Ilya Azizov: Polymyxin, fosfomycin, tigecycline: resistance mechanisms and methods of susceptibility testing

1. Азизов Илья Сулейманович, д.м.н., профессор
Полимиксины, фосфомицин, тигециклин:
механизмы резистентности и методы
определения чувствительности
Смоленск, НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОГО СЕМИНАРА «АКТУАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ»

3. map.antibiotic.ru (05/02/2018)
0% 20% 40% 60% 80% 100% 0% 20% 40% 60% 80% 100%
A.baumanii P.aeruginosa K.pneumoniae
ND

5. Получен из Paenibacillus polymyxa
(Bacillus polymixa) в 1947 году, основное
действуюшее вещество колистин
метансульфонат (колистиметат)
Полимикстин В R6–D-фенилаланин
Полимикстин E (колистин) R6–D-лейцин
• Активен только в отношении Грам-
бактерий
R6
Gales A.C., Jones R.N., Sader H.S. // J Antimicrob
Chemother 2011; 66: 2070–2074
Полимиксин Б и колистин показали
идентичные in vitro спектр и активность
против тестированных микроорганизмов…

6.  Концентрационно-зависимый препарат, T½ 3-4 часа
 Практически не всасывается и не проходит через
ГЭБ
 При парентеральном введении не метаболизируется,
в неизменном виде выводится через почки или с
желчью
 При приеме внутрь в ЖКТ не всасывается
 Плохо проникает и накапливается в тканях
 Нефротоксичность (до 10-18%)
 Нейротоксичность
 Аллергические реакции

7. Ca2+
Mg2+
-
-
-
--
-
-
--
Периплазматическое
пространство
Нарушение функционирования
мембраносвязанных белковых
комплексов
Внеклеточное
пространство
O
.
2,H2O2, .OH

8.  Природная устойчивость
 Morganella morganii
 Proteus mirabilis
 Proteus vulgaris
 Proteus penneri
 Providencia rettgeri
 Providencia stuartii
 Serratia marcesces
 Yersinia pseudotuberculosis
 Burkholderia cepacia complex
 Elizabetkhingia (Flavobacterium) meningoseptica
Клинические рекомендации Определение чувствительности микроорганизмов
к антимикробным препаратам / Версия-2015-02

9. Pieter De Maayer et al. // BMC Genomics. 2016; 17: 377
R. Gupta // IJSEM. (2016), 66, 5575–5599
Enterobacter- Escherichia
clade
сем.Enterobacteraceae
Erwinia - Pantoea clade
сем. Erwiniaceae
Pectobacterium-
Dickeya clade
сем.Pectobacteriacae
Hafnia- Edwardsiella
clade
сем. Hafniaceae
Yersinia-Serratia
clade
сем.Yersiniaceae
Budvicia clade
сем. Budviciaceae
Ожидаемые изменения в экспертных правилах для порядка Enterobacterales
Proteus-
Xenorhabdus
clade
сем.Morganellaceae
Plesiomonas

10. 1- Arroyo LA, Herrera CM, Fernandez L, Hankins JV, Trent MS, Hancock RE. The pmrCAB operon mediates polymyxin resistance in Acinetobacterbaumannii ATCC 17978 and clinical isolates through
phosphoethanolamine modification of lipid A. Antimicrob Agents Chemother. 2011;55(8):3743–51.
2 - Moffatt JH, Harper M, Harrison P, Hale JD, Vinogradov E, Seemann T, et al. Colistin resistance in Acinetobacterbaumannii is mediated by complete loss of lipopolysaccharideproduction. Antimicrob Agents
Chemother. 2010;54(12):4971–7.
3 - Cannatelli A, D’Andrea MM, Giani T, et al. In vivo emergence of colistin resistance in Klebsiellapneumoniae producing KPC-type carbapenemases mediated by insertional inactivation of the PhoQ/PhoP mgrB
regulator. Antimicrob Agents Chemother 2013; 57: 5521–26.
4 - Pilonieta M.C. et al. A protein important for antimicrobial peptide resistance, YdeI/OmdA, is in the periplasm and interacts with OmpD/NmpC // J Bacteriol. 2009 Dec;191(23):7243-52.
• Мутации в хромосомных генах
• Модификация ЛПС за счет двух
компонентной системы pmrA/pmrB и
изменения заряда мембраны1,3,4
• Полная утрата ЛПС у A.baumanii за счет
одновременных мутаций в генах lpxA,
lpxC и lpxD 2
Эффлюкс
Ферментативная
инактивация
Потеря мишени
Нарушение
проницаемости
Метаболический
шунт

11. 1 - Campos MA, Vargas MA, Regueiro V, Llompart CM, Albertí S, Bengoechea JA. Capsule polysaccharidemediates bacterial resistance to antimicrobial peptides. Infect.Immun. 72(12), 7107–7114 (2004).
2 - Contribution of EmrAB efflux pumps to colistin resistance in Acinetobacter baumannii. Lin, MF., Lin, YY. & Lan, CY. J Microbiol. (2017) 55: 130. doi:10.1007/s12275-017-6408-5
3 - Pilonieta M.C. et al. A protein important for antimicrobial peptide resistance, YdeI/OmdA, is in the periplasm and interacts with OmpD/NmpC // J Bacteriol. 2009 Dec;191(23):7243-52.
• Мутации в хромосомных генах
• Капсула может препятствовать
проникновению полимиксина в
околомембранное пространство1
• Изменение тропности к поринам
OmpD/OmpF периплазматических
белковYdeI иYgiW3
• Модификация ЛПС за счет двух
компонентной системы pmrA/pmrB и
изменения заряда мембраны1,3,4
• Гены оперона adeA-C и его
регуляторного гена adeR (эффлюкс2)
• Полная утрата ЛПС у A.baumanii за счет
одновременных мутаций в генах синтеза
ЛПС lpxA, lpxC и lpxD 2
Эффлюкс
Ферментативная
модификация ЛПС (mcr)
Потеря мишени
•Плазмидная
mcr-1/9 (фосфоэтаноламинотрансфераза → модификация ЛипидаА
Нарушение
проницаемости

12. 1 - van Boeckel et al. Global trends in antimicrobial use in food animals // Proceedings of the
National Academy of Sciences 112(18) · 2015
2- Yi-Yun Liu*, Yang Wang*, Timothy R Walsh / Lancet Infect Dis 2016; 16: 161–68
3 - https://nplus1.ru/news/2015/11/19/panresistance
Используется полимиксина
3
13 000 тонн ежегодно
или
35 616 кг в сутки!

13. копий в 1 г
фекалий
грамм
фекалий в
сутки
размер
популяции
общее число
копий в сутки
СелекцияАМП
Глобальное
загрязнение
Вертикальное
распространение
Горизонтальное (межвидовое)
распространение

14.  Проведено детектирование 25 антибиотиков на удалении 2, 3, 5 км от берега
 Суммарное загрязнение АМП морской воды достигало 1349.2 ng/L
 Наличие углеродистых растворителей, солей и удаление от береговой линии
коррелировали с концентрацией АМП в морской воде
 Скорость снижения концентраций АМП была выше чем в заливе Bohai
 Смесь АМП может наносить больший экологический ущерб
Du J., Zhao H., Liu S. et al. Science of the Total Environment 595 (2017) 521–527

15. Zhejiang
Guangdong
21 621 штаммов Enterobacteriacae, Acinetobacter spp. и
P.aeruginosa
mcr-1 pos 76 из 5332 E.coli (1%)
13 из 348 K.pneumoniae (<1%)
1 из 890 E.cloacae (<1%)
1 из 162 E.aerogenes (<1%)
mcr-1 ассоциирована с мужским полом (p=0,011);
иммуносупрессией (p=0,011), предшествующим применением
совместным карбапенемов (p=0,02) и фторхинолонов перед
госпитализацией (p=0,017)
Wang Y, Tian G.B., Zhang R. et al. Lancet Infect Dis 2017 http://dx.doi.org/10.1016/ S1473-3099(17)30053-1

16. Kwang Seung Park. BioMedical Research, 2016, 0976-1683
Hasman H. et al. // Euro Surveill. 2015;20(49):pii=30085.
Rhouma M. et al. // Front Microbiol. 2016 11;7:1789.
Sébastien Matamoros et al. Genetic diversity of colistin-resistant mcr-1-carrying E. coli isolates from global travellers // OLB06 ECCMID 2017
ST131
ST156
20,6%
22,0%
13,2%
2,0%
0,7%
0,5%
ST744 (красным цветом указан
процент изолятов от
животных)
ST101

