Spektrofotometer adalah alat yang mengukur absorpsi radiasi elektromagnetik oleh sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Ia terdiri dari sumber cahaya, monokromator, kompartemen sampel, detektor, dan pembaca. Spektrofotometer UV-Vis menggunakan dua sumber cahaya dan dapat menganalisis zat berwarna atau tidak berwarna dengan mengacu pada hukum Beer-Lambert.

1. Anis Susilo 4411411056
Deasy Amalia Wulandari 4411411058
“SPEKTrOFOTOMETeR”
Biology Non Education
Second Group
Semarang State University

2. Spektrofotometer
• Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur
transmitan atau absorban suatu sampel
sebagai fungsi panjang gelombang.
• Spektrofotometri UV-Vis merupakan
gabungan antara spektrofotometri UV dan
Visible. Alat ini menggunakan dua buah
sumber cahaya yang berbeda, yaitu sumber
cahaya UV dan sumber cahaya Visible.

3. spektrofotometer
• Spektrofotometer  spektrometer +
fotometer
• Spektrometer  menghasilkan sinar dari
spektrum dengan panjang gelombang tertentu
• Fotometer  alat pengukur intensitas cahaya
yang ditransmisikan atau diabsorpsikan
• Spektrofotometer  untuk mengukur energi
secara relatif jika energi tersebut
ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan.

4. Spektrofotometer UV Vis
• Zat yang dapat dianalisis dengan
spektrofotometri UV-Vis yaitu zat dalam
bentuk larutan dan zat yang tampak
berwarna maupun berwarna.
• Spektrofotometer UV-Vis merupakan
spektrofotometer berkas ganda, dimana
blanko dan sampel dimasukan atau disinari
secara bersamaan

5. Prinsip kerja
• Spektrofotometri uv-vis mengacu pada hukum
Lambert-Beer. Apabila cahaya monokromatik
melalui suatu media (larutan), maka sebagian
cahaya tersebut akan diserap, sebagian
dipantulkan dan sebagian lagi akan dipancarkan.
• Sinar dari sumber cahaya akan dibagi menjadi
dua berkas oleh cermin yang berputar pada
bagian dalam spektrofotometer. Berkas pertama
akan melewati kuvet berisi blanko, sementara
berkas kedua akan melewati kuvet berisi sampel.

6. Gambar Skematis Spektrofotometer

7. Prinsip Spektrometri
• Larutan sampel dikenai radiasi
elektromagnetik, sehingga menyerap energi /
radiasi  terjadi interaksi antara radiasi
elektromagnetik dengan materi
(atom/molekul)
• Jumlah intensitas radiasi yang diserap oleh
larutan sampel dikonversi dengan konsentrasi
analit  data kuantitatif

8. Spektrometri
Berdasarkan jenis materi yang berinteraksi
dengan radiasi elektromagnetik, dibagi :
Spektrometri molekul  radiasi
elektromagnetik berinteraksi dengan molekul
Contoh : NMR, IR, UV-Vis, XRD
Spektrometri atom  radiasi elektromagnetik
berinteraksi dengan atom
Contoh : AAS, AFS

9. A = abc
A : absorbance
Hukum Lambert Beer – hubungan linear antara absorbansi
dengan konsentrasi zat yang diserap
Dasar pengukuran Spektrofotometer
“c” konsentrasi sampel dalam (mol/L)
“a” is molar absorptivity dalam
L/[(mole)(cm)]
“b” : panjang kuvet dalam cm
Diameter kuvet atau tempat sampel = jarak cahaya
yang melalui sampel yang diserap

10. warna yang teramati Warna yang diserap Panjang gelombang
Green Red 700 nm
Blue-green Orange-red 600 nm
Violet Yellow 550 nm
Red-violet Yellow-green 530 nm
Red Green 500 nm
Orange Blue 450 nm
Yellow Violet 400 nm

11. Penyimpangan Hk Lambert-Beer
 Larutan pekat
pada konsentrasi larutan yang terlalu
pekat, Absorbansi yang terbaca terlalu
tinggi, sehingga grafik tidak linear 
Larutan yang diukur harus encer
 faktor instrumentasi  sinar yang
diserap tidak monokromatis 
menyebabkan 2 panjang gelombang
maksimum
 Faktor kimia  karena terjadinya reaksi
disosiasi, asosiasi, polimerisasi, solvolisis
Jika terjadi reaksi  konsentrasi zat
yang akan diukur berkurang

12. sumber cahaya – monokromator – sel sampel – detektor – read
out (pembaca).

