Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida yang mengandung unsur-unsur C, H, O, N dan ada pula yang mengandung unsur S dan P. 

1. KELOMPOK 7 :
1. AYU ANASTASYA (F1C1 13 086)
2. NURSAN (F1C1 13 028)
3. KEKE AWALIYAH (F1C1 13 020)
4. RISNAWATI (F1C1 13 066)

2. 1
Definisi Protein
Sifat dan Jenis Protein
Definisi Westren Blot
Teknik Westren Blot
Teknik Isolasi Protein

3. Definisi Protein
Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul
tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer
asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan
ikatan peptida yang mengandung unsur-unsur C, H, O, N
dan ada pula yang mengandung unsur S dan P.

4. Definisi Protein
Protein terletak didalam sel makhul hidup, terutama dalam membran
sel baik itu pada sel hewan maupun pada sel tumbuhan.

5. Sifat – Sifat Protein
Mempunyai titik lebur besar dibanding senyawa karboksilat dan amina
1. Dalam larutan dapat membentuk ion zwitter
Mempunyai momen dipol besar
Bersifat amfoter
Bersifat elektrolit yaitu kurang basa dibanding amina dan kurang asam dibanding karboksilat
Mempunyai kurva titrasi yang khas
Mempunyai pH isoelektrik yaitu pH pada saat asam amino tidak bermuatan

6. Struktur Protein

7. Struktur Dasar Asam Amino

8. Protein intra seluler merupakan jenis protein yang di produksi
dari dalam sel
Protein ekstra seluler merupakan jenis protein yang di
produksi dari dalam sel dan kemudian dikeluarkan, sehingga
protein tersebut berada di luar sel
contohnya: enzim α-amilase pada bakteri
Tipe Protein Berlainan

9. Protein from cells or tissue
Microbial cells
or tissue
Break cells,
tissue, or organ
Blender,
homogenizer,
sonication,
pressure,
osmotic shock
Pellet with intact cells, organelles, membranes and membrane proteins
Supernatant with
Soluble protein
Separated by centrifugationpurification
Choose a suitable clone INOCULATION in fermenter
Extraction
INTRACELLULAR
EXTRACELLULAR
Desired
cells
STEPS INVOLVED IN EXTRACTION OF
PROTEINS

10. Isolasi Protein
Isolasi protein adalah suatu cara memisahkan protein
dari makromolekul yang lain atau memisahkan
protein dari protein lain yang tidak diinginkan.
Secara sederhana, proses dari isolasi
protein konsepnya sama dengan isolasi
DNA, hanya saja isolasi protein
menggunakan buffer lysis untuk
melisiskan sel.

11. Faktor-faktor yang mempengaruhi isolasi
protein
 Suhu
 pH
 Radiasi
 Pelarut Organik
 Ion Logam
 Enzim-enzim
 Perlakuan mekanis
 Penambahan garam

12. Isolasi Protein Intraseluler
Secara Umum
Sel
Lisis
Sentrifugasi
Pelet Supernatan

13. Pelisisan Sel
Mekanik
1
Kimiawi
2
Metode Pelilisan Sel
Homogenisasi tingkat tinggi
Ekstruksi tekanan tinggi
Metode blending
Penggerusan
Sonikasi
Larutan buffer
Detergen
Kelator
Inhibitor protease

14. Pelisisan Sel
Pengerusan
Mekanik
1
Untuk memecah dinding sel dan memperluas
permukaan sampel agar dapat mempermudah
proses ekstraksi sehingga Interaksi antara
sampel dan pelarut akan semakin luas.

15. Pelisisan Sel
Kimiawi
2
Penambahan Larutan
Buffer
Penambahan buffer ekstrak selama
penggerusan bertujuan untuk
mempertahankan agar kondisi
komponen sel tetap optimum seperti
keadaan yang sebenarnya dan tidak
mengalami perubahan.

16. Pelisisan Sel
Kimiawi
2
Detergen
P
O
O
O
O
H2
C
H
C
O
H2C
O
CCO O
R R Fosfolipid
Penambahan detergen selama
penggerusan bertujuan Untuk
memecah membran sel yang
penyusun utamanya fosfolipid
sehingga akan terjadi reaksi
saponifikasi antara fosfolipid dan
detergen pada sel.

