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03 dna replicazione

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03 dna replicazione

  1. 1. Capitolo 3 La replicazione del DNA Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A http://www.guidobarbujani.it/index.php/1-genetica
  2. 2. Domande 3 • Come avviene la replicazione del DNA? • Quali enzimi sono necessari? • I procarioti hanno poco DNA da replicare, gli eucarioti tanto. Procedono allo stesso modo, o in modi differenti?
  3. 3. Figura 3.1 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Tre modelli di replicazione del DNA
  4. 4. Figura box 3.1 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Centrifugazione in CsCl per la separazione di molecole di diversa densità
  5. 5. Figura 3.2 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Meselson e Stahl 1958
  6. 6. La replicazione del DNA è semiconservativa
  7. 7. Colture di cellule di porcellino d’India Aggiunta di 5-BUdR, analogo della timina, con minore tendenza a legarsi al colorante fluorescente Due cicli di replicazione: 1.TT, TT TU, UT 2. TU, UT TU, UU Cromosomi arlecchino Prova citologica della replicazione semiconservativa
  8. 8. Tre fasi nella replicazione del DNA 1. Inizio 2. Allungamento della catena 3. Fine
  9. 9. Allungamento della catena: Le DNA Polimerasi • Possono aggiungere un nucleotide all’estremità 3’ libera di una catena di acido nucleico, se dispongono di nucleotidi trifosfati • Possono rimuovere un nucleotide all’estremità 3’ o 5’ di una catena di acido nucleico • Non possono iniziare la replicazione se non dispongono di una catena con l’estremità 3’ libera • Non possono legare fra loro due frammenti di DNA
  10. 10. Le DNA P di Escherichia coli
  11. 11. Nella replicazione di Escherichia coli DNA stampo (elica singola) + primer + dATP, dCTP, dGTP, dTTP una DNA polimerasi DNA a doppia elica Energia di legame 5’---(n-nucl)---3’ + dXTP  5’---(n+1-nucl)---3’ + energia La DNAP III: Allunga la doppia elica in direzione 5’—3’ Controlla l’appaiamento fra basi, e se è imperfetto rimuove l’ultimo nucleotide aggiunto (attività proof-reading) La DNAP I: Degrada l’RNA nella doppia elica in direzione 5’—3’ Allunga la doppia elica, estendendo il frammento in direzione 5’—3’ e rimpiazzando l’RNA stampo La DNA PII: ripara il DNA danneggiato
  12. 12. Figura 3.3 Allungamento della catena di DNA
  13. 13. Correzione di bozze: Meccanismo d’azione delle DNA P III batteriche (attività esonucleasica 3’ → 5’) Subunità Q
  14. 14. Figura 3.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A •Proteina iniziatrice (DnaA) •SSB (single-strand binding proteins •Elicasi (DnaB e DnaC) •Primasi = RNA P Inizio della replicazione La replicazione del DNA inizia con la produzione di RNA
  15. 15. Inizio della replicazione: elica leading e elica lagging
  16. 16. La replicazione procede nelle due direzioni a partire dalla forcella Frammenti di Okazaki
  17. 17. Durante la replicazione, la stessa elica è, in tratti diversi, leading e lagging
  18. 18. La “bolla replicativa”
  19. 19. Figura 3.5 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A In sintesi:
  20. 20. Figura 3.9 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Filamento leading e filamento lagging occupano entrambe le eliche, in posizioni diverse
  21. 21. Figura 3.7 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Fine della replicazione: la ligasi
  22. 22. Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Figura 3.6 Fine della replicazione
  23. 23. Figura 3.10 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Replicazione di cromosomi circolari Nella foto: SV40
  24. 24. I superavvolgimenti sono un problema per la replicazione di cromosomi circolari 100 superavvolgimenti
  25. 25. Azione della topoisomerasi
  26. 26. https://www.youtube.com/watch?v=vA2itKIDPPo
