải thực hiện
theo bảng sau để có được các dung dịch albumin chuẩn với nồng độ khác nhau:
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ protein (μg/ml) 0 50 100 150 200 250
Dung dịch albumin 0.1% (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Nước cất (ml) 10 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5

33
Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ở bước sóng 750nm
(∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml).
* Tính kết quả
Từ đồ thị chuẩn, trên cơ sở giá trị mật độ quang (trục tung) đo được của mẫu
thí nghiệm có chứa protein cần xác định, ta suy ra hàm lượng protein của mẫu cần
đo.
2.2.9. Xác định hoạt độ riêng của các chế phẩm enzyme [9]
Hoạt độ của chế phẩm enzyme được xác định theo công thức:
CPE
CPE
UIHđC/ g
HđR
mg _ protein _ E / g mg _ protein _ E
= =
∑
Với: + HđR: hoạt độ riêng.
+ HđC: hoạt độ chung.
+ ∑ĐVHđ: Số đơn vị hoạt độ enzyme/g CPE hay /ml CPE (∑UI/g hay
∑UI/ml).
+ C: mg protein/ml dung dịch enzyme hay /g CPE.
+ CPE: chế phẩm enzyme
+ UI: đơn vị hoạt độ enzyme.
+ ∑ UI: tổng đơn vị hoạt độ enzyme.
2.2.10. Lựa chọn phương pháp cố định γ-amylase [9][19]
2.2.10.1. Cố định γ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị
* Nguyên tắc
Dựa vào liên kết cộng hóa trị được hình thành giữa γ-amylase lên màng
chitosan.

34
Dung dịch chitosan được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1g chitosan trong 100ml
acid acetic 1%. Sau đó đổ dung dịch chitosan 1% lên phiến kính phẳng và để khô
trong trong không khí trong tủ hút. Màng chitosan được ngâm trong dung dịch
NaOH 0.1M/24h để trung hòa lượng acid dư. Sau đó màng được rửa nhiều lần với
nước cất cho đến khi nước rửa trung tính và để khô ở nhiệt độ phòng. Màng
chitosan chuẩn có bề dày khoảng 50μm.
1g chitosan tạo được 250m2
màng.
* Hoạt hóa màng chitosan
Màng chitosan được ngâm và lắc trong dung dịch glutaraldehyde 2%/4h ở
nhiệt độ phòng, rửa mẫu nhiều lần với nước cất nhằm loại hết dư lượng
glutaraldehyde.
* Cố định γ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị
Màng chitosan đã được hoạt hóa bằng glutaraldehyde được ngâm và lắc với
50ml dung dịch đệm chứa 0.2g chế phẩm γ-amylase/1-5h ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục
dùng dung dịch đệm (với thể tích xác định) rửa màng chitosan đã có enzyme cố định
để loại bỏ các enzyme không gắn kết lên màng. Lượng protein cố định và hoạt tính
γ-amylase được xác định gián tiếp qua lượng protein và tổng đơn vị hoạt độ E hiện
diện trong nước rửa.
2.2.10.2. Cố định γ-amylase lên chất mang là Celite (Diatomite) bằng phương
pháp hấp phụ [14]
* Nguyên tắc
Dựa vào khả năng hấp phụ γ-amylase lên chất mang Celite.
- Cân 0.2g enzyme pha thành 50ml với dung dịch hệ đệm pH 5.
- Cân 5g diatomite, cho từ từ vào 50ml dung dịch enzyme trên, khuấy hỗn
hợp trong 30 phút ở 40
C, lọc dịch lọc bằng giấy lọc.
- D ịch sau khi lenzyme
trên giấy lọc được bảo quản ở nhiệt độ lạnh.

Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY

Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY

Similar to Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY (20)

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY