1. TUTOR HEMATOLOGI
PEMERIKSAAN
HEMOGLOBIN FETUS (Hb F)
dr. Robiul Fuadi/ dr. Fery H. Soedewo, MS. SpPK (K)

2. PENDAHULUAN
 Hemoglobin: - empat heme
- empat rantai globin
Hematology Clinical Principal and Application,
2002

3.  Rantai globin: α, β, δ, γ
 Jenis hemoglobin sesuai dengan rantai globinnya:
Hb A ( Adult Hemoglobin) ,oleh 2 rantai α dan
2 rantai β
Hb A2 , oleh 2 rantai α dan 2 rantai delta
Hb F (Fetal hemoglobin), oleh 2 rantai α dan
2 rantai γ

4. Perjalanan Rantai Globin
Hematology Clinical Principal and Application, 2002

5. HEMOGLOBIN NORMAL
Masa Rantai globin Hemoglobin
INTRAUTERIN
Awal embriogenesis ζ+Є Gower-1
α+Є Gower-2
ζ+γ Portland
Bermula dari awal embriogenesis, α + γ F
mencapai puncak pada
pertengahan gestasional, dan
mulai menurun secara cepat sesaat
sebelum lahir.
LAHIR α+γ F, 60-90 %
α+β A, 10-40%
DEWASA α+γ F, <1-2%
α+δ A2, <3,5%
α+β A >95%
Hematology Clinical Principal and Application, 2002

6.  Alasan fisiologis perubahan Hb F ke Hb A sebagai
komposisi utama hemoglobin belum dimengerti
 Afinitas oksigen Hb F sedikit lebih tinggi
dibandingkan Hb A perlu dipertimbangkan

7. Peningkatan Hb F
Hb F pada individu dewasa dapat meningkat pada:
 Hereditary Persisten Fetal Hemoglobin
sintesis Hb F menetap tinggi hingga dewasa
 β Talasemia
sebagai kompensasi penurunan jumlah Hb A
Dapat ditemukan pada:
 anemia aplastika kongenital,
 aplastika sel darah merah kongenital
 leukemia mielomonositik kronik juvenille
 Sindroma mielodisplastik.
 Stress eritropoesis (hemolisis, perdarahan, recovery dari gagal
sumsum tulang akut)
 kehamilan

8. Interpretasi Kadar Hb F
Kadar Hb F Interpretasi
0,2-1,0 % Normal
1,0-5,0 % Sekitar 30% β thalassemia traits
Varian hemoglobin heterozigot
Varian hemoglobin homozigot
Campuran varian hemoglobin heterozigot dan β- talasemia
Individu dengan kelainan hematologi (anemia aplastik, sindrom mielodisplastik,
leukemia mielomonositik juvenille)
Wanita hamil (trimester kedua)
Secara sporadis terdapat pada populasi umum, terutama pada Afro-Caribbean
(HPFH heterozigot non delesi)
5,0-20,0 % Kasus tertentu dari β thalassemia traits
Varian hemoglobin homozigot
Campuran varian hemoglobin heterozigot dan β thalassemia
Beberapa tipe HPFH heterozigot, δβ thalassemia
15,0-45,0 % HPFH heterozigot tipe Afrika (biasanya lebih dari 20%)
Beberapa kasus β thalassemia intermedia
>45,0% β thalassemia mayor
Beberapa kasus β thalassemia intermedia
Neonatus
>95,0% HPFH homozigot tipe afrika (delesional)
Beberapa neonatus (terutama jika prematur)
Dacie and Lewis Practical Hematology,2001

9. Pemeriksaan Hb F
 Pemeriksaan Hb F dapat dilakukan dengan berbagai
metode:
1. Berdasarkan resistensinya terhadap denaturasi pada pH
alkali:
a. Metode Betke
b. Metode Jonxis dan Visser
2. Metode imunologi, dengan Radial imunodifusi dan
enzyme-linked immunoassay (ELISA)
3. Metode acid elution test
4. Elektroforesis
5. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

10. Metode Betke
 Memiliki presisi yang baik, bila kadar Hb F <10-15%
 Hb F relatif resisten terhadap alkali kuat
 Prinsip:
 Tambahkan sodium hydroxide pada hemolisat yang
telah dicampur dengan larutan cyanide
 Setelah waktu tertentu, hentikan denaturasi dengan
penambahan ammonium sulfat
 Filtrasi
 Hb yang tidak terdenaturasi diukur

11. Metode Betke
 Spesimen: hemolisat
dapat disimpan satu minggu pada 4oC
• Hemolisat dapat disiapkan dengan:
 Sentrifus darah vena dengan antikoagulan pada kecepatan
3000 rpm selama 15 menit, dan pindahkan plasma
 Cuci packed red blood cells dengan 0,9% saline 3 kali
 Tambahkan air suling 1,4 ml dan 0,4 toluene pada tiap 1 ml
sel
 Goyang selama 5 menit dan sentrifus lagi pada 3000 rpm
selama 15-30 menit
 Pindahkan lapisan toluene di atas, dan saring hemolisat
dengan kertas saring

