1. IL TRASFERIMENTO
GENICO

2. COME INSERIRE DNA IN
UNA CELLULA
VIENE ISOLATA LA SEQUENZA DI
DNA CHE SI INTENDE INSERIRE
NELLA CELLULA OSPITE
VIENE INDIVIDUATO UN VETTORE
IDONEO, CIOÈ UNA SEQUENZA DI
DNA IN GRADO DI PERMETTERE
L’INSERIMENTO DEL DNA
TRASPORTATO NEL GENOMA
DELLA CELLULA OSPITE
VIENE COSTRUITA UNA MOLECOLA
DI DNA RICOMBINANTE, CIOÈ
FORMATA DAL DNA VETTORE E DAL
DNA DEL GENE DA INSERIRE

3. I VEGETALI - OGM
PRODOTTO CARATTERISTICHE GENI INTRODOTTI OBIETTIVO
Pomodoro Ritardo nella Gene antisenso Riduzione delle spese di
(Calgene) maturazione che blocca la conservazione Maggior durata
biosintesi del prodotto.
dell’etilene,
ormone che
promuove la
maturazione
Colza Resistenza ad Geni batterici Controllo delle erbe infestanti.
(AgrEvo, erbicidi che
Monsanto, conferiscono
Plant resistenza a due
Genetic diversi erbicidi
System)
Patata Resistenza ad Gene batterico Resistenza a parassiti senza
(Monsanto) insetti parassiti utilizzo di agenti chimici
Soia Resistanza Gene batterico Controllo delle erbe infestanti
(Monsanto) all’erbicida
Glifosato
Mais Resistenza a Gene batterico Resistenza a parassiti senza
(Monsanto, parassiti utilizzo di agenti chimici

5. AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

6. PARTICLE GUN

8. IL BACILLUS THURINGIENSIS È UN BATTERIO SPORIGENO CHE
VIVE NEL TERRENO. QUANDO VIENE INGERITO MEDIANTE
VEGETALI CONTAMINATI, IL BATTERIO SPORULA NELL'OSPITE
LIBERANDO LE TOSSINE (INNOCUE PER GLI ESSERI UMANI) CHE
DANNEGGIANO IL TRATTO DIGERENTE DELLE LARVE DI DITTERI
COME LE ZANZARE O CAUSANDO NEI BRUCHI DI MOLTI
LEPIDOTTERI UNA MALATTIA PARALITICA.

10. L’INATTIVAZIONE GENICA
GENE
ANTISENSO

RNA ANTISENSO
LEGA L’mRNA E
BLOCCA LA
TRADUZIONE

14. LA TERAPIA GENICA
CON TERAPIA GENICA SI INTENDE
L’INSIEME DI PROCEDIMENTI ATTI
A CURARE O ALLEVIARE UNA
MALATTIA MODIFICANDO
GENETICAMENTE LE CELLULE DEL
PAZIENTE

15. OBIETTIVI DELLA
TERAPIA GENICA
CORREZIONE DI FENOTIPI PATOLOGICI RISULTANTI DA MUTAZIONI
GENETICHE: “SOSTITUIRE E/O CORREGGERE UN GENE MANCANTE
O DIFETTOSO”
ESPRESSIONE DI PROTEINA CORRETTA E CORREZIONE
PERMANENTE
TRASFERIMENTO VELOCE ED EFFICIENTE DEL “FARMACO”
RISPETTANDO IL CONTESTO GENICO E CELLULARE
INTRODURRE NELLA CELLULA GENI DIRETTI ALL’ELIMINAZIONE
DELLE CELLULE CANCEROSE
TRASFERIRE GENI VIRALI O BATTERICI A SCOPO DI VACCINAZIONE
TRASFERIRE GENI CHE STIMOLANO LA CRESCITA O LA
RIGENERAZIONE DI TESSUTI DANNEGGIATI

16. VANTAGGI TEORICI DELLA
TERAPIA GENICA
• CORREZIONE RADICALE DEI DIFETTI
• POSSIBILITÀ DI AGIRE SU MECCANISMI MOLECOLARI
PER I QUALI RISULTA ESTREMAMENTE DIFFICILE
SVILUPPARE FARMACI SPECIFICI
• VANTAGGI ECONOMICI (SE FOSSE PERMANENTE
EVITEREBBE LA NECESSITÀ DI TRATTAMENTI RIPETUTI)

17. STRATEGIE
IN VIVO EX-VIVO
EX-

18. QUALI MALATTIE POSSONO ESSERE
TRATTATE CON LA TERAPIA GENICA?
Malattie Ereditarie:
•Distrofia muscolare
•Atrofia muscolare
•Fibrosi cistica
•Emofilia
•Immuno deficienze (ADA – X-linked)
•Fenilchetonuria (malattie metaboliche)
•Anomalie fisiologiche (mucopolisaccaridosi, sindrome di Gaucher
etc.)