13. Spektrofotometer

14. Spektrofotometer
 Sumber cahaya (Lampu) : memancarkan semua warna
cahaya (yaitu, cahaya putih).
 Monokromator : memilih satu panjang gelombang dan
panjang gelombang yang dikirimkan melalui sampel.
 Detektor : mendeteksi panjang gelombang cahaya
yang telah melewati sampel.
 Amplifier : meningkatkan sinyal sehingga lebih mudah
untuk baca terhadap kebisingan latar belakang.

15. Komponen : lampu
Lampu
 Spektrofotometer UV
1. Lampu Gas hidrogen
2. Lampu Merkuri
 Spektrofotometer Visible
Lampu Tungsen / lampu wolfram
UV-VIS menggunakan photodiode yang telah
dilengkapi monokromator.

16. Komponen : monokromator
• Cahaya
– Semua cahaya
– Cahaya polikromatik

17. Komponen : monokromator
• Monokromator  memilih cahaya
monokromatik
– Cahaya satu warna
Cahaya merah
yang diserap
oleh larutan
hijau

18. Komponen Monokromator
• Prisma : mendispersikan radiasi elektromagnetik
• Kisi Difraksi : menghasilkan penyebaran dispersi
sinar secara merata
• Celah optis : mengarahkan sinar monokromatis
yang diharapkan dari sumber radiasi
• Filter : menyerap warna komplementer sehingga
cahaya yang diteruskan merupakan cahaya
berwarna

19. Komponen Spektrofotometer
• Kompartemen sampel
Kompartemen ini digunakan sebagai tempat
diletakkannya kuvet.
• Detektor
berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan
dari sampel dan mengubahnya menjadi arus
listrik.
• Read out merupakan suatu sistem baca yang
menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal
dari detektor

20. Komponen : sample cells
Sample cells (kuvet)
 Spektrofotometer UV
Quartz (crystalline silica)
 Spektrofotometer Visible
Glass

21. Tombol Pengatur panjang
gelombang
Penunjuk panjang
gelombang
Penunjuk serapan & %
transmittance
Tombol pengatur cahaya
(A=0, T=100%)
Tempat sample Tombol on/off
Keterangan Alat

22. Cara Kerja Spektrofotometer
Spectronic 20 +
• Putar tombol on ke kanan. Biarkan 15 menit untuk
memanaskan alat. Atur tombol sampai menunjukkan
angka 0 pada petunjuk %T.
• Putar tombol pengatur gelombang untuk memilih
panjang gelombang yang sesuai.
• Memasukkan kuvet yang berisi paling sedikit 3 ml
akuadest ke dalam tempat sampel (sebelum
memasukkan kuvet, pastikan bahwa kuvet dalam
keadaan kering). Tutup penutup tempat sampel.
• Putar tombol pengatur cahaya sehingga %T
menunjukkan angka 100 / A menunjukkan angka 0.
• Angkat kuvet yang berisi aquadest dari tempat sampel.
Ganti isi kuvet dengan larutan blanko, baca serapannya.
• Ganti larutan blanko dalam kuvet dengan larutan
standar atau larutan uji. Baca serapannya.

23. Struktur kimia dan absorpsi UV
Larutan yang dapat dianalisis dengan
spektrofotometer UV  senyawa yang mempunyai
gugus kromofor
Gugus kromofor : gugus molekul yang mengandung
sistem elektronik yang dapat menyerap energi pada
daerah UV

24. Larutan yang dapat dianalisis dengan
spektrofotometer visible  senyawa yang berwarna
Contoh : KMnO4
Apabila senyawa tersebut tidak berwarna, maka perlu
ditambahkan pengompleks yang dapat membentuk
warna
Contoh : analisis logam Pb
Struktur kimia dan absorpsi Visible

25. Cara Perawatan dan Penyimpanan Alat
• 1. Sebelum digunakan, biarkan mesin warming-up
selama 15-20 menit.
• 2. Spektrofotometer sebisa mungkin tidak terpapar
sinar matahari langsung, karena cahaya dari matahari
akan dapat mengganggu pengukuran.
• 3. Simpan spektrofotometer di dalam ruangan yang
suhunya stabil dan diatas meja yang permanen.
• 4. Pastikan kompartemen sampel bersih dari bekas
sampel.
• 5. Saat memasukkan kuvet, pastikan kuvet kering.
• 6. Lakukan kalibrasi panjang gelombang dan
absorban secara teratur.

26. Kelebihan Spektrofotometer
• 1. Penggunaannya luas. Dapat digunakan
untuk senyawa organic, anorganik dan biokimia
yang diabsorbsi pada daerah ultraviolet maupun
daerah tampak
• 2. Sensitivitasnya tinggi. Batas deteksi untuk
mengabsorbsi dapat diperpanjang menjadi 10-6
sampai 10-7 M
• 3. Selektivitasnya tinggi
• 4. Ketelitiannya baik
• 5. Pengukurannya mudah, dengan kinerja yang
cepat

28. Suwun Hebak