1. UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SALERNO
Facoltà di Farmacia
Corso di Laurea in Chimica e tecnologia farmaceutiche
A.A. 2010/2011
Progettazione e sintesi di
potenziali inibitori della
Telomerasi ad azione sulle G-
quadruplex
Prof. Simona Concilio Irma Spiniello
176000265
2. I Telomeri
Complessi nucleoproteici localizzati alle
estremità dei cromosomi.
Sono costituiti da sequenze ricche in
guanine (5’-TTAGGG-3’).
La cellula può acquisire la capacità di
replicarsi indefinitamente, divenendo
immortale: l’evento fondamentale è la
riattivazione dell’enzima telomerasi.
Moyzis R.K., Buckingham J.M., Cram L.S., Dani M., Deaven L.L., Jones M.D., Meyne J., Ratliff R.L., Wu J.R., (1988),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6622-6626
3. La Telomerasi:
l’enzima dell’immortalità cellulare
Ribonucleoproteina costituita da:
subunità hTERT
subunità hTR
Attiva nell’80-85% delle cellule
tumorali, e nelle cellule germinali e
staminali.
Ha un importante ruolo biologico: è
coinvolta nel mantenimento della
lunghezza dei telomeri.
Burger A. M., Bibby M. C., Double J. A., (1997),Brit. J. Cancer, 75,516
4. Meccanismo d’azione
L’allungamento del telomero si
realizza in diversi passaggi:
Ibridazione del templato di RNA
con il filamento di DNA
Il templato non ibridizzato fa da
stampo per la subunità hTERT
Il filamento neosintetizzato viene
traslocato in direzione 5’lungo lo
stampo di RNA
Neidle S., Parkinson G., (2002), Nat. Rev. Drug Discov., 1, 383- 393;
5. Terapia
antitelomerasica
Azione diretta Azione indiretta
Farmaci attivi Farmaci attivi sulla Farmaci attivi sul
sulla subunità subunità subustrato
hTERT hTR telomero
Farmaci Farmaci con
citotossici Stabilizzatori
azione sulle di strutture
convenzionali proteine POT1 e G-quadruplex
(Cisplatino) TRF1
6. Le quadrupliche eliche del DNA
Strutture secondarie costituite da sequenze
di acidi nucleici ricche in guanine.
I G-quartetti sono generati attraverso legami
idrogeno tra quattro guanine .
Distribuiti in tutto il genoma umano: nei
telomeri e nei promotori del gene (hTERT)
e dei proto-oncongeni (c-myc,VEGF,c-kit e
BCL2 )
7. Polimorfismo delle G-quadruplex
Le strutture G-quadruplex si
possono classificare in varie classi
in base ai seguenti parametri:
Stechiometria e orientamento
delle catene
Geometria dei loop
Conformazione glicosidica
8. Obiettivo della tesi
Induzione e/o stabilizzazione delle
G-quadruplex del DNA telomerico
Inibizione
della
Telomerasi
AZOMOLECOLE CARBAZOLI
9. Azomolecole
Caratteristiche strutturali :
nucleo aromatico azobenzene
due catene laterali aventi
gruppi carichi positivamente,
in posizione para
Introduzione di un anello
1,1-etil-metilpirrolidinico
AZO3
10. Switching conformazionale delle
G-Quadruplex
Wang X., Huang J., Zhou Y., Yan S., Weng X., Wu X., Deng M., and Zhou X., Angew. Chem. Int., 49, 5305 –5309
11. 1. Sintesi dell’AZO1
NH2 OH
HO
0°C 1) HCl (acq) 0°C KOH/MeOH
2) NaNO2(acq)
N2 O
+
HO
0°C
2h
OH
Reazione di Sostituzione Elettrofila
N
N Aromatica (diazocopulazione)
HO
AZO1
12. Caratterizzazione: AZO1
1) Osservazione al microscopio ottico
Aspetto cristallino ad aghi
2) 1H NMR
• Protoni aromatici nella zona
tra 6.5 ppm e 8 ppm
• Protone fenolico intorno a 10
ppm
13. CHCl3 3) Spettroscopia UV-VIS
• max=355 nm sistema azobenzene coniugato
• max=239 nm anelli aromatici
4) Spettroscopia IR
• 3193,5 cm-1 stretching dell’OH
• 1587 cm-1 stretching del gruppo azo
