13. Primers That Form Dimers
• A primer may form a dimer with itself or
with the other primer.
• Primer dimers can be an excellent, but
unwanted, substrate for the Taq
polymerase.
14. Primers That Form Hairpins
• A primer may be self-complementary and be able
to fold into a hairpin
• The 3´ end of the primer is base-paired,
preventing it annealing to the target DNA.
21. Optimising the PCR Reaction
• Annealing temperature of the primers.
• The concentration of Mg2+ in the reaction.
• The extension time.
• (The denaturing and annealing times.)
• (The extension temperature.)
• (The amount of template and polymerase
— “more is less”.)
22. Optimising the Annealing Temperature
• Primers have a
calculated annealing
temperature
(e.g. 54°C).
• Temperature must be
confirmed practically.
• Temperature steps of
2°C above and below.
23. Optimising the Mg2+ Concentration
• The fidelity of the
PCR depends on
[Mg2+].
• Vary [Mg2+] in steps
of 0.5 mM.
• Sometimes a
compromise between
yield and specificity.
24. Relazione tra Magnesio e dNTP
Aumentare la concentrazione dei dNTP richiede un adeguato aumento
delle concentrazione del Mg perche’ la reazione di PCR avvenga
25. Parametri fisici di PCR: numero di cicli
•La variazione di resa piu’ evidente e’ intorno ai 24 cicli; spesso 28-30x sono
sufficienti per la maggior parte degli amplimeri.
•Si ha solo un picolo guadagno aumentando il numero di cicli fino a 60x
26. Un esempio di mutation
detection: analisi dei geni
TSC in pazienti con diagnosi
clinica di Sclerosi Tuberosa
27. Tuberous Sclerosis Complex
Autosomica dominante: frequenza 1/6000
2 geni malattia: TSC1 (9q34) e TSC2 (16p13)
Sporadica (75%), familiare (25%)
Espressione clinica molto variabile:
da forme con chiazze ipomelanotiche e displasie corto-sottocorticali
cerebrali asintomatiche, ad epilessia, ritardo mentale, rabdomiomi cardiaci,
insufficienza renale e linfangioleiomomatosi polmonare.
Amartoma: lesione caratteristica in diversi organi
28. Criteri diagnostici di Sclerosi Tuberosa
1. Angiofibromi facciali o placche fibrose
2. Fibromi ungueali o periungueali non traumatici
3. Tre o più macchie ipomelanotiche
4. Chiazze zigrinate
Segni 5. Amartomi retinici nodulari multipli
maggiori
6. Tuberi corticali*
7. Noduli subependimali
8. Astrocitomi subependimali a cellule giganti
9. Rabdomiomi cardiaci, singoli o multipli
10. Linfangiomiomatosi**
11. Angiomiolipomi renali**
* Quando i tuberi corticali e l’eterotopia della sostanza bianca compaiono contemporaneamente, vengono considerati un unico
segno di sclerosi tuberosa
** Quando sia linfangiomiomatosi che angiomiolipomi renali sono presenti, devono essere presenti anche altri segni per poter porre
diagnosi di sclerosi tuberosa.
29. 1. Difetti focali dello smalto disseminati
2. Polipi amartomatosici rettali
3. Cisti ossee
Segni 4. Eterotopia della sostanza bianca*
minori
5. Fibromi gengivali
6. Amartomi extra renali
7. Aree ipopigmentate della retina
8. Macchie cutanee a “Coriandolo”
9. Cisti renali multiple
CERTA → presenza di due segni maggiori o di un segno maggiore e due segni minori.
PROBABILE → presenza di un segno maggiore e un segno minore.
POSSIBILE → presenza di un segno maggiore o due segni minori.
* Quando i tuberi corticali e l’eterotopia della sostanza bianca compaiono contemporaneamente, vengono considerati un unico segno
di sclerosi tuberosa
30. Segni TS sono età-dipendenti e non sono presenti in
tutti i pazienti
Retinal Hypomelanotic Facial Renal Cysts, Peri-Ungueal
hamartoma maculae Angiofibromas Angiomyolipomas Fibromas
Cardiac
Rhabdomyomas
Giant-Cell
Cortical Astrocytoma
Tubers
Subependymal
Nodules Lymphangio-
leiomyomatosis
Prenatal 20 week 0 5 10 Age (years) 20 30 40
36. Screening di mutazioni nei geni
TSC
• Dimensione dei due geni da analizzare (64 esoni)
• Mancanza di chiari hot spot mutazionali
• Diverse tipologie di mutazioni
Protocollo in uso
DHPLC (mut. puntiformi)/sequenza dei profili HD + MLPA
(delezioni)
Sensibilita’ dell’ 85-90%
37. HPLC:
High Performance Liquid Cromatography
• La cromatografia in fase liquida ad alte
prestazioni è una tecnica di separazione
ad elevata efficienza e selettività che
consente di caratterizzare differenti
molecole in base a specifiche
caratteristiche chimiche, chimico-fisiche
e steriche (dimensionali e strutturali).
