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メタバーコーディングが拓く新種探索の新時代
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- 2. Presenter 発表者 水産総合研究センター 中央水産研究所 田辺 晶史 Akifumi S. Tanabe National Research Institute of Fisheries Science, Fisheries Research Agency
- 3. メタバーコーディング が拓く新種探索の新時代 Metabarcoding marks a new era for exploring new taxa
- 4. 未知の生物を 探す Exploring new taxa
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- 6. 目で見る observe by eyes
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- 8. そんなときに メタバーコーディング Metabarcoding is able to solve this problem
- 9. メタバーコーディングって何？ What is “metabarcoding”?
- 10. メタバーコーディングって何？ 土壌 海水 淡水 未消化物 糞 遺骸 生物体 など What is “metabarcoding”? soils sea water fresh water undigested materials feces dead bodies living bodies etc.
- 11. メタバーコーディングって何？ 土壌 海水 淡水 未消化物 糞 遺骸 生物体 など What is “metabarcoding”? メタゲノム metagenomes soils sea water fresh water undigested materials feces dead bodies living bodies etc.
- 12. メタバーコーディングって何？ 土壌 海水 淡水 未消化物 糞 遺骸 生物体 など What is “metabarcoding”? メタゲノム塩基配列 metagenomes nucleotide soils sea water fresh water undigested materials feces dead bodies living bodies etc. sequences
- 13. メタバーコーディングって何？ 土壌 海水 淡水 未消化物 糞 遺骸 生物体 など What is “metabarcoding”? メタゲノム塩基配列生物種名 metagenomes nucleotide soils sea water fresh water undigested materials feces dead bodies living bodies etc. sequences biological taxa
- 14. メタバーコーディングのポジティブスパイラル A positive spiral of metabarcoding メタバーコーディング 未知生物発見 従来法による記載分類 improve metabarcoding メタバーコーディング 能力向上 metabarcoding DNA データベース充実 discover a new taxon describe the new taxon by existing method expand the DNA database
- 15. メタバーコーディングって何？ 土壌 海水 淡水 未消化物 糞 遺骸 生物体 など What is “metabarcoding”? メタゲノム塩基配列生物種名 metagenomes nucleotide sequences an old method ＰＣＲで特定の遺伝子座を増幅 サンガー法で塩基配列解読 biological taxa amplify a barcode locus sequence by Sanger method
- 16. メタバーコーディングって何？ 土壌 海水 淡水 未消化物 糞 遺骸 生物体 など What is “metabarcoding”? メタゲノム塩基配列生物種名 metagenomes nucleotide sequences a new method ＰＣＲで特定の遺伝子座を増幅 同時にサンプル識別用タグ配列付加 多サンプルを混合してＮＧＳで解読 biological taxa amplify a barcode locus add multiplex identifier sequence mix and sequence by NGS
- 17. メタバーコーディングって何？ 土壌 海水 淡水 未消化物 糞 遺骸 生物体 など What is “metabarcoding”? メタゲノム塩基配列生物種名 metagenomes nucleotide sequences biological an old method 近縁既知配列と多重整列 分子系統樹推定 taxa multiple alignment with known relatives molecular phylogenetic inference
- 18. メタバーコーディングって何？ What is “metabarcoding”? metagenomes nucleotide sequences biological taxa 土壌 海水 淡水 未消化物 糞 遺骸 生物体 など メタゲノム塩基配列生物種名 a new method タグ配列に基いて由来サンプルを特定 … demultiplexing ……… quality-trimming …………… quality-filtering ……… denoising ……… chimera removal …… clustering … barcoding 配列から低品質な部位を除去 低品質な配列を除去 ノイズの多そうな配列を除去 キメラと思われる配列を除去 類似度ｎ％以上の配列をまとめる 類似する既知配列からホスト生物を推定
- 19. メタバーコーディングって何？ metagenomes nucleotide sequences biological taxa 土壌 海水 淡水 未消化物 糞 遺骸 生物体 など メタゲノム塩基配列生物種名 タグ配列に基いて由来サンプルを特定 … demultiplexing ……… quality-trimming …………… quality-filtering ……… denoising ……… chimera removal …… clustering … barcoding 配列から低品質な部位を除去 低品質な配列を除去 ノイズの多そうな配列を除去 キメラと思われる配列を除去 類似度ｎ％以上の配列をまとめる 類似する既知配列からホスト生物を推定 Claident http://www.claident.org/ What is “metabarcoding”? a new method