17. Sun J. et al. Trends Microbiol. 2018 Mar 7. pii: S0966-842X(18)30042-8. doi: 10.1016/j.tim.2018.02.006
(c дополнениями)
 Распространение в составе клонов высокого эпидемического риска
 Распространение с животными и человеческими изолятами, пищевыми
продуктами
 Распространение преимущественно в составе фекальных изолятов
 Широкий спектр генетических механизмов распространения

18. Castanheira M et al. ,2016. Antimicrob Agents Chemother 60:5623–5624. doi:10.1128/AAC.01267-16
Xavier BB, Lammens C, Ruhal R Euro Surveill. 2016;21(27):pii=30280. DOI: http://dx.doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2016.21.27.30280
Aycan Gundogdu et al. // ECCMID-2017 abstract PLB37
2015 г. Екатеринбург
Eco 1 штамм
МПК 4 мкг/мл

19. Sonnevend A. et al. Int J Infect Dis. 2017- 50:85–90

20.  Ретроспективно первые случаи были в 2005 году, но не исследовались и не
репортировались
 Из 49041 исследованных штаммов выявлено только в 163 изолятах (0,33%)
 Выявлено в Дании, Франции, Великобритании, Нидерландах, Бельгии
 В Бельгии 12% ассоциировано с mcr-1
 Зарегистрированы первых случаи выявления CR E.coli, несущие mcr-1 (“There are only
five human isolates out of a 508 million EU population”)
http://www.thepoultrysite.com/articles/3608/colistin-the-latest-european-antibiotic-resistance-challenge/
Число случаев выявления mcr-1 гена в EC

22. 1 - Yi-Yun Liu*, Yang Wang*, Timothy R Walsh / Lancet Infect Dis 2016; 16: 161–68
2 - Ruichao Li, Miaomiao Xie, Jinfei Zhang // J Antimicrob Chemother doi:10.1093/jac/dkw411
3 - Snesrud E. A Model for Transposition of the Colistin Resistance Gene mcr-1 by ISApl1
Antimicrob. Agents Chemother. doi:10.1128/AAC.01457-16

23. - Длина гена 1 617 bp
- MCR2-F 5′ TGGTACAGCCCCTTTATT 3′;
- MCR2-R 5′ GCTTGAGATTGGGTTATGA 3′
- Высокий уровень гомологии (76,75%)
- Ген mcr-2 выявлен в составе плазмиды IncX4 из E.сoli
- IS15956 – элемент, обеспечивающий транслокацию
- преимущественно ST10 (реже ST167)
- mcr-2 is выделен в составе IS1595 (специфичен для Moraxella spp.)
Xavier BB, Lammens C, Ruhal R, et al. . Euro Surveill. 2016;21(27):pii=30280. DOI: http://dx.doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2016.21.27.30280

24. Yin W, Li H, Shen Y, Liu Z, Wang S, Shen Z, Zhang R, Walsh TR, Shen J,
Wang Y. 2017. Novel plasmid-mediated colistin resistance gene mcr-3 in
Escherichia coli. mBio 8:e00543-17

25. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6030107/
31.08%
30.26%
39.96%
30.43%
37.85%
33.51%
37.46%

26. N.Kieffer at el. Antimicrob. Agents Chemother. doi:10.1128/AAC.00965-19
Escherichia spp.
Klebsilella spp.
Enterobacter spp.
Cronobacter spp.
Salmonella spp.
Leclercia spp.
Raoutella spp.
Phytobacter ursingii
Citrobacter sakazakii

27. E.coli TOP10
(mcr-1/pBAD) induced*
E.coli TOP10
(pBAD) uninduced
Qiue Yang et al. Nature communications | 8: 2054 |DOI: 10.1038/s41467-017-02149-0

28. Qiue Yang et al. Nature communications | 8: 2054 |DOI: 10.1038/s41467-017-02149-0

29.  Диско-диффузионный метод
 Методы разведений в бульоне/агаре
 Метод E-тест /метод индикаторных тест-
полосок (Liofilchem)
 Автоматические системы определения
чувствительности (Vitec-2, Phoenix)

