Nghiên cứu phát hiện gen Survivin từ các tế bào ung thư vú quangthuboss@gmail.com

1. NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN GEN SURVIVIN
TỪ CÁC TẾ BÀO UNG THƯ VÚ
HỌC VIÊN: HOÀNG HẢI YẾN
THẦY HƯỚNG DẪN: PGS. TS. PHẠM THIỆN NGỌC
PGS. TS. LÊ QUANG HUẤN
LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

2. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vú (UTV) là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ
trên thế giới, chiếm 30% và có tỷ lệ tử vong cao thứ 2
trong số các loại ung thư.
Nếu phát hiện sớm thì tỷ lệ chữa khỏi và sống sót rất
cao (90% nếu phát hiện ở giai đoạn đầu).
Các phương pháp chẩn đoán hiện nay đều có những ưu
điểm và nhược điểm.
Việc phát hiện và ứng dụng phương pháp mới trong
chẩn đoán và theo dõi điều trị UTV là cần thiết

3. ĐẶT VẤN ĐỀ
 Di căn chỉ xảy ra ở 50% UTV nguyên phát, 20-30%
BN UTV có hạch bạch huyết âm tính vẫn có di căn xa
trong vòng 5 năm.
 Có thể phát hiện sớm khối u dựa vào việc phát hiện
các CTC mang những gen chỉ thị đặc hiệu cho tế bào
khối u.
 Một số gen chỉ thị khối u đã được nghiên cứu như CK
19, mammaglobin (hMAM), Her2/neu, survivin…
 Việc lựa chọn gen chỉ biểu hiện ở bệnh UT mà không
biểu hiện ở tế bào bình thường là thực sự cần thiết.

4. ĐẶT VẤN ĐỀ
 Gen survivin được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997
có vai trò ức chế quá trình chết theo chương trình của tế
bào, biểu hiện mạnh trong các mô bào thai đang phát
triển và trong nhiều loại UT.
 Gen survivin không biểu hiện ở các mô bình thường.
 Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về gen survivin
trong chẩn đoán, tiên lượng và điều trị UT.
 Việt Nam đã có một số nghiên cứu về gen UT những vẫn
chưa có nghiên cứu nào về gen survivin.

5. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1. Xây dựng quy trình phát hiện gen survivin từ
các tế bào ung thư vú.
2. Bước đầu nhận xét giá trị của xét nghiệm
phát hiện gen survivin trong chẩn đoán ung
thư vú.

6. DỊCH TỄ HỌC UNG THƯ VÚDỊCH TỄ HỌC UNG THƯ VÚ
 Theo tổ chức chống ung thư thế giới, năm 2008 có
khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh UTV trên toàn thế
giới và 458.500 ca tử vong.
 Tại Mỹ, năm 2010, trên 207.000 phụ nữ mắc bệnh
UTV mới được chẩn đoán và 39.800 ca tử vong.
 Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi năm
2010 là:
 Hà Nội: 30/100.000 dân.
 TPHCM: 20/100.000 dân.

7. TIẾN TRIỂN UNG THƯ VÚTIẾN TRIỂN UNG THƯ VÚ
Biểu hiện lâm sàng của ung thư vú kéo dài và khác
nhau giữa các bệnh nhân.
 Giai đoạn tại chỗ: Ung thư nguyên phát ở tuyến vú.
 Giai đoạn lan tràn:
Theo đường bạch huyết.
Theo đường máu: di căn tới xương, phổi, gan,
não. Khoảng 20% bệnh nhân hạch bạch huyết
âm tính có di căn xa.

8.  Hệ thống xếp giai đoạn TNM theo Ủy ban liên kết
chống ung thư Mỹ - AJCC (2004):
T: Khối u nguyên phát (T0, Tis , T1, T2, T3, T4 )
N: Hạch vùng (N0, N1, N2, N3 )
M: Di căn xa (M0, M1
GIAI ĐOẠN CỦA UNG THƯ VÚ

9. PHÂN LOẠI GIAI ĐOẠN
Giai đoạn 0: TisN0M0.
Giai đoạn I: T1N0M0.
Giai đoạn IIa: T0N1M0 , T1N1M0, T2N0M0.
Giai đoạn IIb: T2N1M0, T3N0M0.
Giai đoạn IIIa: T0N2M0, T1N2M0, T2N2M0, T3N1M0, T3N2M0.
 Giai đoạn IIIb: T4N0M0, T4N1M0, T4N2M0.
Giai đoạn IIIc: T bất kỳ, N3, M0.
Giai đoạn IV: T bất kỳ, N bất kỳ, M1.