- 20. メタバーコーディングって何？ metagenomes nucleotide sequences biological taxa 土壌 海水 淡水 未消化物 糞 遺骸 生物体 など メタゲノム塩基配列生物種名 タグ配列に基いて由来サンプルを特定 … demultiplexing ……… quality-trimming …………… quality-filtering ……… denoising ……… chimera removal …… clustering … barcoding 配列から低品質な部位を除去 低品質な配列を除去 ノイズの多そうな配列を除去 キメラと思われる配列を除去 類似度ｎ％以上の配列をまとめる 類似する既知配列からホスト生物を推定 Claident http://www.claident.org/ What is “metabarcoding”? a new method
- 21. 植物菌根のメタバーコーディング例 An example of metabarcoding of mycorrhizae (Toju et al. 2013)
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- 24. 生物の分類は階層的に体系化されている Biological taxonomy is hierarchically systematized 界 kingdom
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- 26. 生物の分類は階層的に体系化されている Biological taxonomy is hierarchically systematized 界 kingdom 門 phylum 綱 class
- 27. 生物の分類は階層的に体系化されている Biological taxonomy is hierarchically systematized 界 kingdom 門 phylum 綱 class 目 order
- 28. 生物の分類は階層的に体系化されている Biological taxonomy is hierarchically systematized 界 kingdom 門 phylum 綱 class 目 order 科 family
- 29. 生物の分類は階層的に体系化されている Biological taxonomy is hierarchically systematized 界 kingdom 門 phylum 綱 class 目 order 科 family 属 genus
- 30. 生物の分類は階層的に体系化されている Biological taxonomy is hierarchically systematized 界 kingdom 門 phylum 綱 class 目 order 科 family 属 genus 種 species
- 31. 生物の所属分類群を特定＝同定すると、様々なことがわかる Taxonomic identification gives us a lot of information
- 32. 生物の所属分類群を特定＝同定すると、様々なことがわかる ● 生態 Taxonomic identification gives us a lot of information Ecology
- 33. 生物の所属分類群を特定＝同定すると、様々なことがわかる ● 生態 Taxonomic identification gives us a lot of information Ecology ● 寿命，最大・平均・最小サイズ，生息環境，分布域， etc. life history, body size, habitat, distribution, etc.
- 34. 生物の所属分類群を特定＝同定すると、様々なことがわかる ● 生態 ● 寿命，最大・平均・最小サイズ，生息環境，分布域， etc. ● 近縁の分類群 Taxonomic identification gives us a lot of information Ecology life history, body size, habitat, distribution, etc. Closely related taxa
- 35. 生物の所属分類群を特定＝同定すると、様々なことがわかる ● 生態 Taxonomic identification gives us a lot of information Ecology ● 寿命，最大・平均・最小サイズ，生息環境，分布域， etc. ● 近縁の分類群 life history, body size, habitat, distribution, etc. Closely related taxa ● ヒトであればチンパンジー，ライオンであればネコ， etc. chimps for humans, lions for cats, etc.
- 36. より下位の階層まで同じ分類群は、より似ている Organisms which belong same lower taxa are more similar
- 37. より下位の階層まで同じ分類群は、より似ている Organisms which belong same lower taxa are more similar ● 既知生物に似ているほど下位の階層まで同定可能 An organism which is more similar to known organisms is identifiable to lower taxa
- 38. より下位の階層まで同じ分類群は、より似ている Organisms which belong same lower taxa are more similar ● 既知生物に似ているほど下位の階層まで同定可能 An organism which is more similar to known organisms is identifiable to lower taxa ● より下位の階層（種とか）まで同定できるとより詳細にわかる Lower taxonomic information provides more detailed ecological information
- 39. interlude end
- 40. DNA →分類情報 Translating DNA into taxonomic information
- 41. どうやって？ How?