38. Advantages of DHPLC
• No sample preparation, uses PCR products
directly
• Automated, run 24 hours a day unattended
• Perform 450 automated analyses per day
• Per analysis cost of under $1 per sample.
39. Considerazioni sui costi dell’analisi
Sequenza diretta = 6-8.50 euro
Costo del sequenziamento diretto (64
amplimeri) = 380-540 euro
Costo analisi dHPLC (64 amplimeri) = 64 euro
Numero di sequenze medie per pz (dopo
dHPLC) = 3 (18-25 euro)
Risparmio per ogni probando analizzato= 375 euro circa
41. Sistema cromatografico
E’ costituito da:
Fase stazionaria: solida, costituita da un
polimero di polistirene-divinil-benzene
(diametro dei pori circa 2 micron)
impaccata in una colonna cromatografica.
Fase Mobile: liquida, costituita dal solvente
( di solito un tampone) che scorre
attraverso la colonna.
44. Why denaturing HPLC…
Le molecole di DNA con gruppi fosfato della molecoladalDNA
Le cariche negative dei il mismatch eluiscono prima di
sono attratte dalle cariche positive dei gruppi ammonio del
sistema cromatografico (interazione più debole)
TEAA (controione)
48. Comportamento della molecola di DNA a
diverse Rtm: esone 12 TSC2
RTm 62.4 ° C
g.1312 A>T, p.K438X RTm 62 ° C
RTm +2 64 ° C Rtm 63.8 ° C MUT. POS
Ctrl emizig.
54. MOSAICISMO genetico
il gene mutato è presente in un individuo malato, ma non
in tutte le cellule o in tutti i tessuti
talvolta le cellule del sangue con la mutazione sono troppo
poche per essere identificate dal test
capelli
?
cute
sangue
55. MOSAICISMO: quanto frequente ?
2 o più figli con la stessa mutazione
e genitori sani, senza mut. nel sangue:
Mosaicismo nella linea germinale
5 su 211 famiglie ( 2-3 %)
Non tutte le cellule del
sangue del genitore malato
sono mutate: Mos.
Somatico
18 su 211 ( 8 % ) nel genitore malato nel probando
9 / 211 (4 %) 9 / 211 (4 %)
56. Paternal Mosaicism (DHPLC pos., SEQ. neg.)
M Mother
healthy Fam. 131
TSC2 ex 9
T A C C A G G
F homoz. Father
w.t. affected
seq.
T A C N A G G
D 991 C>T Daughter
Q325X affected
64° RTm+2
58. Polymorphisms in the seq. recognized by the
primers must be excluded using external
primers
Mut in CIS
preferential
amplification of
w.t. allele
Mut in
TRANS
preferential
amplification of
mutant allele
59. PRIMER EXTENSION
After amplification of a fragment of DNA
containing the SNP, an oligonucleotide primer
is annealed immediately upstream or
downstream from the SNP.
In the presence of the appropriate dNTPs and
ddDNTPs, the primer is extended (Sequenase)
by one or more bases depending upon the
sequence at the polymorphic site.
60. Principio della Primer Extension
Forward 20 bp
G Reverse
C
A
T
20 bp GA
+ ddGTP, ddATP + ddCTP, ddTTP
G C
A T
21 bp 21 bp
61. Fam. 131: Mosaicism confirmed by Primer
Extension Forward Reverse
C
Normal G
allele
C
Father
G 131.1 T A
Mutated allele (991 C>T) T
A
T C
G
Daughter
A 131.3
63. Advantages of MLPA
• Detection of copy number of 45 genomic DNA
sequences in a simple to perform, PCR based, reaction.
• Requires only 20 ng human DNA
• Only a thermocycler and a sequence type
electrophoresis system are required.
• Identical protocol for many different applications.
• High throughput ; Results available within 24 hrs.
• All reagents have proved to be very stable.
• Including electrophoresis, total reagent costs are < EUR
15,- / reaction.
64. Disadvantages of MLPA
Reactions are more sensitive to contaminants (PCR
inhibitors e.g. phenol)
Cannot be used to investigate single cells
Is not a method to detect unknow point mutations
66. Hybridysation & Ligation
1. The MLPA probemix is added to denatured genomic
DNA
2. The two parts of each probe hybridise to adjacent
target sequences
3. Probes are ligated by a thermostable ligase
67. Amplification
4. A universal primer pair is used to amplify all ligated
probes.
The amplification product of each probe has a unique
length (130 480 bp).
