メタゲノム解析と微生物統合データベース 講師：森 宙史（東京工業大学大学院 生命理工学研究科 助教） 2014年12月18日「第30回 DDBJing 講習会 in 東京」 ＠独立行政法人 科学技術振興機構 東京本部 YouTube：http://youtu.be/FdwgrrNKEW4 DDBJing 講習会：http://www.ddbj.nig.ac.jp/ddbjing/ddbjing.html

1. 第30回 DDBJing
講習会
in
東京 2014
12/18
@JST東京本部
配布用資料
メタゲノム解析と微生物統合データベース
森 宙史
Hiroshi Mori, Ph.D.
hmori@bio.titech.ac.jp
東京工業大学
大学院生命理工学研究科
生命情報専攻 黒川・中島・山田研
1

2. 16S rRNA gene amplicon sequencing analysis
(メタ16S解析)
DNA
extrac:on
PCR
amplifica:on
DNA
Sequencing
Pre-­‐analysis
(Remove
Primer,
Chimera
etc.)
Taxonomic
assignment
and
Comparison
between
samples
Sequence
clustering
with
species
level
by
CD-­‐HIT-­‐EST
or
UCLUST,
etc.
TestSample2 SRR061008 SRR061006 SRR061003 SRR061004 SRR095659 SRR094400 SRR090399 TestSample1 SRR094717
0.00.20.40.60.81.0
Who’s
there?
Togo
picture
gallery
by
DBCLS
is
licensed
under
a
Crea:ve
Commons
AYribu:on
2.1
Japan
license
(c)
2

3. DNA
extrac:on
DNA
Sequencing
Assemble
Metagenomic
reads
Con:g
sets
Gene
finding
Gene
sets
BLASTP
Gene
Func:on
abundance
Pathway
abundance
Pathway
reconstruc:on
Taxonomic
abundance
Who’s
there?
What
are
they
doing?
Sample1
Metadata
Sample2
Metadata
Compara:ve
metagenomics
MGA,
MetaGeneMark
SOAPdenovo2,
Velvet,
IDBA-­‐UD
etc.
Metagenomic sequencing analysis
(メタゲノム解析)
Togo
picture
gallery
by
DBCLS
is
licensed
under
a
Crea:ve
Commons
AYribu:on
2.1
Japan
license
(c)
3

4. DB名
環境メタゲノム
サンプル数
ヒトメタゲノム
サンプル数
MG-­‐RAST
14,188
3,291
JGI
IMG/M
1,694
840
INSDC
DRA/ERA/SRA
23,214
18,108
Taxonomic
division
RefSeqのゲノム数
Archaea
375
Bacteria
24,119
Fungi
289
公開されているゲノム・メタゲノムのデータ数 (2014年6月時点)
4

5. ・ メタ16S・メタゲノム解析データ(塩基配列データ)から、容易に
系統組成および遺伝子機能組成の情報を抽出したい
・ 組成情報を既存のメタ16S・メタゲノム解析サンプルと比較したい
その環境の細菌群集は他のサンプルと比較するとどのような共通性・違いがあるか？
その環境のメタデータと自分のサンプルのメタデータを比べて、何が異なるのか？
5

6. integrates
lots
of
data
related
to
microbes.
Especially,
we
integrates
the
microbial
data
that
can
be
linked
to
genomes.
Ortholog:
MBGD
Genome:
GTPS/RefSeq
Annota:on:
TogoAnnota:on
Culture
Collec:on:
NBRC/JCM
Metadata:
INSDC
SRA
Metagenome:
INSDC
SRA
Taxonomy:
NCBI
Taxonomy
hYp://microbedb.jp/
Gene
Taxon
Environment
Red
color
indicates
our
collaborators.
6