30. Ошибки 5-11% - «ложноустойчивые»
Ошибки 3,5-6% «ложночувствительные»
?R
S

31.  Метод разведений в агаре дает высокую согласованность с разведением в
бульоне1;
1 – Humphries RM. Susceptibility testing of the polymyxins: where are we now?
Pharmacotherapy. 2015 Jan;35(1):22-7.
2 - Karvanen M et al. Colistin is extensively lost during normal experimental conditions. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy; San Franscisco.
Washington DC: ASM; 2011.
3 - Sei K. Colistin susceptibility testing and corona treatment. Presented at January 2012 meeting of the CLSI Subcommittee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Tempe,
AZ, January 22–24, 2012.
 Полимиксин адгезируется на поверхности полистерена2
, степень адсорбции
может зависеть от заряда, который отличается в разных лунках3
;
 Добавление 0,002% полисорбата P80 существенно снижает уровень адсорбции
полимиксина на лунках;

32. Lysis of P. aeruginosa spheroplasts by polymyxin B and polysorbate 80
(a) polysorbate 80 concentration (% w/v), ),  0,0;  0,002; , 0,008; , 0,014; , 0,002
(b) polymyxin B concentration (% w/v),  0,0;  3,0; , 9,0; , 15,0; , 21,0;  27,0.
Ordinate: % decrease in optical density [E470]
a) b)

33. Behera B, Mathur P, Das A, et al. Evaluation of susceptibility testing methods for
polymyxin. Int J Infect Dis 2010;14:e596– 601.

34. Behera B, Mathur P, Das A, et al. Evaluation of susceptibility testing methods for
polymyxin. Int J Infect Dis 2010;14:e596– 601.

35. В сравнении с референтными методом
применение метода Etest и MTS MIC занижает
результаты МПК
Konstantina Dafopoulou et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2015;59:4625-4630
BMD-P80 – разведение в бульоне с P-80
AD – разведение в агаре
Etest (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France)
MTS MIC (Liofilchem SRL, Italy)
Vitec2
KPC, OXA-48, или VIM
CPR K. pneumoniae (n = 41);
OXA-58 или OXA-23 CPR A.
baumannii (n = 20) штаммов.

36. T. Y. Tan and S. Y. Ng. Comparison of Etest, Vitek and agar dilution for
susceptibility testing of colistin. CMI, 13, 539–552
86%
согласованность
на уровне
категорий

37. Jayol A., Nordmann P., Lehours P., Poirel L., Dubois V. Clinical Microbiology and Infection, 2017
123 изолята
40 Col-NS
83 Col-S
Rapid
polymixin-NP
BDM
Phoenix 1000 EUCAST
criteria
R > 2 mg/l
Метод ColS ColR VME
BD Phoenix 40/40 76/83 12%
Rapid Polymixin-NP 39/40 82/83 1,2%
BDM 40/40 83/83 0%

38. Hindler J.A., Humphries R.M., JCM 2013, Vol.51, N6. p. 1678 –1684
А) МПКTREK Sensititre значимо (p=0,07) выше МПК BMD-T (с полисорбатом P-80).
Красным выделены серьезные ошибки (>log2) для P.aeruginosa. Ошибок по
K.pneumoniae не выявлено.
B) Корреляция между BMD-T МПК и МПКTREK Sensititre.

39. http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/General_documents/Recommendations_for_MIC_determination_of_colistin_March_2016.pdf
Рекомендации по определению МИК колистина
(полимиксина Б). Объединенная CLSI-EUCAST рабочая
группа по разработке пограничных концентраций
полимиксина
1. Тестированию должны подвергаться представители
Enterobacteriacae, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter spp. с
использованием ISO-20776 метода микроразведений в бульоне
• Должен использоваться МХБ
• Другие добавки (типа полисорбата-80 применяться
не могут
• Тестирование должно проводиться в
полистироловых планшетах
• Для тестирования должен использоваться сульфат
полимиксина
2. Оценка чувствительности другими методами включая
разведение в агаре, диск-диффузия и градиентная диффузия не
могут быть рекомендованы, пока не будет получено новых
данных. Работа над этим продолжается.

