Downloaded 173 times
![1 10 102 103 104 105 106
Cycle 15
Cycle 19
Cycle 23
Cycle 26
Cycle 29
Cycle 31
Cycle 33
Cycle 34
Cycle 36
Cycle 39
Cycle 41
Cycle 13
Cycle 11
1 10 102 103 104 105 106
C.41
C.39
C.36
C.33
C.31
C.29
C.34
Mẫu chưa biết [C]
Standard curve](https://image.slidesharecdn.com/94buggrfas1h7zgicjvw-signature-f61437bff2a8cb4e574f63531b9b2080ba8ca20005d6f6ed68530806aa7f7580-poli-150319062414-conversion-gate01/85/ly-thuy-t-Realtime-9-320.jpg)
![E%=PCR efficiency (90%-105%)
R=Corelation coefficiency (>0.990)
ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR
Y= ax+b → Y = a.(log10Sq) + b
Y: Ct
X: log10Sq
Sq: Starting quantity
Sq= 10 [(Ct-b)/a]](https://image.slidesharecdn.com/94buggrfas1h7zgicjvw-signature-f61437bff2a8cb4e574f63531b9b2080ba8ca20005d6f6ed68530806aa7f7580-poli-150319062414-conversion-gate01/85/ly-thuy-t-Realtime-31-320.jpg)
More Related Content
lý thuyết Realtime
- 1. Trao đổi trựctuyến tại: http://www.mientayvn.com/Y_online.html
- 2. TS. BS. ĐỗThị Thanh Thủy Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng
- 3.
- 4. PCR VÀ GIỚIHẠN CỦA PCR PCR và phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1. Phát hiện điểm cuối (End-Point Detection) 2. Độ đặc hiệu kém 3. Độ nhạy thấp 4. Độ phân giải kém 4. Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR 5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm 6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư)
- 5. REALTIME PCR → Real-timePCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt. Kiểm soát tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR tạo thành trong từng chu kỳ nhiệt - Real time). Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang.
- 6.
- 7. HOẠT ĐỘNG CỦAMÁY REALTIME PCR Kính lọc kích thíchKính lọc phát sáng Nguồn: laser, LED, đèn tungsten-halogen Detector: CCD (charge coupled device), PMT (photomultiplier tube)
- 8. 1 10 102103 104 105 106 1 10 102 103 104 105 106 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41 Cycle 13 Cycle 11
- 9. 1 10 102103 104 105 106 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41 Cycle 13 Cycle 11 1 10 102 103 104 105 106 C.41 C.39 C.36 C.33 C.31 C.29 C.34 Mẫu chưa biết [C] Standard curve
- 10. PHƯƠNG TRÌNH TÍNHSỐ COPY/MẪU
- 11. Threshold: điểm bắtđầu quan sát được tín hiệu huỳnh quang phát ra, tại thời điểm này tín hiệu do sản phẩm PCR > tín hiệu nền. - Ct (Threshold cycle): là số chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của sản phẩm khuếch đại vượt qua ngưỡng. -Động học RealtimePCR Phân tích tiến trình phản ứng trong mỗi chu kỳ nhiệt nhờ computer THỜI ĐIỂM PHÁT HIỆN TÍN HIỆU
- 12.
- 13. REALTIME PCR Rael timePCR định lượng số copies trong giai đoạn tăng lũy thừa Log view
- 14. Primers Taq polymerase dNTP PCR buffer MgCl2 Real-time PCRMIX Target DNA (Template) Real-time PCR mix Chất phát huỳnh quang 1. Chất nhuộm khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang: ♦ Ethidium bromide ♦ SYBR green 1 2. Probe đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang ♦ Taqman probe. ♦ Molecular Beacon ♦ Hybridization probe… TÍN HIỆU HUỲNH QUANG TRONG REAL TIME PCR
- 15. SYBR GREEN I không SYBR GREENI Không phát huỳnh quang SYBR GREEN I Huỳnh quang
- 16. SYBR GREEN I DNAcaàn tìm DNA khoâng caàn tìm Khoâng phaân bieät ñöôïc saûn phaåm ñaëc hieäu hay khoâng ñaëc hieäu
- 17. Tính đặchiệu không cao. Tầm soát sản phẩm trước khi sử dụng probe đặc hiệu Thực hiện khi PCR đã được tối ưu hóa, không có primer dimer, không có amplicon không đặc hiệu SYBR GREEN I
- 18. PHÂN BIỆT SẢNPHẨM ĐẶC HIỆU (Melting Curve) Mục đích: phân tích tính đặc hiệu của sản phẩm sau khuếch đại Melting temperature (Tm) của dsDNA: –To tại đó ½ pt DNA ở dạng sợi đôi, ½ sợi đơn –Phụ thuộc chiều dài và thành phần nucleotide Thực hiện: tăng To, DNA tách nhau ra, Đưa To về 55oC. Tăng dần nhiệt độ, chụp hình tín hiệu huỳnh quang mỗi 0,5oC.