7. MicrobeDB.jpを用いて出来ること
1. 既存のゲノム中の各遺伝子の情報 (オーソログ、モデル微生
物での高精度アノテーション、系統プロファイル、環境プロファ
イル)
2. 菌株保存機関に存在する菌株の情報 (生育培地、表現型情
報、遺伝子機能組成、環境プロファイル)
3. 様々な環境中の細菌群集の情報 (系統組成、遺伝子機能組
成)
4. 上記の情報がシームレスに連携
(exp.
高温環境に多く存在する遺伝子はどのような遺伝子か?
その遺伝子は、どの系統が主に持っているのか?)
7

8. Metagenome/Microbes
Environmental
Ontology
(MEO)
Ver.
0.7
797
terms
BioPortal
hYp://bioportal.bioontology.org/
で最新版を公開
atmosphere
(MEO:0000001)
geosphere
(MEO:0000002)
hydrosphere
(MEO:0000004)
environment
human
ac:vity
associa:on
(MEO:0000003)
organism
associa:on
(MEO:0000005)
・air
• oxic
• anoxic
：
・soil
• forest
• plain
：
・sea
• lake
• water
：
・rumen
• mucus
• rhizosphere
：
・bioreactor
• farm
• naKo
：
Collaborate
with
DBCLS
岡本忍、川島秀一
8

9. 公共塩基配列DB
(INSDC
SRA)
メタゲノムDB
NIG
Super
Computer
解析
パイプ
ライン
MeGAP-­‐
MicrobeDB.jp
MeGAP
メタゲノム配列データを取得
大規模計算実行
既存のメタ16S・
メタゲノムの
解析済み
データを
取得
メタ16S・
メタゲノム
配列データ
(fastq形式)
ユーザ
アップロード
系統組成
(Genus,
Family,
Order,
Class,
Phylum)
遺伝子機能組成
(ホモログ、代謝パスウェイ)
MicrobeDB.jp中の
既存メタ16S・
メタゲノムデータとの
比較解析結果
MeGAPから得られた
系統組成・
ホモログ組成(tsv形式)
9

10. 10
MeGAP
(MetaGenome
Annota:on
Pipeline)
version
0.1
hYp://fs2.bio.:tech.ac.jp/megap/

11. 配列の前処理
(目的:
高精度配列データの抽出)
3’端のQuality
Trim
(Quality
value
<17)
配列長でフィルタリング(<50
base)
FASTQ
ファイル
Qualityでフィルタリング
Quality
Average
>25
Nを含む配列除去
ユーザがメタ16S
or
メタゲノム
の情報を入力
高精度
メタゲノム配列データ
高精度メタ16S
配列データ
11

12. メタ16S解析パイプライン
UCHIME
Reference
mode
でキメラを検出
キメラ除去済みOTU
OTU代表配列
Reference
16S
rRNA
gene
database
UCHIME
De
novo
mode
でキメラを検出
両modeでキメラとされた
OTUをキメラと判定、
そのOTUを構成する全リードを除去
高精度メタ16S
配列データ
UCLUST
Iden:ty
>97%,
coverage
>90%
RDP
Classifierを用いてbootstrap
cutoff
>50%
で各OTUの代表配列を系統アサインメント
Genus-­‐Phylumレベルの系統組成
12

13. 13
系統組成

14. メタゲノム解析パイプライン
高精度メタゲノム
配列データ
CLAST
Refseq
Prokaryote
Genome
Top
Hitのみ抽出
各株の遺伝子ごとに
Hit数を集計
全体のリード数で補正
OrthologごとにHit数を集計
Strainレベルで
Hit数を集計
系統組成
遺伝子機能組成
代謝パスウェイ組成
GPUを用いた
塩基配列の類似性検索
KEGG
Ortholog
KEGG
Pathway
(Yano
et
al.,
2014,
BMC
Bioinforma:cs)
14

15. 15
MeGAP-­‐MicrobeDB.jp
version
0.1
hYp://fs2.bio.:tech.ac.jp/megaptomicrobedb.jp/

