Penelitian ini mengembangkan sistem cloning Golden Gate untuk merekonstruksi vektor pertukaran alel dan menggunakan enzim I-SceI untuk meningkatkan efisiensi penggantian gen pada Bacillus anthracis. Metode ini mampu menghapus gen eag dan lainnya dari B. anthracis dengan efisiensi lebih dari 85% dan mempersingkat waktu proses penggantian gen.

1. Agil Wahyu Wicaksono
Elvia Rahmi M.P
Istifarwati
Naila Arum R
Umar Farooq Z
Presentasi kelompok Rekayasa Genetika

2. introduction
1970
restriction digestion dan ligation adalah metode yg paling
banyak digunakan pada rekonstruksi molekul DNA
rekombinan
1980-1990
ditemukannya konstruksi DNA rekombinan in vitro seperti
GATEWAY CLONING SYSTEM BY INVITROGEN
2008
ditemukan strategi cloning yang dibantu dengan enzim restriksi tipe Ils a.k.a
Ils cloning method atau golden gate cloning methods.Metode ini untuk
membuat 3 dTALEs untuk mengatifkan reporter construct
2014
Terfuchte dkkmenyempurnakan metode ini dan diuji coba ke fungi dan di
tahun yang sama Engler dkk mencoba merekonstruksi multigene unttk
transformasi tumbuhan
2016
Vad Nielssen dkk menggunakan golden gate methode untuk merakit
CRISPR gRNA expression array
Menstransfer fragment DNA dari satu
plasmid selama potongan DNA
matching (cocok) dengan restriction
sites (
Target fragmen lebih mudah, efisien
dan secara akurat menyatu dengan
vector tertentu
TALE ( transcripstion activator like receptor) 🡪
protein yang dapat disesuaikan untuk
mengatifkan gen target yang ditentukan
pengguna

3. introduction
Metode "gene knockout" b.
anthracis didasarkan pada
prinsip rekombinasi homolog
Metode yang biasa
digunakan untuk konstruksi
vektor homolog b. anthracis
adalah restriksi digesti dan
ligasi
terlalu banyak prosedur dan
butuh waktu lama
metode yang akan dikembangkan
untuk mempercepat proses yaitu
Golden Gate Cloning . sangat
efisien dan dapat digunakan untuk
bakteri sejenis seperti B. subtilis,
B. cereus, and B. thuringiensis
Untuk b. antracis, penggantian
gen pada beberapa lokus sudah
beberapa kali dilaporkan namun
metode yg digunakan untuk
pengagantian gen terlalu sulit dan
lama dan justru efisiensi nya
rendah
metode alternatif untuk
meningkatkannya dengan
enzyme I-SceI
metode ini sudah digunakan 2006
untuk promosi alel lalu
dikembangkan lagi pada 2015
I-Scel dapat digunakan untuk
memfasilitasi rekombinasi homolog
dan meningkatkan efisiensinya

4. Strain Bakteri dan Plasmid

5. Enzim

6. Primer

7. Konstruksi Entry Vectors
1. Amplifikasi sequence gen eag yaitu pada bagian
upstream (eagup (947 bp)) dan bagian
downstream (eagdn (811 bp)) menggunakan dua
pasang primer yang dirancang khusus yaitu
eagup_F/R dan eagdn F/R dengan genom B
.anthracis strain A16R sebagai template.
2. Amplifikasi gen resistensi spektinomisin (spcr,
1155 bp), primer spc_F/R, template plasmid
pSET4s. Masing-masing dari tiga fragmen DNA
diapit oleh dua BsaI sites.
3. Tiga fragmen yang sudah diamplifikasi tadi
(eagup, eagdn dan spc) diligasi ke pGEM-T easy
vector menggunakan T4 DNA ligase --> tiga entry
vectors yang ditunjuk masing-masing sebagai
pGEM-U, pGEM-D dan pGEM-S.

8. Konstruksi Acceptor Vector pKMBKI.

9. • Konsentrasi masing-masing plasmid
(pGEM-U, pGEM-S, pGEM-D dan
pKMBKI) diukur menggunakan
spektrofotometer NanoDrop
• Campuran reaksi terdiri dari:
1. 50 ng masing-masing vektor entry
dan vektor akseptor
2. 2,5 unit enzim BsaI
3. 2,25 unit T4 DNA ligase
4. 1 µl buffer CutSmart
5. 1 µl ATP (10 mM)
6. ddH2O hingga volume akhir 10 µl
Subkloning Entry DNA Fragment ke dalam
Vektor Akseptor pKMBKI untuk Menciptakan
Vektor Pertukaran Alel Rekombinan