40. Критерии и группы МО Колистин (мг/мл) Полимиксин В (мг/мл)
S I R S I R
CLSI (M100-S27)
Enterobacteriaceae - - - - - -
P.aeruginosa <2 - >4 <2 4 >8
A.baumanii complex <2 - >4 <2 >4
EUCAST, 2018 (v.8.1.)
Enterobacteriaceae <2 - >2 - - -
P.aeruginosa <2 - >2 - - -
A.baumanii complex <2 - >2 - - -
Положительный контроль
E.coli ATCC 25922
P.aeruginosa ATCC 27853
Отрицательный контроль
E.coli NCTC 13846 mcr-1pos

41. www.liofilchem.com/images/brochure/ComASP-range.pdf
www.merlin-diagnostika.de
ComASP™

43.  Метод микроразведений в бульоне
 Быстрая детекция гена mcr-1 (2,3)
 Быстрая детекция продукта гена mcr-1
 …

44. D.Girlich et al. Antimicrob. Agents Chemother.,2018. doi:10.1128/AAC.01618-18
SuperpolymixinTM
CHROMID ®
Colistin R
E.coli
K.pneumoniae
S.enterica
Чувствительность (%):
86.8 (CI 95 % 74.0 – 94.0)
при 48 часовой инкубации
Специфичность (%):
CHROMID ® Colistin R 100 (CI 95% 89.3 -100)
Superpolymyxin™ 97.5 (CI95% 85.6 – 99.9)

45. Интерпретация
С
Т
Ne
g
Po
s
Inv Inv
Источник: культура
Формат: кассета
Упаковка: 20 тестов
Хранение: 4-30о
С, 24 мес.
http://ngbiotech.com/antibiotic-resistance/
*регистрируется компанией «Гем»

46.  Снижение МПК колистина в присутствии дипиколиновой кислоты (DPA
900 μg/mL) в 8 раз
Coppi M. et al. Clin Microbiol Infect. 2018;24(2):201.e1-201.e3.

47. L.Dortet et al. J Antimicrob Chemother, 2018. - doi:10.1093/jac/dky330

48. http://map.antibiotic.ru/?id=YmHxA40O726O718

49. http://map.antibiotic.ru/?id=tCzG34941244118
367 изолята из 3042

50. * в статистику брались лишь виды с природной чувствительностью
http://map.antibiotic.ru/?id=uAWEY409M539M20
610 изолятов из 8418

51. Новосибирск
2013
Тольятти
Новосибирск
Омск
Челябинск
20142015
ЧелябинскСмоленск
2016
Улан-Удэ
Москва
Северск
2017
Набережные Челны
Южно-Сахалинск
ПензаСмоленск ПензаНабережные Челны
Якутск
Екатеринбург
Краснодар
Ростов-на-Дону
0
3
1
5
2
9
0
2
0
2
4
6
8
10
12
2012 2013 2014 2015 2016 2017
Eco Kpn
ST23ST307

54. История «Игры престолов»
закончилась
Но История mcr-X только
начинается

56. Klebsiella spp.
DDM (15 mkg VS MIC)
VME 8/163 (4,9%)
no Major Errors
Minor Errors 36/163 (23,3%)

57. http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Expert_Rules/2019/Enterobacterales_ExpertRules_V3.2_20190613.pdf
http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/
Тетрациклины МПК (мг/л) нагрузка АМП
на диск (мкг)
Диаметры зон задержки роста
(мм)
S< R> ATU S> R< ATU
Тигециклин, E.coli и C.koseri 0,52,3 0,52,3 15 18A,B 18A,B
Комментарии:
2. Для определения МПК методом разведений должен использоваться бульон приготовленный в тот же день
3/А. Для остальных Enterobacterales активность тигециклина варьирует от недостаточной для Proteus spp., Morganella
morganii и Providencia spp. до трудно предсказуемой для других видов.
B. Диметры зон задержки рост валидны только для E.coli. Для C.koseri используйте метод МПК.

58. http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Expert_Rules/Expert_rules_intrinsic_exceptional_V3.1.pdf

59. •Тигециклин – нет критериев интерпретации, но возможно
определение МПК , т.к.
* Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (2018)
http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Expert_Rules/Expert_rules_intrinsic_exceptional_V3.1.pdf
http://amrmap.ru/?id=jNdjf418m148m22

60. • Определение МПК может проводиться
методом разведений в агаре
• При определении МПК необходимо в среду
добавлить глюкоза-6-фосфат (25мкг/мл)
• Зоны задержки роста для ДДМ применимы только для E.coli, для
остальных представителей порядка Enterobacterales должно
определяться МПК
• Отдельные колонии внутри зоны задержки должны игнорироваться

61. Колистин Тигециклин
Фосфомицин