12. Metode Betke
 Reagen:
- cyanide solution
- NaOH 1,2 N
- Ammonium sulfat jenuh
 Peralatan:
- spektrofotometer - Pipet 1,5, 10 ml
- Stopwatch - kertas saring Whatman
- Tabung 12 x10 mm - Funnels
- Vortex Mixer

13. Prosedur Pemeriksaan
3,8 ml larutan sianida encerkan 0,4 ml HiCN Baca absorban pada λ 540
+0,2 ml hemolisat dengan 6,75 ml akuades. nm sebagai A Hb total
Blanko : aquades
Pindahkan 2,8 HiCN
biarkan 10 menit pada Masukkan 0,2 ml mas ukkan 2
suhu ruang NaOH,atur waktu
saring dengan
ml (NH4)2SO4
kertas Whatman
HiCN
Biarkan
Setelah min 5
menit Baca pada λ
2 menit
540 nm
sebagai A Hb
resisten alkali
Campur
Campur dengan
dengan vortex
vortex mixer 2-3 dtk
mixer 10 detik

14.  Menghitung persentase Hb F:
A540 Hb resisten alkali X 100
% Hb F = _______________________
A540 Hb total X 10,01
 Setiap pemeriksaan sampel harus disertai dengan
hemolisat yang normal dan abnormal

15. Metode Jonxis dan Visser
 Metode ini tidak reliabel pada kadar Hb F kurang
dari 10 %
 Prinsip:
 Tambahkan larutan ammonium hydroxide pada
darah atau hemolisat dalam larutan sodium
hydroxide
 Hitung kadar Hb resisten alkali pada tiap menit
sampai 15 menit
 Buat grafik kadar Hb resisten alkali terhadap waktu
 Kadar Hb F sebenarnya adalah saat nol detik

16. Metode Acid Elution Test
 Untuk mengukur distribusi Hb F intraseluler
 dapat digunakan untuk membedakan peningkatan Hb F pada
talasemia dengan HPFH
 Prinsip:
 Hemoglobin pada sel darah merah dipresipitasi dengan cara
dikeringkan
 Fiksasi dengan alkohol
 Hb A dan hemoglobin lain akan dilepas dari sel darah merah
dengan pemberian asam
 Hb F masih bertahan pada sel darah merah
 Dengan Amido Black, Hb A dan hemoglobin lain pada sel
darah merah terlihat “ghost cell”, sedangkan Hb F terlihat
berwarna biru gelap

17. Metode Radial Imunodifusi
 Metode ini berdasarkan reaksi antigen antibodi
 Sampel diaplikasi dalam sumuran, sedangkan anti
Hb F digabungkan dalam medium gel sehingga
menghasilkan bentuk cincin presipitasi opak yang
terlihat
 Diameter cincin yang terbentuk sebanding dengan
konsentrasi Hb F

18. Elektroforesis
 Elektroforesis adalah pergerakan molekul yang bermuatan
listrik dalam medan listrik
 Pada pH ± 8 (alkali), Hb akan bermuatan negatif dan akan
bergerak ke anoda
 Perbedaan kecepatan dari pergerakan hemoglobin yang
berbeda, sesuai dengan besar muatan negatif yang dimiliki
 Pada Hb F, muatan negatifnya lebih kecil dibanding Hb A,
sehingga kecepatan bergeraknya juga lebih lambat
 Perbedaan molekul Hb diuraikan dengan elektroforesis akan
berbentuk garis/band yang tampak jelas bila diwarnai dengan
cat Pancau S
 Selanjutnya, hasil uraian dibandingkan dengan standar Hb
yang sudah diketahui pada waktu penentuan yang sama.
 Persentase Hb F dapat dihitung dengan:
o Eluasi
o Densitometer

19. HPLC
 HPLC merupakan metode yang digunakan untuk
memisahkan dan menentukan persentase Hb A2 dan
Hb F, serta memberikan hasil kualitatif varian
hemoglobin yang lain
 Metode ini digunakan sebagai skrining untuk varian
Hb
 Jika teridentifikasi varian Hb, maka perlu dilakukan
elektroforesis untuk menentukan jumlah dan jenis
varian Hb.

20. PRESENTATION NAME
TERIMA KASIH
Description

21.  2,8 ml + 0,2 ml+ 2 ml= 5 ml
5/2,8 =1,78571429 kali
 0,4 ml+6,75 ml= 7,15
7,15/0,4 = 17,875 kali
 17,875/1,7857429= 10,01

22. Prosedur Pemeriksaan Metode Jonxis dan Visser
encerkan 0,1 ml hemolisat Tambahkan 2 tts
dengan 10 ml akuades. ammonium hydroxide
Hemolisat 10 g/dl
Baca absorban pada λ 576
nm sebagai A B
Masukkan 0,1 ml
hemolisat dalam 10 ml
Tambahkan 2 tts
Baca absorban pada λ
sodium hydroxide ammonium Dinginkan pada
576 nm tiap menit
hydroxide suhu ruang
selama 15 menit (A T)
Baca pada λ
576 nm
sebagai A E
Inkubasi 15 menit
pada 37o C

23.  Menghitung persentase hemoglobin yang tidak
terdenaturasi:
AT576-AE576
___________ X 100
AB 576-AE576

24. HPLC