10. CÁC DẤU ẤN UNG THƯ VÚ
ĐANG ĐƯỢC SỬ DỤNG HIỆN NAY
Dấu ấn là protein: CEA, CA15-3.
Dấu ấn là enzym: CK-BB.
Dấu ấn là receptor: ER và PR, EGFR.
Các dấu ấn này có độ nhạy không cao nên thường
được sử dụng để đánh giá tiên lượng và theo dõi
điều trị.

11. GEN SURVIVIN
Gen survivin là thành viên thuộc nhóm các protein ức
chế sự chết theo chương trình của tế bào. Gen survivin
có chiều dài 15kb, nằm ở vị trí NST 17q25, gồm 142
aa với TLPT khoảng 16,3 kDa.

12. GEN SURVIVIN
mRNA survivin tiền thân tạo thành mRNA trưởng thành
với 5 biến thể ghép nối

13. VAI TRÒ CỦA GEN SURVIVIN
1. Vai trò ức chế quá trình chết theo chương trình
tế bào bằng cách ức chế caspase 3 và 7.
2. Điều hòa phân chia tế bào ở pha G2 /M.
3. Vai trò tăng sinh mạch tế bào nội mạc làm cho
tế bào này có khả năng tồn tại và có chức năng
bảo vệ tế bào UT.

14. GEN SURVIVIN TRONG UNG THƯ VÚ
Gen survivin đã được phát hiện tới 69,2 -
93,7% ở mô bệnh nhân UTV nguyên phát
và 50,7% ở máu BN UTV.
 Biểu hiện của gen survivin càng cao thì
tiên lượng sống của bệnh nhân càng giảm
và có nhiều khả năng bệnh tái phát.

15. ĐỐI TƯỢNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

16. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
 Nhóm bệnh: 13 mẫu mô và máu của bệnh
nhân UTV giai đoạn II, III đã được chẩn đoán
lâm sàng và mô bệnh học.
 Tiêu chuẩn loại trừ: có bất kỳ một khối u hay
ung thư một cơ quan nào khác.
 Nhóm chứng: 05 bệnh nhân u xơ vú lành tính.

17. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
 Máy móc và dụng cụ nghiên cứu thuộc phòng
công nghệ tế bào động vật (Viện công nghệ
sinh học).
 Hóa chất nghiên cứu: Các hoá chất có độ tinh
sạch cao của các hãng có uy tín được sử dụng
trong các nghiên cứu sinh học phân tử của
Qiagen, Invitrogen, Roch …

18. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
 Thời gian nghiên cứu:
 Từ tháng 3/2011 đến tháng 11/2011.
 Địa điểm nghiên cứu:
 Phòng công nghệ tế bào động vật, Viện công
nghệ sinh học.

19. QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU
Dòng tế bào tế bào UTV
KPL4
Tách RNA
Real-time RT-PCR
PCR giải trình tự
Xây dựng đường
chuẩn real–time
RT-PCR
BN K vú giai đoạn I, II, III BN U xơ vú lành tính
Máu
(Lấy 2 ml trước khi mổ)
Mô
(Lấy ngay khi mổ, 30 mg)
Tách RNA
Tạo cDNA
Thiết kế mồi survivin
PCR với mồi GAPDH/ survivin
Điện di sản phẩm RT-PCR
PCR với mồi GAPDH/ survivin
Điện di sản phẩm RT-PCR
Tạo cDNA
Phân tích kết quả
Điện di, đo mật độ quang
So sánh trình tự gen survivin với
trình tự trên ngân hàng gen
Điện di, đo mật độ quang
Nuôi cấy TB
1. Xây dựng quy trình phát hiện
và định lượng gen survivin
2. Áp dụng quy trình định lượng gen
survivin đối với các mẫu bệnh phẩm

20. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

21. 1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ
ĐỊNH LƯỢNG GEN SURVIVIN

22. NUÔI CẤY TẾ BÀO DÒNG UNG THƯ VÚ KPL4
Kết quả nuôi cấy tế bào KPL4: thu được 2x106
tế bào

23. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT RNA TỔNG SỐ
 Hình ảnh điện di trên gel agarose 0,8% sản phẩm RNA
tách chiết từ tế bào KPL4
• Đường chạy 1-2: sản phẩm RNA tách chiết từ tế bào KPL4

24. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT RNA TỔNG SỐ
Nồng độ và độ tinh sạch của RNA đã tách chiết
từ tế bào KPL4
Mẫu tế bào Nồng độ (ng/µl) OD260
/OD280
KPL4 (1) 474,73 1,9
KPL4 (2) 226,17 1,94

