Dokumen ini menjelaskan pembuatan hemolisat untuk pemeriksaan hemoglobin elektroforesis dan enzim pada eritrosit, termasuk metode dan prinsip dari proses tersebut. Hemolisat dibuat dari darah dengan memperhatikan kondisi penyimpanan dan teknik penanganan untuk memastikan pemeriksaan yang akurat. Selain itu, dijelaskan juga penggunaan reagen dan prosedur sentrifugasi yang diperlukan dalam pembuatan hemolisat.

1. Tutor hematologiPembuatan Hemolisat untuk Pemeriksaan Hb-Elektroforesis dan Enzim pada EritrositAdriyani Amin, dr/ Wiyanda Hidayati. MS., dr. SpPK (K)1

2. PendahuluanHemolisat : hasil dari proses hemolisisHemolisisGangguan integritas membran eritrositHbterlepas.Dapatdisebabkanolehkarena:Hemolisin dari bakteri

3. Ab yang menyebabkan complement dependent lysis

4. Meletakkan eritrosit dalam larutan hipotonik

5. Cacat membran eritrosit2

6. Hb-elektroforesisAlkali denaturasiGlucosephosphateIsomeraseactivityHemolisat G6PDPiruvatkinase3

7. Pembuatan hemolisatHemolisat untuk pemeriksaan enzim sel darah merahHemolisat untuk pemeriksaan hemoglobinelektroforesis4

8. 1. Hemolisat untuk pemeriksaan Hb-ElektroforesisPrinsipSampel darah:- Darah + antikoagulanSDM dari sampel beku ACD (bila sampel dikirim)SDM dicuci dengan larutan NaCL 9 g/l

9. SDM dilisiskan dengan air & CCl4 atau dengan freezing & thawing +CCl4

10. Sentrifuse 3000 rpm, 30 menit

11. Pindahkan larutan yg jernih

12. Hb diadjust sampai 100g/lJika anemia, gunakan:- > packed cells- < air 5

13. 1. Hemolisat untuk pemeriksaan HbMakrometodeMikrometodecara pembuatan hemolisatLarutan pelisisKertas saringSentrifuse kecepatantinggi6

14. a. MakrometodeReagen: toluene

15. Tehnik:Cuci 3x dg NaCL 0,9%Sentrifus 3000rpmPindahkansupernatanPindahkan plasma20 menitUkur volPacked cellssentrifusDarah antikoagulan5 mlPindahkanLap. Toluene + 1,4 ml air suling0,4 ml tolueneGoyang 5 menitSentrifus 3000 rpm20 mnt (40 C)7Sentrifus 3000 rpm 20 mnt, 40 CPindahkan lar Hbdengan menggunakan pipet pasteur1 ml sel

16. Penyulit:Sel target kadang tidak bisa lisis, sehingga harus ditambahkan saponin.

17. Produksi methemoglobin diminimalkan, karena akan bergerak bersama Hb H pd elektroforesis.

18. Nonhemoglobin karbonik anhidrase mempengaruhi pergerakan Hb A28

19. Catatan:Pencucian SDM dengan NaCl merupakan proses yang penting.

20. Hemolisat biasanya disimpan dalam tabung plastik yang tertutup, pada temperatur – 200 C.

21. > baik lagi bila hemolisat disaturasi dengan karbonmonoksida.

22. Jika hemolisat sudah lama, maka Hb akan memisah > jelas jika disentrifus 10.000 rpm, 15 menit, pada T dingin.9

23. b. Mikrometode Reagenpelisis: saponina. Larutanstok:Saponinpowder 1 gAir dalam gelas ukur 100 ml50 mllarutkan saponin powder + air sampai 100 mlb. Larutankerja:Larutanstok 10 mlAir 90 ml 3% KCN 2 ml10

24. Tehnik:Sentrifus 5 menitPotong dibwh buffy coatpotongTutup lap.plastikPacked cellsTab. Hematokrit heparinDarah kapilerMasukkan dalam tabungGoyang 5 menit+ 6 tetesReagen pelisis saponinHemolisat 11campur

25. c. Kertas saringTehnik:1 tetes darah kapilerSetelah kering2 tetesReagen hemolisatLubangi Kertas saring ᶲ 1 cmᶲ 12 mmKertas saringCampur &Biarkan 30 menitPindahkan Kertas saringHemolisat dapat digunakan segeraatau simpan dalam freezer12

26. d. Sentrifugasi tinggiReagen: NaCl 0,9 %, air suling.

27. Tehnik:

28. Metode pilihan bila curiga ada Hb yang tak stabil.

29. Kelemahan: tidak praktis untuk pemeriksaan rutin.Buang Sel debrisDilisiskan dg1,5-2 vol air sulingPindahkanLar. Hemoglobin Ke tabung lainSentrifuse 20.000 rpm20 menit, (40 C)Packed cellsyang sudahdicuci13

30. e. Dengan larutan pelisisReagen: lar.pelisis 20 g/l saponin + 10 g/l KCN.

31. Tehnik:+ larutan pelisisJika hemolisat tersebut cloudyBiarkan 5 menitMasukkan hemolisat kedalam lemari pendingin(freezer)± 10 menitPacked cellsYang sudah dicuciSaat dicairkanHemolisat dalam bentuk kristal jernih14

32. 2. Hemolisat untuk pemeriksaan enzim sel darah merahPrinsip:Darah + Anti koagulan (heparin/ EDTA/ ACD)

33. Enzim normal stabil : pada temperatur 40 C selama 6 hari. pada temperatur 250 C selama 24 jam.Direkomendasikan ACD dan sampel langsung diperiksa.

34. Sampel darah dikirim ke Lab pusat dalam tabung yang dikelilingi wet ice (40 C).

35. Sampel beku tidak stabil.

36. Dibutuhkan 1 ml darah untuk tiap pemeriksaan enzim. 15

37. Cara pemisahan SDM untuk pemeriksaan enzima. Pencucian SDMProses ini menghilangkan 80-90% leukosit

38. Metode ini cukup memadai

39. Kelemahan:

40. retikulosit & SDM muda ikut hilang bersama buffy coat.

41. leukosit yang tertinggal mempengaruhi hasil. Resuspensi 3xdenganNaCl 9 g/lSentrifus1200-1500 g5 menitPlasma & lap.buffy coatdipindahkanDarah + Anti koagulansel16

42. Metode ini cepat, dan sesuai bila sampel banyak.

43. Hemolisat tidak bisa disimpan > 1-2 hr pada temperatur 40 C atau temperatur ruang (karena akan menjadi gel).

44. Pada temperatur -200 C tahanbeberapa minggu saja.

45. Dalam nitrogen cair bertahan lama.