Terdapat perbedaan ekspresi protein pada platelet pasien stroke akut dibandingkan kelompok normal. Penelitian menemukan 83 protein yang berbeda ekspresi, termasuk 16 protein yang signifikan mengalami over atau down regulasi. Protein-protein tersebut terkait dengan aktivasi platelet, inflamasi, dan interaksi antarsel yang dapat berperan sebagai biomarker untuk deteksi dini stroke.

1. Profilling Platelets Pada Pasien Stroke Iskemik
Akut
Ozge Cevik, Ahmet Tarik Baykal, Aize Sener
Marmara University, Turkey

2. Pengantar
● Stroke Iskemik disebabkan oleh penyumbatan vaskular di otak yang melumpuhkan aliran darah.
● Penderita stroke harus diberikan obat pengencer darah atau obat antiplatelet untuk melancarkan
sumbatan. Dan obat tersebut diberikan tidak lebih dari 3 jam setelah serangan sroke terjadi.
● Antiplatelet agent dapat menekan aktivasi dan agregasi platelet sehingga menghilangkan resiko
aterosklerosis.
● Terjadinya agregasi platelet disebabkan oleh proses aktivasi yang melibatkan PAC-I (diduga sebagai
biomarker aktivasi platelet) yang hanya mengikat kompleks Gp2b/3a.
● Evaluasi fungsi platelet khususnys biomarker PAC-1 dilakukan menggunakan flowcytometri.
● Penelitian terdahulu menyebutkan bahwa reseptor Gp2b/3a merupakan target terapi stroke pada tikus.
● Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ekspresi protein yang berbeda pada pasien stroke jika
dibandingkan dengan kelompok normal

3. Material dan Metode
● Sample darah diperoleh dari pasien yang pernah
menderita stroke dan dirawat di departemen
neurologi dalam waktu 24 jam setelah kejadian
dan belum diberikan obat apapun.
● Kelompok pasien stroke sebanyak 65 orang
memiliki rata2 usia (66,1±10,5 tahun, 45-75
tahun) sedangkan sebanyak 42 peserta yang
memiliki rata2 usia (57,9±10,2 tahun, 40-68
tahun) dijadikan sebagai kelompok kontrol.
● Kelompok kontrol dibandingkan dengan
kelompok pasien yang tidak diberikan obat
antiplatelet selama lebih dari 14 hari.
● Sample darah dikoleksikan pada tabung ACD-A
● Metode PRP yang digunakan meliputi 2 kali
proses sentrifugasi dengan sentrifugasi pertama
150g 15 min, dan sentrifugasi kedua 800g 15
min.
● PRP diresuspensi pada Tyrode Ca+2/Mg+2 yang
telah dimodifikasi dengan buffer (127 mM NaCl,
2.7 mM KCl, 0.5 mM NaH2PO4, 12 mM NaHCO3,
5 mM 4 - (2-hidroksietil) - 1 - piperazineethane -
asam sulfonat (HEPES), glukosa 5.6 mM pH: 7.4)
dan didapatkan konsentrasi final platelet
sebanyak 2x108/ml.
Peserta Preparasi Platelet

4. Material dan Metode
● Untuk menentukan aktivasi platelet, dilakukan
pengukuran pengikatan PAC-1 menggunakan
flowcitometri.
● Suspensi platelet di inkubasi dengan 5 μg/mL
FITC yang telah dilabel anti PAC-1 ke dalam
propylene tube yang terdiri dari PBS dan 1% BSA
selama 30 menit pada suhu ruang.
● Sample kemudian didilusi dengan buffer dan
dianalisis,
● Sekresi kalsium pada platelet di ukur dengan
Fluo-8 calcium assay kit.
● Fluo-8 solution dan loading dye solution
ditambahkan kedalam suspensi platelet
● Sel platelet di inkubasi selama 30 menit pada
suhu 37 derajat celsius.
● Level Ca+2 ditentukan berdasarkan monitoring
intensitas fluorescent pada panjang gelombang
490 dan 525 nm dengan fluorescent microplate
reader.
Uji Pengikatan PAC-1 Pengukuran sekresi kalsium pada platelet