- 42. 新規準 A new criterion for molecular identification
- 43. 新規準 A new criterion for molecular identification 問い合わせ配列と最近隣配列間の変異量 distance between query and nearest-neighbor
- 44. 新規準 A new criterion for molecular identification 問い合わせ配列と最近隣配列間の変異量 distance between query and nearest-neighbor < 同定結果分類群内の最大変異量 maximum distance within resulting taxon
- 45. イメージ図 既知配列B A schematic illustration sequence space 既知配列A 配列空間 問い合わせ配列 known sequence A known sequence B query sequence
- 46. イメージ図 既知配列B A schematic illustration 既知配列A 属genus Ω 種species α 問い合わせ配列 属genus Ω 種species β 配列空間 sequence space known sequence A known sequence B query sequence
- 47. A schematic illustration 配列空間 属Ω の変異の範囲 known sequence B イメージ図 既知配列B sequence space 既知配列A 問い合わせ配列 known sequence A query sequence variable range of genus Ω
- 48. A schematic illustration known sequence A 属Ω の変異の範囲 known sequence B query sequence イメージ図 既知配列B 既知配列A 問い合わせ配列 属genus Ω 種species ? 配列空間 sequence space variable range of genus Ω
- 49. NN-centric auto-k-NN method 配列空間sequence space 問い合わせ配列 query sequence
- 50. NN-centric auto-k-NN method 1.最近隣配列(A) を探し出して変異量(DQA) を算出 Retrieve nearest-neighbor (A), and calculate distance from query (DQA) 配列空間sequence space 問い合わせ配列 A DQA query sequence
- 51. NN-centric auto-k-NN method 1.最近隣配列(A) を探し出して変異量(DQA) を算出 2.DAB>DQAを満たす配列のうち最もA に近い配列(B) を得る Retrieve borderline (B), which is nearest to A in the sequences farther from A than Q DQA A 配列空間 問い合わせ配列 B sequence space query sequence
- 52. NN-centric auto-k-NN method 1.最近隣配列(A) を探し出して変異量(DQA) を算出 2.DAB>DQAを満たす配列のうち最もA に近い配列(B) を得る 3.DAN≤DABを満たす全ての配列(N) を得る Retrieve all sequences (Ns) filling DAN≤DAB DAB A B N N N 配列空間sequence space 問い合わせ配列 query sequence
- 53. NN-centric auto-k-NN method 1.最近隣配列(A) を探し出して変異量(DQA) を算出 2.DAB>DQAを満たす配列のうち最もA に近い配列(B) を得る 3.DAN≤DABを満たす全ての配列(N) を得る 4.A, B, N の全配列で共通する分類群を採用 Accept a taxon common to A, B, and Ns DAB A B N N N 配列空間sequence space 問い合わせ配列 query sequence
- 54. NN-centric auto-k-NN method 1.最近隣配列(A) を探し出して変異量(DQA) を算出 distance between query and nearest-neighbor 2.DAB>DQAを満たす配列のうち問最いも合わA せ配に列近とい最近配隣列配列(B) 間のを変得異る 量 3.DAN≤DABを満たす全ての配列(N) を得る 4.A, B, N の全配列で共通する分類群を採用 ＜ ≤ ＝ sequence space DAB A B N N N 配列空間 maximum distance within resulting taxon 問い合わせ配列 DQA DAB 同定結果分類群内の最大変異量 query sequence
- 55. Query-centric auto-k-NN method 配列空間sequence space 問い合わせ配列 query sequence
- 56. Query-centric auto-k-NN method 1.最近隣配列(A) を探し出して変異量(DQA) を算出 Retrieve nearest-neighbor (A), and calculate distance from query (DQA) 配列空間sequence space 問い合わせ配列 A DQA query sequence
- 57. Query-centric auto-k-NN method 1.最近隣配列(A) を探し出して変異量(DQA) を算出 2.DAB>DQAを満たす配列のうち最もA に近い配列(B) を得る Retrieve borderline (B), which is nearest to A in the sequences farther from A than Q DQA A 配列空間 問い合わせ配列 B sequence space query sequence
- 58. Query-centric auto-k-NN method 1.最近隣配列(A) を探し出して変異量(DQA) を算出 2.DAB>DQAを満たす配列のうち最もA に近い配列(B) を得る 3.DQN≤DQBを満たすすべての配列(N) を得る Retrieve all sequences (Ns) filling DQN≤DQB A DQB N N 問い合わせ配列 N 配列空間 B sequence space query sequence
- 59. Query-centric auto-k-NN method 1.最近隣配列(A) を探し出して変異量(DQA) を算出 2.DAB>DQAを満たす配列のうち最もA に近い配列(B) を得る 3.DQN≤DQBを満たすすべての配列(N) を得る 4.A, B, N の全配列で共通する分類群を採用 Accept a taxon common to A, B, and Ns A DQB N N 問い合わせ配列 N 配列空間 B sequence space query sequence
- 60. Query-centric auto-k-NN method 1.最近隣配列distance (A) between を探しquery 出しand てnearest-変異neighbor 量(DQA) を算出 問い合わせ配列と最近隣配列間の変異量 2.DAB>DQAを満たす配列のうち最もA に近い配列(B) を得る 3.DQN≤DQBを満たすすべての配列(N) を得る 4.A, B, N の全配列で共通する分類群を採用 sequence space ＜ ≤ ＝ maximum distance within resulting taxon A DQB N N 問い合わせ配列 N 配列空間 B DQA DQB 同定結果分類群内の最大変異量 query sequence
- 61. 従来法との比較1 Comparing with existing methods 1 DNA database human ACATAGC… chimp ACATTCT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT…