25. THIẾT KẾ MỒI GEN SURVIVIN
Dựa vào phần mềm chuyên dụng primer
3, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi gen
survivin có trình tự
 Survivin F: 5’-AAGGACCACCGCATCTCTAC-3’
 Survivin R: 5’-TCATCTGGCTCCCAGCCTTC-3’

26. THIẾT KẾ MỒI GEN SURVIVIN
Kiểm tra cặp mồi PCR khuếch đại đoạn gen survivin
bằng phần mềm protocol-online.org

27. TỔNG HỢP cDNA
• Tổng hợp cDNA với cặp mồi đặc hiệu GAPDH F/R.
Hình ảnh điện di trên gel agarose 0,8% sản phẩm RT-PCR của tế bào KPL4
Đường chạy 1-2: sản phẩm RT-PCR của mẫu tế bào KPL4
Đường chạy M: Thang chuẩn 1 kb

28. PCR KHUẾCH ĐẠI GEN SURVIVIN
Sản phẩm cDNA được sử dụng làm khuôn cho phản ứng
PCR với cặp mồi đặc hiệu gen survivin F/R
 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR mẫu
tế bào KPL4
Đường chạy 1-2: sản phẩm RT-PCR của
mẫu tế bào KPL4
Đường chạy M: thang DNA chuẩn 1kb
Sp PCR

29. PCR GIẢI TRÌNH TỰ
Sản phẩm PCR với mồi gen survivin F/R được xác
định trình tự trực tiếp trên máy xác định trình tự tự
động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems).
Kết quả xác định trình tự nucleotid đoạn gen mã hóa survivin

30. TRÌNH TỰ NUCLEOTID VÀ AMINO ACID
SUY DIỄN CỦA ĐOẠN GEN SURVIVIN
Kết quả xác định trình tự nucleotid đoạn gen mã hóa survivin

31. TRÌNH TỰ GEN SURVIVIN TRONG
GENBANK

32. ĐƯỜNG CHUẨN REAL-TIME RT-PCR
 Kết quả real-time RT-PCR khi
xây dựng đường chuẩn nồng
độ
 S1: Đường chạy với cDNA từ
mẫu 2x104
tế bào
 S2: Đường chạy với cDNA từ
mẫu pha loãng 2x103
tế bào
 S3: Đường chạy với cDNA từ
mẫu pha loãng 2x102
tế bào
 S4: Đường chạy cDNA từ mẫu
pha loãng 2x101
tế bào
S1
S2
S3
H2O
S4

33. KẾT QUẢ REAL-TIME RT-PCR KHI XÂY
DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN
Số lượng tế
bào UTV
Ký hiệu Cp Số bản
sao
Chuẩn
2x104
S1 23,63 1,00E6 1,00E6
2x103
S2 29,06 1,00E5 1,00E5
2x102
S3 32,99 9,64E3 1,00E4
2x101
S4 35,54 1,01E3 1,00E3
* Trong mẫu phân tích có lượng tế bào KPL4 cô đặc/1 ml dịch
phân tích có 20 TB ung thư vú thì tín hiệu huỳnh quang nhận
biết được ở chu kỳ 35,54.
* So sánh kết quả Shang Mian Yie sử dụng KT RT-PCR Elisa
phát hiện được 1 TB/2 ml máu.

34. 2.ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GEN
SURVIVIN ĐỐI VỚI CÁC MẪU BỆNH
PHẨM

35. XÉT NGHIỆM SINH HÓA CỦA BN UTV VÀ
U XƠ TUYẾN VÚ
Kết quả CA15-3 phù hợp với NC của Hou M.F và cs (1999): 15,1 ± 6,6;
Đoàn Lực và CS (2000): 13,4 ± 4 trên UTV chưa di căn

36. PHÂN LOẠI MÔ BỆNH HỌC VÀ TNM

37. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT RNA TỔNG SỐ
 Hình ảnh điện di trên gel agarose 0,8% sản phẩm RNA tách chiết từ mẫu bp
• Đường chạy 1-2: sản phẩm RNA tách chiết từ mẫu mô
• Đường chạy 3-4: sản phẩm RNA tách chiết từ mẫu máu
• Đường chạy 5: Sản phẩm RNA tách chiết từ mô u xơ
1 2 3 4 5

