Metode analisis vitamin dapat dilakukan secara langsung maupun tidak langsung. Metode langsung seperti HPLC dan immunoassay memberikan hasil kuantitatif yang akurat, namun mahal. Metode tidak langsung seperti uji aktivitas enzim dan metabolit pemuatan lebih murah tetapi kurang akurat. Pemilihan metode tergantung pada jenis vitamin, akurasi yang dibutuhkan, dan sumber daya laboratorium.

1. METODE ANALISIS VITAMIN
Persyaratan spesimen;
• Puasa plasma atau serum
• Lithium Heparin adalah antikoagulan pilihan untuk vitamin seperti, tiamin, riboflavin, retinol,
tokoferol & cholecalciferol
• EDTA dapat digunakan untuk vitamin B6 dan folat
Metode dan pilihan;
Pemilihan metode tergantung pada vitamin yang sedang dianalisis. Beberapa vitamin
seperti vit-A, K, B12 memiliki fitur khusus yang memungkinkan penggunaan beberapa metode
khusus dengan biaya yang efektif (murah).
Beberapa metode pengukur vitamin secara langsung dan memberikan pengukuran
kuantitatif. Ini direkomendasikan untuk digunakan terutama untuk vitamin yang berguna secara
klinis.
Namun ini mahal dan tidak semua laboratorium dapat memberikan tes tersebut. Metode ini
meliputi:
• HPLC (metode referensi)
• Immunoassays (ELISA, RIA, FIA)
• Colorimetric dan Spektrofotometri tes
• Fluorometric assay & Chemiluminescence assay
• amperometri assay
Karena vitamin berfungsi sebagai ko-faktor dan substrat dalam berbagai reaksi tubuh,
beberapa metode memanfaatkan properti ini dan secara tidak langsung mengukur vitamin dengan
mengukur aktivitas enzim di bawah pengaruh. Metode ini relatif lebih murah dan bisa menjadi

2. semi-kuantitatif atau kualitatif. Namun beberapa metode ini digunakan saat ini untuk penelitian
saja dan ini termasuk:
• Tes Metabolit pemuatan
• enzim aktivasi eritrosit assay
• Tes kerapuhan Eryhtrocyte
• Waktu Prothrombin
• metode mikrobiologi
• Bioassay (in-vivo & in-vitro)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Ini adalah metode referensi untuk menganalisis jenis vitamin.
Juga digunakan untuk menentukan bentuk iso vitamin
KEUNTUNGAN
- Langsung
- kuantitatif
- Precise & akurat
- Sensitif dan spesifik
- Otomatis
- Tinggi melalui put
Kerugian :
- Membutuhkan pretreatment sampel seperti ekstraksi & filtrasi
- Membutuhkan perhatian untuk memilih fase gerak & sampel laju pemompaan

3. - Awalnya membutuhkan optimasi. Dalam rangka untuk mendapatkan resolusi tinggi dasar
rendah dan kembali ketingkat noise yang rendah harus dipertahankan
- Membutuhkan standar internal, kalibrator dan reagen HPLC kelas
- Mahal untuk membeli dan biaya pemeliharaan yang tinggi
Immunoassays
Ada beberapa jenis immunoassays seperti:
- Enzim Linked Sorbant Immuno Assay yang memanfaatkan antibodi terkait dengan enzim.
- Radio-immunoassay bukannya memanfaatkan radio-isotop dan karena pelepasan radioaktif
menyangkut ini sekarang keluar tanggal.
- Immunoassays Fluorescent menggunakan antibodi berlabel dengan fluorophore tetapi tidak
memiliki kepekaan dibandingkan dengan dua sebelumnya.
Vitamin B12 dan Vitamin-D-dapat dianalisis dengan immunoassay. Tes ini tergantung
pada ketersediaan antibodi monoklonal yang menentukan spesifisitas dan sensitivitasnya.
Untuk beberapa sampel immunoassays dianggap mahal tetapi biaya dapat dikurangi jika
sampel yang cukup adalah 'batch' dianalisis pada 96 format yang baik.
Immunoassays adalah metode kedua yang paling dapat diandalkan untuk pengukuran vitamin
setelah HPLC.
Kolorimetri dan Spektrofotometri tes
Reaksi kimia antara chromogen dan vitamin menyebabkan perubahan warna.
Perkembangan warna menunjukkan adanya vitamin .... analisis kualitatif.
Untuk mengukur metode ini, spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas warna 'end
point', di mana intensitas warna sebanding dengan konsentrasi vitamin.
Terutama digunakan untuk penentuan vit-C (asam askorbat).
KEUNTUNGAN