  27. 27. Mechanism of Action of Topoisomerase UCSD https://www.youtube.com/watch?v=3QWA-tFdGN8
  28. 28. Schema dei passaggi enzimatici nella replicazione di E. coli 1. La topoisomerasi fa rilassare il filamento 2. La proteina iniziatrice si lega a ori-C 3. Due elicasi (una per ciascuna forca replicativa) denaturano e svolgono un tratto della doppia elica 4. Le single-strand binding proteins stabilizzano il DNA ad elica singola, senza coprire le basi 5. La RNA polimerasi (primasi) si lega all’elicasi e sintetizza un innesco di circa 30 paia di basi 6. La DNA P III lo estende da 5’ a 3’ 7. Ad ogni passaggio la DNA P III rimuove gli appaiamenti sbagliati (proof-reading) 8. La DNA P I degrada l’innesco ed estende il frammento adiacente, procedendo da 5’ a 3’ 9. La ligasi salda i filamenti adiacenti, senza aggiungere alcun nucleotide
  29. 29. Due eccezioni ΦX174: DNA a singolo filamento DNA P DNA P
  30. 30. Due eccezioni Mosaico del tabacco: RNA DNA P* * DNA polimerasi RNA dipendente! (trascrittasi inversa) DNA P
  31. 31. Ciclo cellulare in Eucarioti e procarioti (ore) Organismo M G1 S G2 Totale E. coli 1 Lievito 20’ 25’ 40’ 35’ 2 Piante 1 8 12 8 29 Uomo 1 8 10 5 24 Velocità di replicazione: E. coli: 50000 basi al minuto Drosophila: 2600 basi al minuto Topo: 2200 basi al minuto Il genoma umano è circa 1000 volte più grande di quello di E. coli
  32. 32. Figura 3.13 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Negli Eucarioti, molte bolle di replicazione in ogni cromosoma I cromosomi eucarioti sono lineari, non circolari
  33. 33. Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Figura 3.14 Diverse regioni del cromosoma si replicano simultaneamente
  34. 34. Quando tutto il DNA è stato replicato, per legare fra loro i frammenti ci vuole la ligasi La ligasi catalizza la formazione di un legame fosfodiestereo
  35. 35. Negli eucarioti superiori DNA P α: sintesi del primer DNA P β: riparazione del DNA nucleare DNA P γ: replicazione, solo nei mitocondri DNA P δ: sintesi dell’elica lagging DNA P ε: sintesi dell’elica leading* * Finora dimostrato solo nel lievito SPECIE Dimens. genoma N repliconi velocità replicazione/min E. coli: 4,2 Mb 1 50000 Drosophila: 140 Mb 3500 2600 Topo: 3200 Mb 25000 2200
  36. 36. In sintesi, negli eucarioti superiori DNA Pε DNA Pδ
  37. 37. E alla fine? Figura 3.15 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
  38. 38. Telomerasi Le regioni terminali dei cromosomi (telomeri) contengono sequenze ripetute: Ciliati (Tetrahymena): n(TTGGGG) Flagellati (Trypanosoma), uomo: n(TTAGGG) L’enzima telomerasi contiene un tratto di RNA complementare alla sequenza ripetuta e lo usa come primer per replicare l’estremità telomerica 5’: è una DNA P – RNA dipendente Carol Greider
  39. 39. Figura 3.16 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Come funziona la telomerasi
  40. 40. Come funziona la telomerasi
  41. 41. Figura 3.17 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Ma ancora non è finita: si raddoppiano anche i nucleosomi
  42. 42. Negli eucarioti, sintesi e degradazione di cicline, prodotte da geni-orologio regolano il ciclo cellulare
  43. 43. Riassunto 3 • La replicazione del DNA è semiconservativa: un’elica serve da stampo e viene mantenuta invariata, l’altra viene sintetizzata ex novo. • La replicazione richiede l’intervento di enzimi: RNA e DNA polimerasi, ligasi, elicasi e topoisomerasi, e di altre proteine • Nei procarioti la replicazione procede da un unico punto iniziale, negli eucarioti ciascun cromosoma ha varie origini di replicazione da cui iniziano sintesi simultanee; in questo modo, un insieme di enzimi complessivamente più lento riesce a ridurre i tempi di replicazione del DNA eucariote. • Nella replicazione dei genomi lineari, ha un ruolo importante la telomerasi

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