- 62. 従来法との比較1 Comparing with existing methods 1 DNA database human ACATAGC… chimp ACATTCT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… 無作為に pick 1 本抜く a sequence human ACATAGC…
- 63. 従来法との比較1 Comparing with existing methods 1 DNA database 無作為に 1 本抜く DNA database lacking 1 sequence human ACATAGC… human ACATAGC… chimp ACATTCT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… chimp ACATTCT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… pick a sequence
- 64. 従来法との比較1 Comparing with existing methods 1 DNA database DNA database lacking 1 sequence human ACATAGC… human のDNA を 右のデータベースを使って プログラムで同定して 正解かどうかを調べる 無作為に 1 本抜く human ACATAGC… chimp ACATTCT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… chimp ACATTCT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… pick a sequence identify human DNA by programs with DNA database lacking human DNA
- 65. 従来法との比較1 Comparing with existing methods 1 DNA database DNA database lacking 1 sequence human ACATAGC… human のDNA を 右のデータベースを使って プログラムで同定して 正解かどうかを調べる 無作為に 1 本抜く human ACATAGC… chimp ACATTCT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… chimp ACATTCT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… pick a sequence identify human DNA by programs with DNA database lacking human DNA 抜き取ったDNA は プログラムからは 未知のものになる Picked DNA seems to be “unknown sequence” from programs
- 66. Results of leave-one-out cross-validation correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 67. Results of leave-one-out cross-validation 1NN はよく落ちるが 誤同定多数 Too many misidentifications were produced by 1NN method correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 68. Results of leave-one-out cross-validation correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified 97%NN, 99%NN, Barcoder, ConstrainedNJ は、門レベルすら落とせない ことが頻繁にある 97%NN, 99%NN, Barcoder, ConstrainedNJ were not able to identify the sequences even at phylum-level
- 69. Results of leave-one-out cross-validation correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified NNC, QC は門～科までは よく落とせている NNC and QC frequently produced correct identification at phylum-, class-, order-, and family-level.
- 70. Results of leave-one-out cross-validation correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified 5NN はNNC, QC とよく似た結果 5NN produced similar results to NNC and QC
- 71. 従来法との比較2 Comparing with existing methods 2 DNA database human ACATAGC… chimp ACATTCT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… 無作為に pick 1 本抜く a sequence human ACATAGC…
- 72. 従来法との比較2 Comparing with existing methods 2 DNA database 無作為に 1 本抜く DNA database lacking all seqs of a order human ACATAGC… human ACATAGC… chimp ACATTCT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… pick a sequence
- 73. 従来法との比較2 Comparing with existing methods 2 DNA database DNA database lacking all seqs of a order human ACATAGC… human のDNA を 右のデータベースを使って プログラムで同定して 正解かどうかを調べる 無作為に 1 本抜く human ACATAGC… chimp ACATTCT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… pick a sequence identify human DNA by programs with DNA database lacking all DNA of a order
- 74. 従来法との比較2 Comparing with existing methods 2 DNA database DNA database lacking all seqs of a order human ACATAGC… human のDNA を 右のデータベースを使って プログラムで同定して 正解かどうかを調べる 無作為に 1 本抜く human ACATAGC… chimp ACATTCT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… cow TACGTCT… cat GCTGTGT… pick a sequence identify human DNA by programs with DNA database lacking all DNA of a order 抜き取ったDNA の 「目」は プログラムからは 未知のものになる Picked DNA seems to be “unknown order” from programs
- 75. Results of leave-one-order-out cross-validation correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 76. Results of leave-one-order-out cross-validation correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-l phylum, class ではevel unidentified 5NN, NNC, QC はよく似た結果