4. - Sebuah uji kuantitatif langsung
- Membutuhkan volume sampel kecil
- Otomatis
- Cepat turn-sekitar waktu
- Bisa diterapkan untuk sampel tunggal atau beberapa pada satu waktu
Kerugian
- Sensitivitas dan spesifisitas rendah maka beberapa zat lainnya dapat mengganggu chromogen
atau enzim yang digunakan.
- Tidak bisa digunakan untuk semua jenis vitamin
- Kontrol yang tepat dan kalibrator harus digunakan
Fluorometric assay & Chemiluminescence assay
Vitamin tertentu memiliki kemampuan untuk menghasilkan fluoresensi ketika
direaksikan dengan fluorophore a. Fluoresensi ini berbanding lurus dengan konsentrasi vitamin.
Dalam tes Chemiluminescence, luminol digunakan untuk bereaksi dengan vitamin bunga.
Campuran disuntikkan pada tingkat dikontrol melalui kapiler di mana 'reaksi kinetik' diukur dan
diberikan pengukuran kuantitatif. Keuntungan dan kerugian yang mirip dengan tes kolorimetri
dan Spektrofotometri.
Tes amperometri
Beberapa vitamin dapat mengalami oksidasi elektro-kimia.
Reaksi ini pada penyebab elektroda perubahan potensial listrik yang berbanding lurus dengan
konsentrasi vitamin dalam sampel.
Kerugian utama dari metode ini adalah kurangnya spesifisitas dan jarang digunakan, kadang-
kadang secara paralel dengan HPLC untuk konfirmasi hasil tertentu.

5. Metode tidak langsung untuk penentuan vitamin
Metabolit pemuatan uji
Tes ini telah sangat populer di masa lalu.
Ini adalah sebuah assay tidak langsung yang menentukan aktivitas vitamin digunakan sebagai
kofaktor untuk metabolit tertentu.
Langkah-langkah yang terlibat:
- Pasien diberikan secara oral besar, diukur dosis metabolit tertentu yang digunakan oleh vitamin
menarik untuk konversi.
- Darah atau urin sampel diperoleh dari pasien setelah ~ 6 jam menelan.
- Metabolit yang sama diukur dalam sampel ini:
Peningkatan metabolit di atas kisaran normal menunjukkan kekurangan vitamin
Secara signifikan mengurangi metabolit menunjukkan aktivitas vitamin yang normal
- Misal : Tryptophan adalah metabolit pemuatan untuk vit B6-dan Histidin adalah untuk folat
KEUNTUNGAN
- Metode Murah
- Efek samping Minimum
Kerugian
- Metode tidak langsung
- In-vivo karena itu tidak dapat diandalkan karena gangguan oleh faktor-faktor lain
- Tidak berlaku untuk semua vitamin
- Invasif
Uji aktivasi enzim eritrosit

6. - Hemolysates seluruh darah atau RBC disiapkan
- Aktivitas enzim di bawah pengaruh langsung dari vitamin bunga diukur. Aktivitas enzim ini
dikenal sebagai Activity Koefisien (AC).
- Sejumlah vitamin jenuh tertentu ditambahkan.
- Aktivitas enzim ini diukur kembali dan dibandingkan dengan aktivitas enzim sebelum
penambahan.
- Peningkatan AC menunjukkan kekurangan vitamin. Dalam kasus vitamin normal atau bahkan
vitamin jenuh, AC tidak akan berubah.
- Misal : Kegiatan transketolase diukur untuk mengevaluasi tingkat tiamin, Glutathione reduktase
diukur untuk mengevaluasi riboflavin status dan aspartat transaminase (AST) aktivitas diukur
untuk analisis vit B6-.
Uji fragilitas eritrosit
Digunakan khusus untuk penilaian tingkat vitamin-E. Vitamin ini bertanggung jawab untuk
stabilitas membran RBC.
Langkah-langkah yang terlibat:
- Sampel Pasien dibagi menjadi dua aliquot.
- Sel darah merah dalam satu aliquot dicuci dengan 2% H2O2 (membran racun radikal bebas),
sedangkan sel darah merah dari 2 aliquot dicuci dengan dist. H2O.
- Setelah 3 jam inkubasi, hemoglobin diukur di kedua aliquot.
- Jika hemolisis sel darah merah dalam aliquot 1 (dicuci dengan H2O2) adalah 20% lebih dari
hemolisis dalam 2 aliquot (sel darah merah dicuci dengan dist.H2O), ini akan menunjukkan
kekurangan vitamin-E.
prothrombin Waktu
Ini adalah spesifik, namun tidak langsung assay untuk penilaian kegiatan vit-K.