5. Material dan Metode
● Lisat platelet disuspensi didalam buffer lysis dengan
protease inhibitor dan disentrifugasi selama 15 menit
pada 14.000 rpm pada suhu 4 derajat celsius.
● Konsentrasi protein diukur dengan metode Bradford.
● Protein di SDS-PAGE dengan konsentrasi 4-12% dan
dipindahkan ke dalam membran nitroselulos dan di
blocking menggunakan BSA.
● Gel di inkubasi semalaman dengan primer antibody (1:500
monoclonal human anti-Gp2b /3a sc-53417, b-actin sc
130301)
● Membran dicuci dan di inkubasi menggunakan HRP
conjugate secondary antibody selama 2 jam kemudian blot
ditambahkan reagen chemiluminescent dan kemudian
dipaparkan pada film. Kuantifikasi intensitas pita
digambarkan oleh Image J analisis software.
● Pita yang representatif untuk setiap protein kemudian
ditunjukkan dengan b-aktin sebagai kontrol.
Analisis Western Blot

6. Analisis Proteomic Menggunakan LC-MS
- Sample Preparation
● Sample platelet pasien (n=9) dan sample kontrol (n=9) dibilas dengan 50 mm amonium bikarbonat dingin
dan ekstraksi protein didapatkan menggunakan ultrasonic homogenizer (5 s on, 5 s off, 3 siklus).
● Konsentrasi lisat diukur menggunakan metode bradford.
● 100 𝛍g campuran protein total digunakan untuk analisis tryptic peptida
● Sample protein ditambahkan 200 ul 6 M urea dan disentrifugasi 14.000 xg 15 min didalam 30 Kda cut-off
spin filter.
● Campuran protein kemudian di alkilasi dengan 10 mm IAA pada suhu ruang (gelap) selama 20 menit dan
dibilas dengan 6 M urea kemudian dibilas kembali dengan 50 mM Ambic solution.
● Campuran tersebut di inkubasi dengan perbandingan 1:100 (trypsin:protein).
● Kemudian FT di lyphillized.

7. Analisis LC/MS dan Pencarian Data (UPLC-ESI-qTOF-MS)
● Sebanyak 500 ng campuran tryptic peptida dianalisis triplicate menggunakan LC-MS
(nanoACQUITY UPLC dan SYNAPT G1 HDMS, waters)
● Equilibrasi fasa gerak yang digunakan adalah (97% air dengan 0.1 FA dan 3% ACN
dengan 0.1 FA) dan suhu kolom 45 derajat celsius.
● Gradien elusi peptida didapatkan dengan meningkatkan persentasi ACN dari 5 ke 40%
pada 300 nl/min selama 90 menit.
● Data MS dikumpulkan dari mode ion positif dengan interval 1.5 detik.
● Glu-fibrinopeptida di injeksikan sebagai massa signal kalibrator.
● Sekuensi peptida di review menggunakan database homo sapiens (www.uniprot.org).

8. Identifikasi dan Kuantifikasi Protein
● Penambahan internal kalibrator yang telah diketahui jumlahnya digunakan
untuk proses kuantifikasi.
● 3 kalibrator tertinggi tersebut memiliki m/z sebagai berikut (m/z 1286.7098,
m/z 1046.5273 dan m/z 1159.6082)
● Kalibrator yang digunakan adalah sebanyak 50 fmol dan kalibrator tersebut
dimasukkan ke dalam sample kemudian di running menggunakan MS/MS.
● Signal tertinggi sampel dibandingkan dengan signal tertinggi kalibrator
● Progenesis LC-MS digunakan untuk menghitung kelimpahan yang di
normalisasi untuk semua protein yang teridentifikasi.

9. Hasil
Aktivasi Platelet pada Pasien Stroke
● Pengikatan PAC-1 pada kelompok pasien stroke
secara significant lebih tinggi dibandingkan
dengan kelompok kontrol.
● Sekresi Ca+2 pada kelompok pasien stroke secara
significant juga lebih tinggi dibandingkan dengan
kelompok kontrol.
● Gp2b/3a terdeteksi pada pita fraksi membran
200 kDa dan B-actin terlihat pada pita 43 kDa.
Nilai ekspresi protein Gp2b/3a pada kelompok
pasien secara significant meningkat
dibandingkan dengan kelompok kontrol.
● Data diatas mengindikasikan terjadi stimulus
aktivasi platelet secara terus-menerus.