• 1238 cm-1 stretching del legame c-o
5) DSC
• Picco di fusione a 228,66 C
• Decomposizione del composto, dopo la
fusione
14. 2. Sintesi dell’AZO2
N
OH O
N Cl
N aH , D M Fdry
N N
70-80°C
N N
OH O
AZO1
N
AZO2
15. Caratterizzazione: AZO2
1) Osservazione al microscopio
Il composto presenta un aspetto cristallino
2) 1H NMR
Il segnale dell’H2O a 3.3
ppm e del DMSO-d a 2.5
ppm non hanno permesso
l’identificazione di alcuni
segnali nella zona alifatica
16. 3) Spettroscopia IR
• A 1588,24 cm-1 lo stretching del gruppo azo
• A 1217 cm-1 lo stretching del legame c-o
4) DSC
• Picco di fusione a 192 C
• Decomposizione dopo fusione
17. 3. Sintesi dell’AZO3
La reazione viene eseguita per 24h N N
I
O O
C H 3I
T H F d ry
N 4 5 °C N
N N
O O
N N
I
AZO2 AZO3
18. Caratterizzazione: AZO3
1) Osservazione al microscopio
• Aspetto cristallino
• Punto di fusione superiore a 250 C
2) 1 H NMR
• Il segnale dell’H2O, a 3.3 ppm, copre i
segnali della catena CH2-CH2 e quello
dei CH3 sugli atomi di azoto
• Il segnale del DMSO-d a 2.5 ppm copre
i segnali dell’anello pirrolidinico
• Il segnale a 2.42 ppm è dovuto a
iodometano residuo
19. Obiettivo della tesi
Induzione e/o stabilizzazione delle G-
quadruplex del DNA telomerico
Inibizione
della
Telomerasi
AZOMOLECOLE CARBAZOLI
20. Carbazoli
NH2
Caratteristiche strutturali
Sistema planare aromatico
carbazolo
N Due catene laterali aventi
gruppi carichi positivamente in
posizione 3 e 6
I I
N N
Introduzione di un segmento
4-amminofenilico in
posizione 9
21. 1. Sintesi del CARB1
Per ottenere il composto
CARB 1 sono stati necessari
diversi tentativi di sintesi
Cicli vuoto/azoto sul pallone di
reazione e anidrificazione dei
reagenti di partenza
La reazione viene eseguita in
ambiente inerte per 48h
NO2
H
N
F NO2
Br Br
N aH , D M F dry, 70-80°C N
Br Br
CARB1
23. 2) ( 1H NMR)
• I protoni aromatici nella zona
compresa tra 7 e 8.5 ppm
• I segnali tra 1 e 1.5 ppm
impurezza del reagente di
partenza 3,6-dibromo-9-H-
carbazolo
3) Spettroscopia IR
• NO2: stretching asimmetrico a 1592,85 cm-1
stretching simmetrico a 1334,89 cm-1
24. 2. Sintesi del CARB2
NO2 NH2
S n C l 2 .2 H 2 O
60 °C
N N
E tO H ab so lu te
Br Br Br Br
CARB1 CARB2
Reazione a riflusso per 48 h
25. Caratterizzazione:CARB2
1) DSC
• Picco di fusione 222,033 C
• Durante la fase di raffreddamento, il composto
ricristallizza a 183,96° C
26. 2) ( 1H NMR)
• Gruppo NH2 aromatico a 4 ppm
• I segnali tra 1 e 1.5 ppm impurezze
del 3,6-dibromo-9-H-carbazolo
3) Spettroscopia IR
• Lo stretching a 3283,64 cm-1 e il bending
a 1621,29 cm-1del gruppo amminico
• Lo stretching del legame C-N a
1227,45 cm-1
27. 3. Sintesi del CARB3
Reazione di Heck
Una serie di cicli freeze and thaw, prima
della sigillazione della fiala di vetro sotto azoto
Il composto è in fase di caratterizzazione
A questa reazione seguirà la protezione del
gruppo NH2 con il gruppo protettore Fmoc e
l’ultimo step di metilazione degli atomi di azoto
degli anelli della piridina.
NH2
N N
N
N
N
P d(O A c) 2 + T rifen ilfo sfin a
Br Br
E t 3 N /T H F d ry 1 0 5°C
CARB2
NH2
CARB3
28. Le conclusioni
La struttura delle molecole sintetizzate è stata studiata e realizzata
proprio al fine di promuovere l’interazione con le quadruple eliche di
DNA
Il presente lavoro di tesi prevede un prosieguo rivolto sia al
completamento della sintesi del composto a base carbazolo, sia
all’analisi della effettiva attività di inibizione della telomerasi da parte
dei composti sintetizzati.