19. QUALI MALATTIE POSSONO ESSERE
TRATTATE CON LA TERAPIA GENICA?
Malattie non Ereditarie:
•Cancro
•Malattie cardiovascolari
•Malattie neurodegenerative (morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson etc.)
Infine la terapia genica può trattare anche malattie acquisite quali:
•Traumi di vario tipo (fratture ossee, ferite, ustioni)
•Ischemie (necrosi dei tessuti causate da un'interruzione
dell'apporto sanguigno)
•Infezioni

20. METODI DI TRASFERIMENTO DEL
MATERIALE GENETICO
Metodi Biologici: Metodi Chimici: Metodi Fisici:
Adenovirus ricombinante Liposomi Cationici Elettroporazione
Virus Adenoassociati Complessi di Polilisina Nucleofezione
Retrovirus Microiniezione
Lentivirus
Sistema Non Virale
Sistema Virale

21. VETTORI VIRALI: I RETROVIRUS
• Genoma: RNA singolo filamento.
• Integrazione casuale nel genoma (mutagenesi inserzionale).
• Difficile produrli in grandi quantità (titolo elevato).
• Successo della terapia dipendente dalla trasduzione delle cellule
staminali.
• Poco immunogeni.
• L’espressione può andare incontro ad attenuazione nonostante la
persistenza del virus nel genoma.
• In assoluto sono i vettori più utilizzati per la terapia genica.
• Possono infettare solo cellule proliferanti

22. VETTORI VIRALI: I LENTIVIRUS
• Genoma a RNA.
• A differenza degli altri retrovirus possono infettare cellule
proliferanti e post-mitotiche.
• Scarsissime reazioni immunologiche.
• Elevata efficienza di trasduzione e persistenza dell’espressione.
• Ottime prospettive per la terapia genica in vivo.
• Integrazione casuale (mutagenesi inserzionale).

23. VETTORI VIRALI: ADENOVIRUS
• Genoma a DNA doppio filamento.
• Possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche.
• Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica.
Pertanto non determinano mutagenesi inserzionale, ma sono
necessari trattamenti ripetuti.
• Relativamente facile produrli in grandi quantità (titolo
elevato).
• Forti reazioni immunologiche.

24. VETTORI VIRALI: SPECIFICITÀ

25. LA LIPOFEZIONE

26. LA TRASFEZIONE

27. CELLULA PACKAGING

28. VANTAGGI (TEORICI) DELLA
TERAPIA GENICA
• Correzione radicale dei difetti
• Possibilità di agire su meccanismi molecolari
per i quali risulta estremamente difficile
sviluppare farmaci specifici
• Vantaggi economici (se fosse permanente
eviterebbe la necessità di trattamenti ripetuti)

29. STRATEGIE TERAPEUTICHE
SOSTITUZIONE GENICA
Efficace per le patologie caratterizzate da perdita di funzione
totale o parziale di un gene.

30. STRATEGIE TERAPEUTICHE
INIBIZIONE MIRATA DELL’ESPRESSIONE GENICA
siRNA
Strategia utile per le patologie causate dalla presenza di
mutazioni ad effetto dominante o dominante negativo.

31. STRATEGIE TERAPEUTICHE
UCCISIONE DIRETTA DI CELLULE PATOLOGICHE

32. STRATEGIE TERAPEUTICHE
TERAPIA GENICA “IN SITU”

33. STRATEGIE TERAPEUTICHE
UCCISIONE DI CELLULE PATOLOGICHE MEDIATA
DAL SISTEMA IMMUNITARIO (TUMORI)

34. STRATEGIE TERAPEUTICHE
TERAPIA GENICA DEL CANCRO:
POTENZIAMENTO DELLA RISPOSTA IMMUNE

35. LO STATO DELL’ARTE

36. LO STATO DELL’ARTE

37. LO STATO DELL’ARTE

38. LO STATO DELL’ARTE

39. STATO DELLA
SPERIMENTAZIONE
1. OLTRE IL 70% DEI PROTOCOLLI SONO IN FASE 1 O
2 (VALUTAZIONE DELLA SICUREZZA)
2. 75% DEI PROTOCOLLI IN FASE 1 NEL 1995 NON
HANNO SUPERATO QUELLA FASE
3.NESSUN PROTOCOLLO HA AL MOMENTO PRODOTTO
RISULTATI DURATURI E RADICALI NELL’UOMO AD
ECCEZIONE DEGLI INTERVENTI RIGUARDANTI LA
S.C.I.D.