38. Mẫu Họ tên Tuổi Chẩn đoán
RNA tách từ mô RNA tách từ máu
Nồng độ
(ng/µl)
OD260/280
Nồng độ
(ng/µl)
OD260/280
1 Phạm Thanh T 39 UTV gđ IIIb
313,98 2,03 133,33 1,81
2 Tô Thị D 66 UTV gđ IIb
163,04 2,05 101,95 1,93
3 Nguyễn Thị H 55 UTV gđ IIb
163,38 1,98 91,62 1,85
4 Tô Thị H 61 UTV gđ IIb
354,82 2,01 153,43 1,96
5 Tô Thị S 74 UTV gđ IIb
309,1 2,05 146,52 1,85
6 La Thu H 36 UTV gđ IIb
307,50 2,01 90,06 1,89
7 Phan Thị Ơ 71 UTV gđ IIb
333,79 1,91 89,89 1,9
8 Nguyễn Thị H 53 UTV gđ IIb
226,08 1,83 116,79 1,85
9 Ng Thanh H 39 UTV gđ IIb
135,69 1,82 97,85 1,95
10 Nguyễn Thị L 65 UTV gđ IIIb
232,52 1,95 75,78 1,89
11 Đoàn T.Lệ K 61 UTV gđ I 102,49 2,0 101,5 2,06
12 Vũ Thị Th 33 UTV gđ IIIb
156,25 2,06 88,7 2,03
13 Kiều Thị Th 56 UTV gđ IIb
268,34 1,97 121,19 1,96
14 Ngô Thị P 51 U xơ vú P 248,79 1,99
15 Nguyễn Thị T 44 U xơ vú P 251,1 2,01
16 Hoàng Thị M 34 U xơ vú T 145,5 1,89
17 Hoàng Thị T 50 U xơ vú P 189,7 1,8
NỒNG ĐỘ VÀ ĐỘ TINH SẠCH RNA TỪ
MẪU BỆNH PHẨM

39.  Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR với mồi GAPDH từ mẫu bệnh phẩm
Đường chạy 1-2: sản phẩm khuếch đại GAPDH từ mẫu mô UTV
Đường chạy 3-4: sản phẩm khuếch đại GAPDH từ mẫu máu UTV
Đường chạy 5: sản phẩm khuếch đại GAPDH từ mô u xơ vú lành tính
Đường chạy M: thang DNA chuẩn 1kb
TỔNG HỢP cDNA

40. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR với mồi survivin từ mẫu u xơ vú
 Đường chạy 1 - 5: sản phẩm RT-PCR của mẫu u xơ vú lành tính
 Đường chạy M: thang DNA chuẩn 1kb
M 1 2 3 4 5
500 bp
250 bp
MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SURVIVIN

41. MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SURVIVIN
 Hình ảnh điện di sản phẩm RT- PCR trên mẫu mô UTV với mồi
survivin.
 Đường chạy 1-13: sản phẩm khuếch đại survivin từ mẫu mô UTV
 Đường chạy M: thang DNA chuẩn 1kb
500 bp
250 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M
Survivin

42. Hình ảnh điện di sản phẩm RT- PCR từ mẫu máu UTV với mồi survivin.
Đường chạy 1-13: sản phẩm khuếch đại survivin từ mẫu máu UTV
Đường chạy M: thang DNA chuẩn 1kb
MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SURVIVIN
500 bp
250 bp
Survivin
1000bp

43.  Kết quả realtime RT-
PCR gen survivin PCR
trên mẫu máu bệnh nhân
ung thư vú
Số 1 - 9: Mẫu máu UTV
Số 30: H2
0
ĐỊNH LƯỢNG GEN SURVIVIN BẰNG REAL-TIME
RT-PCR

44. Kết quả realtime RT-PCR
gen survivin PCR trên
mẫu mô bệnh nhân u xơ
vú và UTV
Số 1 - 2: Mẫu mô u xơ vú
Số 3 – 8: Mẫu mô UTV
Số 9: H2
0
ĐỊNH LƯỢNG GEN SURVIVIN BẰNG REAL-TIME
RT-PCR

45. Hình ảnh phân tích với
melting curve của phản
ứng real-time RT-PCR
với cặp mồi survivin
Biểu đồ A: Biểu đồ đỉnh
chảy cho phép xác định
Tm
.
Biểu đồ B: Biểu đồ chảy
được máy hiển thị real-
time trong suốt quá trình
thực hiện chương trình
luân nhiệt melt – curve
PHÂN TÍCH MELTING CURVE