- 19.
- 20. PHÂN BIỆT SẢN PHẨMĐẶC HIỆU (Melting Curve)
- 21. REAL TIME PCRSỬ DỤNG TAQMAN PROBE 1. ƯU ĐIỂM Probe đặc hiệu Multiplex PCR 2. NHƯỢC ĐIỂM Giá thành cao
- 22. NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG Taqpolymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease
- 23. 5’ 5’ 3’ 3’ dNTPs DNA Polymerase beàn nhieät Primers Tubephản ứng R Q Probe 1. Biến tính 94oC 2. Bắt cặp và kéo dài 60oC Taq l R Q NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG
- 24. 5’ 3’ RQ 5’ 3’ Q Taq R 5’2.Phân cắt 3. Hoàn tất tổng hợp 5’ 3’ Taq R 5’ 4. Phát hiện 5’ 3’ Taq R 5’ 5’ 3’ 1. Kéo dài mạch Taq R RQ Primers có nhiệt độ bắt cặp ở 60oC và Taqman probe ở 70oC
- 25. F DNA probe CG C A A A G T A T CA T C C C T C C A GG G C G G C C A A T T Q DNA đích F GC A A A G T A T C A T C C C T C C AG Q CG T T T C A T A G T A GGGA GG T A Stem Loop Reporter Dye REALTIME PCR SỬ DỤNG BEACON PROBE
- 26. Giai đoạn biếntính NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG
- 27. Giai đoạn bắtcặp NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG
- 28. Giai đoạn kéodài NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG
- 29. 1) Reaction efficiency(PCR efficiency): E%, sử dụng đường cong chuẩn (standard curve). Tối ưu E 100% thì E=2 2) Reproducibility/linearity (R=Corelation coefficiency) sử dụng giá trị R hay R2 =1 đánh giá độ chính xác trong thao tác 3) Specificity sử dụng Melting Curve 4) Contamination sử dụng NC ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR
- 30. E%=PCR efficiency (90%-105%) R=Corelationcoefficiency (>0.990) ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR E = 10-1/slope E% = (E-1) x 100% E=10-1/slope = 10 -1/-3.425 = 1.959 E% =(1.959 - 1) x 100% = 95,9
- 31. E%=PCR efficiency (90%-105%) R=Corelationcoefficiency (>0.990) ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR Y= ax+b → Y = a.(log10Sq) + b Y: Ct X: log10Sq Sq: Starting quantity Sq= 10 [(Ct-b)/a]
- 32. ỨNG DỤNG CỦAREALTIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ NGHIÊN CỨU
- 34. Đơn giản, nhanhchóng, dễ phân tích kết quả. Tránh được ngoại nhiễm vì không cần phân tích sau PCR. Có thể định lượng trong phạm vi lớn (log 7 đến log 8) Độ nhạy cao hơn so với PCR. Độ đặc hiệu cao hơn so với PCR Realtime PCR là công cụ phát hiện tác nhân gây bệnh tốt nhất trong mẫu bệnh phẩm (vi sinh, ký sinh lâm sàng, vi sinh thực phẩm) Độ nhạy tốt Không ngoại nhiễm Thích hợp cho lâm sàng Độ đặc hiệu tốt Công cụ tốt nhất
- 35. • Xác địnhsố lượng virus (HIV, HBV, HCV...) Theo dõi điều trị • Xác định số lượng khởi đầu của các tác nhân gây bệnh khẩn cấp trong mẫu bệnh (Sốt xuất huyết, H5N1, H1N1..) Tiên đoán mức độ nghiêm trọng và tiên đoán kết quả Realtime PCR là công cụ định lượng tác nhân gây bệnh tốt nhất trong mẫu bệnh phẩm Tình trạng nhiễm khuẩn thực phẩm: Samonella, Campyllobacter….
- 36. Realtime PCR ứngdụng trong ung thư học lâm sàng Phát hiện sự tồn lưu ác tính trong bệnh ung thư -Trong bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (CML) và bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho (ALL), dùng realtime PCR định lượng 2 tổ hợp gen khác nhau gây bệnh là p190 và p210. So sánh kết quả định lượng trước và sau điều trị giúp đánh giá mức độ tồn lưu ác tính của bệnh.
- 37. Realtime PCR trong nghiêncứu biểu hiện gen Ứng dụng rất rộng rãi trong việc đánh giá mức độ biểu hiện gen. VD: Sau khi tế bào được xử lý với kháng nguyên hay hóa chất, tìm hiểu sự đáp ứng của TB trong mức độ biểu hiện của gen đích.
- 38. Các ứng dụngkhác của Real-Time PCR Phát hiện GMO (genetically modified organism) hay GEO (genetically engineered organism): sinh vật biến đổi gene. Phát hiện SNP (single nucleotide polymorphism) (genotypic/allelic discrimination)