40. LO STATO DELL'ARTE
Primo prodotto di terapia genica disponibile in
commercio:
Adenovirus esprimente p53 contro carcinomi
squamo-cellulari di testa e collo, licenziato in Cina
dall’Industria cinese Shenzen SiBiono (2003)
Prodotto simile che sta per essere registrato negli
USA (ora in fase III della sperimentazione clinica
contro carcinomi sqamo-cellulari di testa e collo,
tumori del polmone e della mammella):
Adenovirus per p53, Advexin
Si ritiene che l’Advexin sara’ il primo farmaco di
terapia genica registrato in USA..

41. ADA (ADENOSINE DEAMINASE)
• Catalizza la deaminazione di adenosina e
desossiadenosina in inosina e desossiinosina
• Mutazioni nel gene dell’ADA causano
immunodeficienza (SCID, Severe Combined
Immunodeficiency): virtualmente assente attivita’ di
linfociti B e T
• Cure possibili: trapianto di midollo, somministrazione
di PEG-ADA bovina

42. TRIAL CLINICO PER DEFICIT ADA

43. TRIAL CLINICO PER DEFICIT ADA
L’espressione di ADA persiste a 12 anni dalla prima infusione di cellule
modificate in una delle 2 pazienti trattate:
20% dei linfociti esprimono ancora ADA
La 2a paziente ha invece sviluppato anticorpi
contro componenti del sistema di infezione
(FCS) e ha perso i linfociti trasdotti e
l’espressione di ADA

44. TRIAL CLINICO PER SCID
Gene therapy of Human Severe Combined
Immunodeficiency
(SCID)-XI Disease:
• Trial successivi hanno dimostrato successo nel correggere il difetto
immunitario in 9 pazienti su 10 trattati
• Tuttavia, dopo 3 anni i due pazienti piu’ giovani (1 e 3 mesi al tempo
del trattamento) hanno improvvisamente sviluppato proliferazione
clonale di linfociti T maturi (Science 2003).
• In entrambi i casi, i linfociti aberranti mostravano inserzione del vettore
retrovirale in prossimita’ del promotore del proto-oncogene LMO2:
MUTAGENESI INSERZIONALE!

45. ATTUALI PROBLEMI TECNICI
DELLA TERAPIA GENICA
• Efficienza di trasferimento genico
• Selettività del sistema di trasferimento
• Espressione instabile nel tempo
• Espressione non regolata
• Reazioni del sistema immunitario
• Possibili interferenze con il genoma
(mutagenesi inserzionale)

46. LIMITI DELLA TERAPIA GENICA
• Rischio troppo elevato in presenza di terapie alternative
• Mancanza di efficacia dovuta a problemi tecnici
(inefficiente trasferimento genico, inattivazione del gene
terapeutico)
• Costi elevati
• Alto rischio di effetti indesiderati (espressione non
regolata, mutagenesi inserzionale, passaggio delle
modifiche alla linea germinale)

47. OBIETTIVI FUTURI
• IDENTIFICARE PROTOCOLLI DI TRASFERIMENTO PÙ
EFFICACI CHE PERMETTANO UNA ESPRESSIONE DEL
DNA DI LUNGA DURATA
• SVILUPPARE VETTORI CHE RISULTINO ANCORA PIÙ
SPECIFICI PER IL TARGET CELLULARE DESIDERATO
• VERIFICARE LA CORRETTA INSERZIONE DEI GENI
TRASFETTATI NEL LOCUS GENICO (NO RANDOM)
• VERIFICARE CHE I GENI UNA VOLTA INSERITI NEL
GENOMA DELLA CELLULA TARGET SIANO
CORRETTAMENTE CONTROLLATI
• COMPRENDERE I MECCANISMI DI BASE DELLA
RICOMBINAZIONE OMOLOGA: GENE TARGETING