10. • Prosedur restriksi-ligasi dengan prosedur berikut:
1. Campuran diinkubasi dalam water bath pada
suhu 37°C selama 30 menit
2. Pemanasan 50°C selama 5 menit → redigest
dan eliminasi plasmid yang masih
mengandung situs retriksi BsaI
3. Pemanasan 80°C selama 5 menit →
inaktivasi enzim retriksi dan ligase
• Produk restriksi - ligasi 5 μl ditambahkan ke 50 µl
sel DH5α
• Diinkubasi dalam ice bath selama 30 menit,
thermal shock 90 detik pada 42°C, 2 menit lagi
dalam ice bath, inkubasi 1 jam pada suhu 30°C
dengan shaker kecepatan 225 r/menit
• Seleksi klon yang sesuai → 300 µl kultur bakteri
ditempatkan pada cawan agar Luria-Bertani (LB)
yang mengandung X-Gal (40 g/ml) dan
kanamisin (50 g/ml)
• Diinkubasi 30°C semalaman
• 20 koloni putih diambil, digoreskan ke
cawan agar LB, diinkubasi 30°C selama
10 jam
• Memastikan entry DNA fragmen sudah
dimasukkan dalam vektor pKMBKI: Klon
tunggal dianalisis dengan PCR koloni
menggunakan tiga pasang primer
(eagup_F/R, eagdn_F/R dan spcin_F/R)
• Plasmid rekombinan dikonfirmasi
dengan sekuensing DNA menggunakan
ABI Prism Model 3730XL DNA analyzer
(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)
• Plasmid yang dihasilkan diberi nama
pKMUSD

11. Pengukuran Efek Enzim Restriksi I-SceI
pada Eliminasi Kinetik Vektor Pertukaran
Alel pKMUSD
Eliminasi Plasmid:
• B. anthracis strain A16R (pKMUSD) ditumbuhkan dalam media LB tanpa kanamisin
• A16R (pKMUSD + pSS4332) ditumbuhkan dalam media LB dengan kanamisin pada
42°C selama 12 jam
• Sampel diencerkan → diletakkan ke agar LB dengan atau tanpa spektinomisin
• Cawan diinkubasi pada suhu 30°C hingga koloni muncul
• Kedua strain dilewatkan hingga empat kali dalam media yang sama
• Tingkat eliminasi plasmid dari setiap generasi dianalisis seperti yang dijelaskan
sebelumnya (Wolfson et al., 1982)

12. • Vektor pKMUSD diekstrak dari DH5α dimasukkan
ke dalam dam−dcm− inang E.coli strain JM110
dengan elektroporasi (1,8 kV, 25 µF, 200 Ω)
menggunakan elektroporator Gene Pulser II (Bio-
Rad, Hercules, CA, USA ) untuk mendapatkan DNA
plasmid yang demetilasi untuk ditransform ke B.
anthracis strain A16R
• Elektroporasi sel kompeten B. anthracis strain
A16R disiapkan seperti yang dijelaskan
sebelumnya. Kemudian, 5µl DNA plasmid (1 µg
dalam air) ditambahkan ke alikuot 50 µl sel
kompeten dan pulsed (2,5 kV, 25 µF, 200Ω) dalam
0,2 cm gap cuvette
• Sel-sel diresuspensi dalam 1 ml infus brain-heart
yang dilengkapi dengan 0,5% gliserol dan
diinkubasi selama 3 jam pada suhu 30°C dengan
aerasi
Delesi Gen eag dari B. anthracis

13. • Sel-sel yang direcovery disebarkan ke cawan agar LB yang mengandung spektinomisin.
• Koloni yang resisten terhadap spektinomisin dipilih
• Konfirmasi rekombinan pKMUSD telah dimasukkan ke B. antrachis strain A16R → PCR
dilakukan menggunakan primer pair pKSV7_F/R
• Strain kemudian dielektroporasi dengan pSS4332, yang mengandung gen yang mengkode
enzim I-SceI
• Transforman diseleksi pada suhu 30°C pada media LB yang mengandung spektinomisin dan
kanamisin
• Koloni fluoresen yang membawa pSS4332 terlihat setelah 16-20 jam