7. Sejak vit-K bertanggung jawab untuk aktivasi faktor pembekuan (II, VII, IX, X, protein C, S &
Z) meningkat PT> 2 min menunjukkan defisiensi vit-K.
Hal ini dianggap sebagai tes skrining, namun untuk mengkonfirmasi HPLC atau analisis
spektrofotometri dianjurkan.
Metode Mikrobiologi (digunakan penelitian saja)
Beberapa mikro-organisme misalnya Lactobacillus Casel dan Lactobacillus Plantoides
tergantung pada vitamin tertentu untuk pertumbuhannya.
Mikroorganisme ini tumbuh dalam kaldu atau kultur agar yang mengandung sampel dengan
konsentrasi yang tidak diketahui dari vitamin.
Sebuah kontrol negatif yang tidak memiliki vitamin sama sekali juga digunakan.
Inkubasi selama beberapa hari
Kepadatan pertumbuhan diukur dengan turbidimetri
Pembentukan asam laktat juga dapat dikuantifikasi yang berbanding lurus dengan konsentrasi
vitamin dalam sampel
Bioassay untuk vitamin
adalah alat penelitian saja dan jarang digunakan secara klinis untuk analisis vitamin. Untuk
mengukur enzim dibawah pengaruh vitamin dan efek kekurangan fenotipik. Ada dua jenis bio-
tes:
In-vivo Bioassays
• Membutuhkan hewan hidup lebih kecil dalam ukuran seperti tikus atau ayam
• sifat fisik hewan seperti berat, perilaku, laju respirasi, denyut nadi, anggota tubuh dan gerakan
mata dan pengamatan fisik lainnya dicatat.
• Aktivitas enzim di bawah pengaruh langsung dari vitamin yang akan dianalisis ditentukan
dalam sampel darah spektrofotometri (nilai puncak).

8. • hewan tersebut kemudian kekurangan diet yang mengandung vitamin tertentu untuk jangka
waktu tertentu.
• Saat hewan ini mulai mengembangkan penyakit yang terkait dengan kekurangan vitamin,
sampel darah yang lain diambil dan aktivitas enzim diukur ulang. Ini adalah nilai dasar. Gejala
fisik lainnya yang direkam selama keadaan penyakit.
• Kemudian dosis dihitung dan secara bertahap meningkatkan vitamin diumpankan ke hewan
pada titik waktu tertentu.
• Aktivitas enzim yang kembali dan gejala fisik mulai membaik.
• Sampel darah diambil pada interval waktu tertentu dan aktivitas enzim diukur sampai puncak
(optimal) aktivitas kembali dan gejala penting hewan ini telah sepenuhnya pulih.
• Uji ini memungkinkan konsentrasi vitamin vs aktivitas enzim kurva standar.
• Kurva standar yang sama sekarang dapat digunakan untuk menganalisis vitamin yang sama
dalam berbagai model binatang karena aktivitas enzim dapat diukur dan menggunakan kurva,
konsentrasi vitamin yang diharapkan dapat diperoleh.
misalnya tikus ketika kekurangan vit-D untuk beberapa waktu, akan mengembangkan rakhitis.
Vit-D aktivitas enzim 25-hidroksilase dipengaruhi, yang memanfaatkan vit-D sebagai substrat.
Hal ini memicu kaskade kejadian yang menyebabkan cacat tulang pada tikus ini. Namun ketika
dosis dihitung tertentu vit-D diumpankan gejala sembuh. Aktivitas enzim diukur pada setiap titik
waktu dosis dan kurva standar dirumuskan.
KEUNTUNGAN
- Dekat dengan realitas
- Bisa menyebabkan menerobos dalam penelitian
Kerugian
- Metode tidak langsung
- Membutuhkan pemantauan yang cermat

9. - Sulit untuk mempertahankan data yang konsisten karena gangguan oleh faktor-faktor lain
- Tidak berlaku untuk semua vitamin
- Mahal karena manajemen hewan
- Memakan Waktu
- Tidak memiliki aplikasi klinis
In-vitro Bioassays
• Tes ini melibatkan menargetkan jalur sel tertentu atau jaringan dalam media kultur.
• Mempengaruhi vitamin dipelajari pada pertumbuhan, proliferasi dan diferensiasi sel.
• Faktor-faktor lain atau bahan kimia seperti: protein, imunoglobulin, kalsium, fosfor yang
diproduksi oleh sel-sel & jaringan setelah terpapar vitamin juga diukur.
Misalnya efek anti-oksidatif vit-C dan E yang didirikan oleh tes ini
KEUNTUNGAN
- Lebih mudah dari in-vivo
- Lebih baik monitoring & control kondisi
- Kurang memakan waktu & murah
- Dapat digunakan untuk menganalisis efek dari beberapa vitamin
Kerugian
- Tidak Langsung
- Tidak dekat dengan realitas
- Jaringan dan sel kultur beresiko kontaminasi