17. Pelisisan Sel
Kimiawi
2
Klasifikasi Detergen
Detergen Ionik : dapat memecah
interaksi protein-protein
a
Detergen Nonionik : dapat
memecah interaksi lipid-lipid dan
interaksi lipid-protein
b

18. Pelisisan Sel
Kimiawi
2
Kelotor
Penambahan kelator selama penggerusan
bertujuan untuk menghilangkan ion-ion
aktivator enzim protease. Misalkan EDTA
dapat berperan sebagai chelating agent
dalam isolasi protein. EDTA dapat
mengkelat ion Ca2+ yang dapat berperan
sebagai aktivator enzim protease.EDTA (Etilen Diamin Tetraasetat)

19. Pelisisan Sel
Kimiawi
2
Inhibitor
Protease
Enzim protease adalah enzim yang
dapat memutuskan ikatan peptida
antara asam amino satu dengan asam
amino yang lain.
Untuk mencegah
proses pemutusan
ikatan peptida pada
protein, yaitu dengan
cara : Isolasi protein
dilakukan pada
temperatur rendah (4
oC) dan penambahan
inhibitor seperti EDTA
Pada sel hewan, enzim protease
berasal dari lisosom. Sedangkan,
pada sel tumbuhan enzim
protease berasal dari vakuola

20. Sebelum Sentrifuge
Ditambahkan Amonium Sulfat
NH4
+
2
S
O
O
O
O
Untuk presipitasi garam secara salting out, sehingga
menyebabkan interaksi hidrophobik antar molekul protein.
Interasi hidrophobik antar molekul protein akan mengakibatkan
kelarutan protein menjadi rendah dan akan mengakibatkan
penggumpalan, sehingga mudah dapat dipisahkan dengan
sentrifuse. Penggunaan amonium sulfat lebih didasarkan pada
sifat kelarutannya yang tinggi, tidak merusak struktur protein.

21. Sentrifuge
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan
cara memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi yang lebih berat akan berada di dasar,
sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas.
Supernatan
Pelet
Memiliki bobot lebih rendah
Memiliki bobot lebih tinggi
Siap untuk di
deteksi

23. Pemurnian Protein
• Secara umum proses pemurnian protein dilakukan dengan menggunakan
metode kromatografi kolom penukaran ion

24. Pemisahan dengan kromatografi penukar ion didasarkan atas interaksi
muatan ionik yang berbeda dari komponen sampel terhadap sisi aktif
muatan pada matrik penukar ion

25. Definisi Western Blot
W. Neal Burnette
1. Western blot adalah proses pemindahan
protein dari gel hasil elektroforesis ke
membran
2. Membran ini dapat diperlakukan lebih
fleksibel daripada gel sehingga protein
yang terblot pada membran dapat
dideteksi dengan cara visual maupun
fluoresensi
3. Deteksi ekspresi protein pada organisme
dilakukan dengan prinsip imunologi
menggunakan antibodi primer dan
antibodi sekunder

26. TujuanWestern Blot
1. Mengetahui keberadaan & berat
Molekul protein sampel pada campuran
2. Membandingkan reaksi silang antar
protein
3. Mempelajari modifikasi protein selama
sintesis

27. Teknik Western Blot
Elektroforesis
1
Elektrotransfer
2
Deteksi
3
Pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul
dalam suatu tegangan listrik tertentu
Pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer
menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong
Deteksi protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen
dan antibodi yang bersifat spesifik

28. Teknik Western Blot

29. Elektroforesis
1. Dalam elektroforesis, sampel yang
mengandung protein biasanya dicampur
dengan SDS (sodium dodecyl sulfat)
2. Muatan negatif SDS tersebut mengganggu
kestabilan protein, sehingga protein
mengalami denaturasi.
3. Suatu protein multimer juga akan terurai
menjadi monomer penyusunnya
4. Sampel dengan protein rantai polipeptida lurus
tersebut dimasukkan dalam suatu membran
poliakrilamid yang dialiri arus listrik
5. Dalam gel poliakrilamid tersebut akan
terbentuk pita-pita yang merupakan protein-
protein yang telah terpisah berdasarkan berat
molekul

30. Elektrotransfer
Blotting semi kering
menggunakan kertas saring
yang telah dibasahi dengan
buffer transfer
1
Blotting basah tidak
menggunakan kertas saring
diantara gel poliakrilamid dan gel
transfer, tetapi kedua gel tersebut
diimpitkan dan direndam dalam
buffer transfer
2
Gel transfer yang
umum digunakan pada
WB ada dua, yaitu
nitroselulosa dan nilon.

31. Deteksi Protein
Berdasarkan penggunaan antibodi primer dan antibodi sekunder, ada dua
metode deteksi, yaitu:
Metode langsung menggunakan
antibodi primer yang telah
terkonjugasi dengan
molekulmarker
1
Metode tidak langsung
menggunakan antibodi primer
dan antibodi sekunder
2
• Antibodi primer berfunsi mengikat protein target
• Antibodi sekunder berfungsi mengikat antibodi primer dan
terkonjugasi dengan molekul penanda
• Molekul penanda yang umum digunakan diantaranya adalah
enzim alkalin fosfatase (AP), enzim horsedish peroksidase
(HRP), immunogold, dan 125I