UPLC-MS/MS và QuEChERS phân tích dư lượng thuốc trừ sâu trong các sản phẩm nông nghiệp

1. Học viên:Tào Văn Thuận
GVHD: T.S Nguyễn Trung Dũng
UPLC-MS/MS và QuEChERS phân tích dư lượng
thuốc trừ sâu trong các sản phẩm nông nghiệp
UPLC – MS/MS
& QuEChERS

2. NỘI DUNG CHÍNH
I. Tổng quan về thuốc BVTV
II. Các phương pháp xác định dư lượng thuốc
BVTV trong sản phẩm nông nghiệp
III. Tổng quan phương pháp UPLC-MS/MS &
QuEChERS
IV. Ứng dụng UPLC-MS/MS & QuEChERS phân
tích dư lượng thuốc trừ sâu trong các sản phẩm
nông nghiệp.

3. I. TỔNG QUAN THUỐC BVTV
KHÁI NIỆM
Thuốc BVTV là tên gọi chung để chỉ các sản phẩm hóa chất
được dùng trong nông nghiệp, lâm nghiệp nhằm mục đích
ngăn ngừa, phòng trừ và tiêu diệt các đối tượng gây hại cho
cây trồng, cho nông lâm sản hay để điều hòa, kích thích sinh
trưởng cho cây trồng từ đồng ruộng cho đến kho bảo quản.

4. I. TỔNG QUAN THUỐC BVTV
CÁC NHÓM THUỐC BVTV
Nhóm Clo
hữu cơ
Nhóm lân
hữu cơ
Nhóm
Carbamat
Nhóm có nguồn gốc
tự nhiên (Pyrethroid)

5. CÁC NHÓM THUỐC BVTV
Nhóm Clo hữu cơ
(cơ Clo )
Thành phần hóa
học có chứa clo và
clo có tác dụng
chính
Độc, bền vững
trong môi trường
tự nhiên

6. CÁC NHÓM THUỐC BVTV
Nhóm lân hữu cơ
(cơ Phospho)
(organophosphorus)
là dẫn xuất hữu cơ
của acid
photphoric.
Độc tính cao, dễ bị phân
hủy khi để dưới ánh
sáng.

7. CÁC NHÓM THUỐC BVTV
Nhóm Carbamat
dẫn xuất hữu cơ
của acid cacbamic
Độc tính cao, ít
bền vững
Carbofural
Carbaryl (Siven)
Fenobucarb

8. CÁC NHÓM THUỐC BVTV
Nhóm tự nhiên hay
Pyrethroid)
có nguồn gốc tự
nhiên, cấu trúc
phức tạp
- Nhanh chóng bị
phân hủy
- độc tính thấp

9. Ngoài ra, còn có một số nhóm khác như:
các chất trừ sâu vô cơ (nhóm asen), nhóm
thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi
khuẩn, nấm, virus (thuốc trừ nấm, trừ vi
khuẩn…), nhóm các hợp chất vô cơ (hợp
chất của đồng, thủy ngân).
CÁC NHÓM THUỐC BVTV

10. • Hiện nay, nhóm clo hữu cơ đã bị cấm sử dụng,
nhóm PY(tự nhiên) vẫn đang được sử dụng
nhưng độc tính thấp, ít có khả năng gây nhiễm
độc cho người sử dụng. Còn lại 2 nhóm: lân hữu
cơ và carbamat đang được dùng rộng rãi trong
nông nghiệp, có độc tính cao và là nguyên nhân
chính của phần lớn các vụ ngộ độc do ăn rau quả
nhiễm hóa chất bảo vệ thực vật ở nước ta hiện
nay. Tuy đã bị cấm sử dụng, tuy nhiên lượng
thuốc cơ clo vẫn còn tồn tại trong môi trường.

11. DƯ LƯỢNG THUỐC BVTV
Là lượng chất độc còn lưu lại trong nông sản
hoặc môi trường sau khi phun thuốc BVTV.
Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL): giới
hạn dư lượng, được phép tồn tại trên nông sản,
thức ăn gia súc mà không gây hại cho người và vật
nuôi khi sử dụng.