16. MicrobeDB.jp中の既存サンプルとの比較解析
メタゲノムDB
サンプルとの
距離行列計算
階層的
クラスタリング
組成の
可視化
1-­‐Pearson相関係数
Complete
Linkage法
ユーザのサンプルのGenus組成・KO組成
既存メタ16SサンプルのGenus組成
既存メタゲノムサンプルのKO組成
上記の各ステップはRで実行
16
類似した
100サンプルを抽出

17. 類似した100サンプルとのKO組成 （メタゲノム）
17
類似した100サンプルとのGenus組成 （メタ16S）

18. Genus組成によるサンプル間階層的クラスタリングの結果 （メタ16S）
18
SRR047754
SRR056157
SRR171796
SRR170533
SRR056145
SRR055616
SRR049373
SRR046330
SRR046902
SRR041006
SRR170301
SRR055038
SRR054955
SRR056479
SRR044766
SRR056712
SRR044992
SRR048116
SRR090947
SRR044910
SRR056239
SRR045292
SRR055870
SRR055247
SRR055977
SRR056122
SRR047920
SRR048182
SRR201927
SRR201901
SRR170070
SRR050330
SRR048699
SRR044090
SRR044123
SRR051583
SRR046225
SRR041027
SRR040933
SRR170162
SRR170959
SRR048536
SRR043600
SRR045546
SRR047450
SRR044030
SRR043994
SRR172002
SRR048662
SRR171212
SRR044656
SRR041547
SRR046241
SRR045647
SRR045607
SRR049227
SRR044718
SRR328963
SRR328879
SRR048782
SRR049962
SRR046197
SRR044654
SRR090082
SRR090049
Test1.fastq
SRR408525
SRR170142
SRR051449
SRR051472
SRR172287
SRR328866
SRR172280
SRR046305
SRR048380
SRR044671
SRR328769
SRR328673
SRR056033
SRR047997
SRR044675
SRR048859
SRR048526
SRR048551
SRR408530
SRR047448
SRR044652
SRR044665
SRR044683
SRR048579
SRR048650
SRR048051
SRR041015
SRR047221
SRR047878
SRR048344
SRR044028
SRR043989
SRR170860
SRR043634
SRR091093
0.000.050.100.150.200.250.300.35
Cluster Dendrogram
hclust (*, "complete")
d_cor
Height

19. ・ メタ16S・メタゲノム解析データから、容易に
系統組成および遺伝子機能組成の情報を抽出したい
MeGAP
hYp://fs2.bio.:tech.ac.jp/megap/
・ 組成情報を既存のメタ16S・メタゲノム解析サンプルと比較したい
MeGAP-­‐MicrobeDB.jp
hYp://fs2.bio.:tech.ac.jp/megaptomicrobedb.jp/
その環境の細菌群集は他のサンプルと比較するとどのような共通性・違いがあるか？
その環境のメタデータと自分のサンプルのメタデータを比べて、何が異なるのか？
19
まとめ

20. データの収集およびクオリティコントロール、
更新の自動化など持続可能なシステムの構築
データ生産者から継続的にデータを受け付ける窓口のシステムとして微生
物ゲノム自動アノテーションシステム「MiGAP」およびメタゲノム解析パ
イプライン「MeGAP」を利用し、MicrobeDB.jpと一体運用を実現する。
また、これまで手作業で実施してきたDBの更新作業を可能な限り自動化
し更新体制を強化する。
データ
生産者
微生物ゲノム
自動アノテーションシステム
メタゲノム解析パイプライン
メタデータの入力
RDFへの変換
ユーザのデータと
公共DB中のデータの統合
RefSeq SRA
公共DB中の
ゲノム・メタゲノムデータ
20

21. Acknowledgement
東京工業大学
黒川顕・山田拓司・山本希・鈴木真也
国立遺伝学研究所
中村保一・菅原秀明・神沼英里・藤澤貴智
基礎生物学研究所
内山郁夫・千葉啓和・西出浩世
21
DBCLS (ライフサイエンス統合データベースセンター）
岡本忍・川島秀一・片山俊明・山本泰智