46. Số chu kỳ (Cp) và bản sao trên mẫu có biểu hiện (+) với gen survivin
MS Họ tên Giai đoạn UTV Hạch
Mô Máu
Cp
Số bản
sao
Cp Số bản sao
1 Phạm Thanh T UTV gđ IIIb + 31,24 3,22E4 30,72 4,07E4
4 Tô Thị H UTV gđ IIb + 31,48 2,77E4 Không xác định
5 Tô Thị S UTV gđ IIb _ 35,88 Không xđ
7 Phan Thị O UTV gđ IIb + 30,01 6,44E4 Không xác định
8 Nguyễn Thị H UTV gđ IIb + 30,57 4,79E4 Không xác định
9 Ng Thanh H UTV gđ IIb _ 33,85 4,82E3 Không xác định
10 Nguyễn Thị L UTV gđ IIIb + 34,85 1,96E3 30,69 4,47E4
11 Đoàn T.Lệ K UTV gđ I _ 29,67 7,62E4 Không xác định
12 Vũ Thị Th UTV gđ IIIb + 32,17 1,75 E4 29,74 7,38E4
13 Kiều Thị Th UTV gđ IIb _ 31,35 3,02E4 Không xác định
NHẬN XÉT GIÁ TRỊ CỦA XN PHÁT HIỆN
GEN SURVIVIN TRONG CHẨN ĐOÁN UTV

47. Các chỉ số lâm sàng n Tỷ lệ phát hiện trên máu (%) Tỷ lệ phát hiện trên mô (%)
Tuổi
<50
>50
04
09
02/ 04(50%)
01/ 09 (11,11%)
03/ 04 (75%)
06/ 09 (66,67%)
Kích thước u
T2
T3
T4
10
02
01
01/10 (10%)
01/ 02 (50%)
01/ 01 (100%)
06/10 (60%)
02/ 02 (100%)
01/ 01 (100%)
Giai đoạn (TNM)
I
II
III
01
09
03
0/ 01(0%)
0/ 09 (0%)
03/ 03 (100%)
01/ 01 (100%)
05/ 09 (55,56%)
03/03 (100%)
Di căn hạch
Âm tính
Dương tính
07
06
0/ 07 (0%)
03/ 06 (50%)
03/ 07 (42,86%)
06/ 06 (100%)
Mô bệnh học
Thể ống xâm nhập
Thể tiểu thùy
Thể tủy
Thể nhày
10
01
01
01
03/10 (40%)
0/ 01(0%)
0/ 01(0%)
0/ 01(0%)
06/10 (60%)
01/01 (100%)
01/01 (100%)
01/01 (100%)
MỐI LIÊN QUAN CỦA XN GEN SURVIVIN
VỚI CÁC CHỈ SỐ LÂM SÀNG

48. KẾT LUẬNKẾT LUẬN
1. Đã xây dựng được quy trình phát hiện và định lượng tế
bào UTV dựa trên số lượng bản sao gen survivin đối với
dòng tế bào KPL4 với ngưỡng xác định 20 tế bào/1 ml
dịch nuôi cấy.
2. Áp dụng quy trình định lượng gen survivin từ tế bào UTV
bằng kỹ thuật reat-time RT-PCR đối với một số mẫu mô
và mẫu máu của các bệnh nhân UTV giai đoạn I, II, III.
Bước đầu nhận xét giá trị của xét nghiệm gen survivin
trong chẩn đoán UTV.

49. KẾT LUẬNKẾT LUẬN
 Kết quả phát hiện được 9/13 mẫu mô và 3/13 mẫu máu có
mức biểu hiện cao với gen survivin. Không phát hiện có sự biểu
hiện của gen survivin ở mô vú của bệnh nhân u xơ tuyến vú
lành tính.
 Phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư trong máu và mô
bệnh nhân UTV có giá trị chẩn đoán, tiên lượng và theo dõi điều
trị đặc hiệu hơn những xét nghiệm dấu ấn UT thường làm như
CA 15-3.
 Phát hiện mức độ biểu hiện gen survivin trên cả mẫu mô và
mẫu máu của 3 bệnh nhân UTV giai đoạn III.

50. KIẾN NGHỊKIẾN NGHỊ
 Nên có những nghiên cứu tiếp theo với số lượng BN
lớn hơn để có thể đánh giá chính xác sự biểu hiện của
gen survivin ở trên các nhóm bệnh nhân UTV ở các
giai đoạn khác nhau, các thể mô bệnh học khác nhau
nhằm góp phần cùng với những phương pháp chẩn
đoán khác chẩn đoán sớm, tiên lượng và theo dõi điều
trị bệnh nhân UTV.

51. Hoàng Hải YếnHoàng Hải Yến