- 77. Results of leave-one-order-out cross-validation correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified order の誤同定は 5NN > NNC > QC
- 78. Results of leave-one-order-out cross-validation correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified family でも 5NN > NNC > QC
- 79. Results of leave-one-family-out cross-validation correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 80. Results of leave-one-genus-out cross-validation correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 81. まとめ Conclusion ● QCauto method... ● 多重整列が不要 ● 既知系統樹が不要 ● どの遺伝子座でも適用可能 ● どの分類群にも適用可能 ● 前処理に時間がかからない ● 同定処理に時間がかからない ● 理論的背景がある is multiple alignment free is phylogenetic tree free is locus independent is taxon independent is fast in preprocess is fast in identification process has theoretical background ● 「既知の綱の未知の目」といった答えを正しく出す can find unknown order of existing class
- 82. QCauto 法はポジティブスパイラルを加速する QCauto method accelerates positive spiral メタバーコーディング 未知生物発見 従来法による記載分類 improve metabarcoding メタバーコーディング 能力向上 metabarcoding DNA データベース充実 discover a new taxon describe the new taxon by existing method expand the DNA database
- 83. QCauto 法はポジティブスパイラルを加速する QCauto method accelerates positive spiral メタバーコーディング 未知生物発見 従来法による記載分類 improve metabarcoding メタバーコーディング 能力向上 metabarcoding DNA データベース充実 discover a new taxon describe the new taxon by existing method expand the DNA database Bottleneck
- 85. 誤同定の要因 ● 見かけ上の誤同定 ● 問い合わせ配列の同定情報が間違っている ● 既知配列の同定情報が間違っている ● 分類体系が系統関係を反映していない ● 本当の誤同定 ● バーコード領域がincomplete lineage sorting や浸透交雑・水平 伝播によって種の系統関係を反映していない ● 変異量の指標(BLAST raw score) が不適 ● 規準が不適
- 86. 全分類群全遺伝子座でのLOOCV 結果 属レベルが最も 誤同定が多い correctly identified incorrectly identified cannot identified but incorrectly identified at higher-level cannot identified
- 87. 属レベルで誤同定が多いのは何故か? ● 種を記載するとき、無理にでも属は指定する必要がある ● 系統関係と整合的でない分類群が属で設立されやすいのでは? ● 正しくない属に入れられてしまう種も多いのでは?
- 88. 誤同定の要因 ● 見かけ上の誤同定 ● 問い合わせ配列の同定情報が間違っている ● 既知配列の同定情報が間違っている ● 分類体系が系統関係を反映していない ● 本当の誤同定 ● バーコード領域がincomplete lineage sorting や浸透交雑・水平 伝播によって種の系統関係を反映していない ● 変異量の指標(BLAST raw score) が不適 ● 規準が不適 「属レベルが最も誤同定が多い」 のは、これが多いことを示している?
- 89. 複数の同定結果を優先順位を付けて統合する ● 複数の既知配列データベースでの同定結果 ● 種以下まで情報がある既知配列のみのデータベースでの同定結果 ● 科以下まで情報がある既知配列のみのデータベースでの同定結果 ● 厳しい制約下の同定結果と制約を緩めた同定結果 ● 類似配列の厳密一致分類群を採用した同定結果 ● 類似配列の90% 多数決合意分類群を採用した同定結果 ● 複数の遺伝子座での同定結果 ● 遺伝子座A の配列での同定結果 ● 遺伝子座B の配列での同定結果
- 90. 複数の同定結果を優先順位を付けて統合する 優先度綱目科属種 高哺乳綱霊長目ヒト科 低哺乳綱霊長目ヒト科ヒト属ヒト 綱目科属種 統合結果哺乳綱霊長目ヒト科ヒト属ヒト
- 91. 複数の同定結果を優先順位を付けて統合する 優先度綱目科属種 高哺乳綱霊長目ヒト科ゴリラ属ゴリラ 低哺乳綱霊長目ヒト科ヒト属ヒト 綱目科属種 統合結果哺乳綱霊長目ヒト科ゴリラ属ゴリラ
- 92. 複数の同定結果を優先順位を付けて統合する 優先度綱目科属種 同哺乳綱霊長目ヒト科ゴリラ属ゴリラ 同哺乳綱霊長目ヒト科ヒト属ヒト 綱目科属種 統合結果哺乳綱霊長目ヒト科
- 93. 複数の同定結果を優先順位を付けて統合する 優先度綱目科属種 同哺乳綱霊長目ヒト科ゴリラ属ゴリラ 同哺乳綱霊長目ヒト科ヒト属 綱目科属種 統合結果哺乳綱霊長目ヒト科ゴリラ属ゴリラ
- 94. 動物COX1 でのno-LOOCV 結果 correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 95. 動物COX1 でのLOOCV 結果 correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 96. 細菌16S でのno-LOOCV 結果 correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 97. 細菌16S でのLOOCV 結果 correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 98. 真菌ITS でのno-LOOCV 結果 correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 99. 真菌ITS でのLOOCV 結果 correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 100. 植物matK でのno-LOOCV 結果 correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 101. 植物matK でのLOOCV 結果 correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 102. 植物rbcL でのno-LOOCV 結果 correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 103. 植物rbcL でのLOOCV 結果 correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified
- 105. 植物trnH-psbA でのLOOCV 結果 correctly identified incorrectly identified unidentified but incorrectly identified at higher-level unidentified