10. Hasil
Profilling pada Platelet
● Telah teridentifikasi sebanyak 500 unique
protein pada kelompok stroke dan dilakukan
pengelompokkan menggunakan refseq IDs.
setelah dikelompokkan, kemudian dipilih protein
yang memiliki ekspresi yang lebih tinggi ataupun
lebih rendah.
● Ditemukan 83 protein yang berbeda pada pasien
stroke jika dibandingkan dengan kelompok
kontrol.
● 83 protein tersebut kemudian dikelompokkan
berdasarkan fungsinya. (dapat dilihat pada tabel)
Keseluruhan list protein yang ditemukan pada
pasien stroke dan kelompok kontrol tersebut
dikelompokkan berdasarkan proses biologi dan
disesuaikan dengan database Gene Ontology

11. Hasil
Profilling pada Platelet
Interaksi antar protein dianalisis menggunakan IPA
(Ingenuity Pathway Analisis) dan berdasarkan hasil yang
didapatkan, protein tersebut berperan pada :
● interaksi dan signaling antar sel,
● respon inflamasi
● perkembangan sistem hematologi
Gambar 2B menunjukkan bahwa terdapat 16 protein yang
secara significant mengalami up regulasi / down regulasi
pada kelompok kontrol dan kelompok pasien.
Seperti yang telah ditunjukkan oleh gambar 2A
disebutkan bahwa 39 protein berperan dalam respon
inflamasi, 35 protein berperan pada interaksi dan signal
antar sel, dan 39 protein berperan pada sistem
hematologi.

12. Diskusi● Hasil penelitian yang diperoleh menunjukkan bahwa terjadi peningkatan aktivasi platelet pada pasien stroke yang
disebabkan oleh peningkatan pengikatan PAC-1 yang menstimulus Gp2b/3a dan sekresi Ca+2 dalam proses aktivasi.
● Ke 16 protein yang secara significant mengalami up/down regulasi dapat dijadikan biomarker target untuk
mendeteksi stroke stadium awal.
● Dalam diskusi ini akan disebutkan fungsi dari ke-16 protein tersebut.
Protein Peran Keterangan
ITGA2B Trombosis dan Hemostasis Dikodekan didalam Gp2b/3a
ITGB3 Trombosis dan Hemostasis Dikodekan didalam Gp2b/3a
Vitronectin Adhesi sel, agregasi platelet yang stable Berinteraksi dengan integrin Gp2b/3a
HRG Pengikatan platelet yang telah diaktivasi Terikat bersama Zinc dan ion kalsium pada
binding sitenya.
CRKL Jalur pensinyalan tyrosin kinase Menginduksi trombopoetin yang terfosforilasi
tyrosin dan mengalami upregulasi pada
pasien stroke
THBS1 Aktivasi platelet Merangsang Gp2b/3a untuk melakukan
aktivasi platelet secara terus-menerus
AMBP Regulasi proses inflamasi Kombinasi α-1-mikroglobulin dan prekursor
bikunin
RHOA Jalur Pensinyalan Gp2b/3a Berinteraksi dengan ligasi integrin untuk
menjaga kontraktilias platelet
Protein Peran Keterangan
MPO Enzim katalis seluler Protein darah yang direlease dari monocyte
dan Neutrophyl
C3 Interaksi Sel dan mengaktivasi peptida
tertentu untuk proses aktivasi platelet
Berinteraksi dengan reseptor
IGHG1 Imunologycal dan Inflammatory Pathway Berinteraksi dengan reseptor platelet
IGHG3 Imunologycal dan Inflammatory Pathway Berinteraksi dengan reseptor platelet
ALOX12 Merelease Thrombine dan Thromboxane
untuk menginduksi agregasi platelet
-
CLU Mengontrol Siklus Sel Lokalisasiny terdapat di Alpha granule
APOA1 Antitromobosis pada sirkulasi darah Terjadi down regulasi APOA1 pada pasien
stroke
APOH PromotesProthrombotic and coagulation
factor in atherothrombotic
Biasanya berikatan denga ox-LDL (Oxidative
modification of low density lipoprotein