14. • B. anthracis mutan dibuat dengan mengganti
urutan sekuens pengkode dengan kaset spcr,
yang memberikan resistensi spektinomisin
• Transformasi dan seleksi transforman pada
B. anthracis dilakukan seperti yang telah
dijelaskan sebelumnya
• Koloni tunggal A16R (pKMUSD+pSS4332)
dipindahkan ke media cair dengan kanamisin
dan diinkubasi dengan shaking selama 8 jam
pada suhu 30°C
• kemudian, kultur dipindahkan ke suhu 37°C
selama 8 jam
• Setelah dilewatkan tiga kali dalam media
yang sama, pengenceran kultur ditempatkan
pada cawan agar LB yang mengandung
spektinomisin dan kanamisin, dan diinkubasi
semalaman pada suhu 37°C.
• Setidaknya 50 koloni diskrining untuk
resistensi spektinomisin dan sensitivitas
kloramfenikol (SpcrCms)
• Koloni (SpcrCms) yang diduga telah
mengalami peristiwa rekombinasi silang ganda
divalidasi dengan analisis PCR menggunakan
tiga pasang primer, eagus_F/R, eagsd_F/ R dan
eagin_F/R, dan sekuensing DNA
• Strain dengan penggantian gen yang diinginkan
dilewatkan hingga tiga kali tanpa antibiotik
untuk memastikan hilangnya pSS4332, yang
dikonfirmasi oleh hilangnya fluoresensi
• Delesi gen eag diverifikasi lebih lanjut dengan
analisis western blot menggunakan antibodi
anti protein EA1.
• Koloni yang dihasilkan diberi nama
A16R△eag::spc

15. 3.1. Efisiensi “Golden Gate” dalam restriksi-ligasi dan
identifikasi vektor yang mengandung rekombinan
pKMBKI E.coli DH5α
Sel yang tertransformasi berubah
menjadi biru
E.coli DH5α
+pKMBKI
Hasil restriksi-
ligase Golden
Gate
Sel yang tertransformasi berubah
menjadi putih
20 koloni
berwarna
putih
Konfirmasi dengan PCR
dengan 3 primer eagup_F/R,
eagdn_F/R dan spcin_F/R
17/20
teramplifikasi
dengan benar
untuk ketiga gen

16. Golden Gate Cloning System
https://www.addgene.org/kits/wittbrodt-golden-gateway/

18. 3.2. Hilangnya efektivitas vektor allelic exchange menggunakan I-
Scel endonuklease dan verifikasi eag gene replacement dengan
spcr cassette

19. B. anthracis strain A16R△eag::spc, 2: B. anthracis strain
A16R. (A)
The results indicated that the eag gene was present in wild-
type strain A16R but not in A16RΔeag::spc because the eagin
fragment was only amplified in the wild-type strain.
Furthermore, two specific PCR bands were amplified by the
external primers in A16RΔeag::spc and sequencing results
were consistent with the eag gene being replaced by the
spcr gene. (B) Western blot analysis using anti-EA1
antibody revealed a specific protein band in B. anthracis
strain A16R that was not present in A16R

20. This protocol used the endonuclease I-SceI to cleave the
target plasmid or genomic DNA in vivo. (I) The plasmid
pSS4332 was transformed into B. anthracis containing
pKMUSD, which was then grown at a permissive
temperature. (II) pKMUSD was integrated into the
chromosome in some bacterial cells while free plasmid
also existed in many other cells. (III) The endonuclease I-
SceI expressed and cleaved the target sites on the
integrated plasmid, broke the chromosome or cleaved the
target sites on pKMUSD, and linearized it. (IV) The
chromosome was damaged by endonuclease I-SceI,
followed by recombination repair resulting in loss of the
integrated plasmid or the occurrence of homologous
recombination between linear plasmid DNA and
chromosome. (V) Both of these different pathways result
in replacement of the targeted gene (eag) by spcr cassette.
The red diamond denotes the I-SceI site.

21. conclusion
• Dalam penelitian ini, peneliti merekontruksi sistem cloning efisiensi tinggi
menggunakan metode Golden Gate dan memperkenalkan I-SceI site ke
dalam alel pertukaran vektor sebagai counterselection untuk meningkatkan
efisiensi rekombinasi homolog untuk gene replacement pada B. anthracis.
• Efikasi knock out vector menggunakan golden gate method lebih dari 85%
• Ekspresi enzim I-SceI endonuclease sangat berpengaruh terhadap
rekombinasi homolog
• Eag dan beberapa gen lain dari B. anthracis telah dihapus (deletion)
menggunakan teknik golden gate method
• Kombinasi Golden Gate method dan counterselectable marker dapat
mempersingkat waktu gene knock out pada B. antrachis
• Spekulasi muncul bahwa sistem konstruksi vector gene knock out dan high
efficiency targeted gene replacement yang didoorng oleg enzim I-SceI
endonuclease dapat diterapkan pada bakteri lain selain B. anthracis