12. TÁC HẠI CỦA CÁC HỢP CHẤT BVTV
Hầu hết hóa chất BVTV đều độc với con
người và động vật máu nóng ở mức độ khác
nhau (ngoài ra còn đầu độc môi trường):
- Chất độc cấp tính: Ở dưới liều gây chết,
chúng không đủ khả năng gây tử vong, dần
dần bị phân giải và bài tiết ra ngoài.
- Chất độc mãn tính: Có khả năng tích lũy
lâu dài trong cơ thể vì chúng rất bền, khó bị
phân giải và bài tiết ra ngoài.

13. TÁC HẠI CỦA CÁC HỢP CHẤT BVTV
Khi tiếp xúc với hóa chất BVTV con người có
thể bị nhiễm độc cấp tính hoặc mãn tính, tùy
thuốc vào phạm vi ảnh hưởng của thuốc
- Nhiễm độc cấp tính: mệt mỏi, ngứa da, đau
đầu, lợm giọng, buồn nôn, hoa mắt, chóng
mặt, mất ngủ, tăng tiết nước bọt, chảy nước
mắt, nếu nặng có thể gây tử vong…
- Nhiễm độc mãn tính: kích thích các tế bào
ung thư phát triển, gây đẻ quái thai, dị dạng,
suy giảm trí nhớ và khả năng tập trung, suy
nhược nghiêm trọng, ảnh hưởng đến hệ thần
kinh và não…

14. QUY ĐỊNH ĐỘ ĐỘC CỦA THUỐC BVTV
Việt Nam hiện áp dụng nguyên tắc phân loại của Tổ Chức Y Tế
Thế Giới.
LD50 (trên chuột) cấp tính của thành phẩm (mg/kg).

15. QUY ĐỊNH LƯỢNG TỒN DƯ
CỦA THUỐC BVTV TRONG THỰC PHẨM

16. QUY ĐỊNH LƯỢNG TỒN DƯ
CỦA THUỐC BVTV TRONG ĐẤT

17. QUY ĐỊNH LƯỢNG TỒN DƯ
CỦA THUỐC BVTV

18. II. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG THUỐC BVTV
Phương pháp cực phổ
Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
Phương pháp sắc ký lỏng, LC/MS
Phương pháp sắc ký khí, GC/MS
Phương pháp sắc ký khí lỏng hiệu năng cao HPLC, UPLC, UPLC/MS-
MS

19. II. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP
UPLC/MS-MS & QuEChERS

20. PHƯƠNG PHÁP UPLC (Ultra
Performance Liquid Chromatography)
• Công nghệ Sắc ký lỏng siêu hiệu năng
cao là phương pháp phân tích sắc ký lỏng
giúp tăng cường chủ yếu trong ba lĩnh
vực: tốc độ, độ phân giải và độ nhạy
• Việc tách và định lượng trong UPLC được
thực hiện dưới áp suất rất cao (lên đến
100M Pa).

21. PHƯƠNG PHÁP UPLC (Ultra
Performance Liquid Chromatography)

22. PHƯƠNG PHÁP UPLC (Ultra
Performance Liquid Chromatography)

23. PHƯƠNG PHÁP UPLC (Ultra
Performance Liquid Chromatography)

24. PHƯƠNG PHÁP UPLC (Ultra
Performance Liquid Chromatography)
- Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy
đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-
MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy
cao thường được sử dụng là SRM
và MRM
- SRM (Selected Reaction Monitoring) và
MRM (Multiple Reaction Monitoring)
KỸ THUẬT GHI PHỔ MRM VÀ RSM

25. PHƯƠNG PHÁP UPLC (Ultra
Performance Liquid Chromatography)
KỸ THUẬT GHI PHỔ MRM VÀ RSM
- SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập
đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần
quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.
- MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với
phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ
2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn
SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ
nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là
buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc
nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu
dò để phát hiện.

26. PHƯƠNG PHÁP UPLC (Ultra
Performance Liquid Chromatography)
KỸ THUẬT ESI
ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp
chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn.
ESI có khả năng tạo thành những ion đa điện tích (dương
hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế)
Trong ESI, các ion được hình thành như sau:

27. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT MẪU QuEChERS
- QuEChERS là tên viết tắt của cụm từ Quick
(nhanh)-Easy (dễ)-Cheap (rẻ)-Effective (hiệu
quả) – Rugged (ổn định) – Safe (an toàn)
- Phương pháp chiết xuất này được phát
triển bởi S. Lehotay và M. Anastassiades
tại USDA / ARS-ERRC ở Wyndmoor /
Pennsylvania.

28. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT MẪU QuEChERS
NGUYÊN TẮC TiẾN HÀNH
• Phương pháp QuEChERS tiến hành trên
nguyên tắc chiết và làm sạch mẫu:
- Quá trình chiết sử dụng các dung môi như
acetonitrile hoặc hỗn hợp acetonitrile với axid
fomic, axit acetic… với các tỷ lệ khác nhau tùy
theo Ph của chất cần phân tích và nền mẫu.
- Quá trình tách sử dụng PSA, muối MgSO4 ,
GCB, C18 tùy theo nền mẫu và chất cần phân
tích.

29. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT MẪU QuEChERS
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

30. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT MẪU QuEChERS
Ưu điểm
- Áp dụng cho dãy rộng các chất trừ sâu, bao
gồm cả những chất khó phân tích.
- Có độ chính xác cao, độ thu hồi trên 70%, có
thể hiệu chỉnh và cải tiến phương pháp trên
các nền mẫu khac.
- Khối lượng mẫu phân tích cần ít 5-10g
- Dung môi sử dụng ít, ít chất thải độc hại cho
môi trường và người phân tích.

31. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT MẪU QuEChERS
Hạn chế của phương pháp
- Sử dụng QuEChERS đòi hỏi detector phải có độ
nhạy cao như MS/MS, huỳnh quang, ECD..
- Dung môi sử dụng là acetonitrile nên không phù
hợp với phân tích GC, phải có quá trình chiết với
n-hexane, toluene trước khi đưa vào phân tích
GC
- Hiệu suất thu hồi bị ảnh hưởng bởi PH, vì vậy cần
có sự điều chỉnh PH phù hợp trong quá trình
chiết

32. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT MẪU QuEChERS
VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ LoẠI HÓA CHÂT TRONG
QuEChERS
- MgSO4 có vai trò loại phtalat và nước
- Carb (graphitized carbon black) có tác dụng
loại bỏ các sắc tố và độ nhớt trong rau, củ,
quả
- PSA (N-primary secondary amine) đóng vai trò
chất hấp phụ

33. BÀI BÁO
“Tối ưu hóa và thiết lập phương pháp QuEChERS-UPLC-
MS/MS để phát hiện đồng thời các loại dư lượng thuốc trừ
sâu trong trái cây và rau”

34. BÀI BÁO
-Những năm gần đây việc lạm dụng thuốc trừ sâu không
chỉ gây dư lượng vượt so với tiêu chuẩn dẫn đến việc gây
ô nhiễm và phá hủy môi trường, ảnh hưởng nghiêm trọng
đến sự tồn tại và sức khỏe của thực vật, động vật và con
người
- Phân tích dư lượng thuốc trừ sâu là công nghệ phân tích
các thành phần vi lượng trong hỗn hợp phức tạp, nó là
tổng hòa của phương pháp phát hiện dấu vết. Các kỹ thuật
tiền xử lý mẫu chủ yếu bao gồm: Chiết suất lỏng – lỏng
(LLE), chiết pha rắn (SPI), phân tán pha rắn (MSPD),
Solid phase microextraction (SPME), sắc ký gel (GPC)
và QueChERS
1. Giới thiệu

35. BÀI BÁO
- Trong bài báo ba loại rau (cải bẹ trắng, đậu đũa, ớt) và ba
loại quả (đào, nho và dưa hấu) sản xuất tại Thượng Hải
được chọn làm vật liệu phát hiện đồng thời dư lượng 54
thuốc trừ sâu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu siêu hiệu
năng song song khối phổ (UPLC-MS/MS).
1. Giới thiệu

36. BÀI BÁO
* Vật liệu: ba loại rau (cải bẹ trắng, đậu đũa, ớt) và ba loại
quả (đào, nho và dưa hấu) sản xuất tại Thượng Hải
2. Vật liệu và phương pháp
* Hóa chất:

37. BÀI BÁO
2. Vật liệu và phương pháp
* Hóa chất:
Các mẫu tiêu chuẩn 54 loại thuốc trừ sâu được lấy từ Tiến
sĩ Ehrenstorfer, Đức. Mỗi mẫu tiêu chuẩn được pha thành
100ml/L dung dịch, và lưu trữ nhiệt độ -4oC

38. BÀI BÁO
2. Vật liệu và phương pháp
* Xử lý mẫu: CHIẾT
Lấy 10 g mỗi loại, nghiền nhỏ + 100mlPTEF cho vào ly tâm 1 phút
Cho thêm 20mlacetonitrile + 2-3g NaCl ly tâm trong 5 phút với
tốc độ 4000 vòng/phút
Giữ trong khoảng 1h để phân lớp giữa acetonitrile và nước

39. BÀI BÁO
2. Vật liệu và phương pháp
* Xử lý mẫu: TÁCH
-2ml mẫu rau cho vào ống ly tâm +100g C18+100g PSA+300mg
MgSO4 + 10 mg carb
- 2ml nho, đào rau cho vào ống ly tâm +100g C18+100g PSA + 10 mg
carb
-2 ml dưa hấu
Cho ly tâm trong 5 phút với tốc độ 4000 vòng/phút
Lọc qua màng lọc hữu cơ 0.22m

40. BÀI BÁO
2. Vật liệu và phương pháp
* Dụng cụ:
- Agilent 1290 UPLC-Agilent 6460
ultra high performance liquid
chromatography (HPLC) - triple 4
quadrupole tandem mass
spectrometry with ESI source
Cột sắc ký: Cột ZORBAX Eclipse Plus-C18 (3.0mm
x 150mm x3.5mm)

41. BÀI BÁO
2. Vật liệu và phương pháp
* Điều kiện sắc ký:
-Sắc ký cột ZORBAX Eclipse Plus-C18;
- Pha A: axit formic 0,1%+amoni acetic axit 5mmol/l
- Pha B: methanol
Gradient rửa giải:
-0-0,5 phút 95% pha A; 0,5-1,5 phút 95%-70% pha A
-1,5-3,5 phút 70-50% pha A; 3,5 – 6 phút 50 -30%
- 6-12 phút 30%-10%; 12 -15 phút 10-5%
-Tốc độ dòng 0,45ml/phút; khối lượng tiêm 1μl, nhiệt
độ cột 40oC

42. BÀI BÁO
2. Vật liệu và phương pháp
* Điều kiện Khối phổ:
- ESI được thiết lập đồng thời cả ESI+ và ESI-, điện áp
nhân electron là 200V;
- Áp lực phun sương là 310,3 Kpa (40PSI)
- Nhiệt độ và tốc độ dòng tương ứng là: 300oC và 7
l/phút

43. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Công thức cấu tạo của một số loại thuốc trừ sâu

44. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Công thức cấu tạo của một số loại thuốc trừ sâu
Chlorantraniloprole

45. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Tối ưu hóa các mẫu tiền xử lý
Tỷ lệ thu hồi mẫu trong các môi trường chiết khác nhau
(bảng 4)

46. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Tối ưu hóa các mẫu tiền xử lý
Tỷ lệ phục hồi mẫu trong các dung dịch lọc khác nhau
(Hình 1- 3)

47. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Tối ưu hóa các mẫu tiền xử lý
Tỷ lệ phục hồi mẫu trong các dung dịch lọc khác nhau
(Hình 1- 3)

48. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Tối ưu hóa các mẫu tiền xử lý
Tỷ lệ phục hồi mẫu trong các dung dịch lọc khác nhau
(Hình 1- 3)

49. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Tối ưu hóa điều kiện sắc ký
Mỗi loại dung môi khác nhau phù hợp cho từng loại thuốc trừ sâu khác nhau.Dùng
dung môi methanol-axit formic và amoniaxetat cho 22 loại thuốc trừ sâu như
carbofuran-3-hydroxy

50. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Tối ưu hóa điều kiện sắc kýAcetonitril-axit formic thích hợp cho 12 loại thuốc trừ sâu như pyraclostrobon;
acetonitril-axit focmic – amoniacetat thích hợp cho 11 loại như boscalid; methanol-
ammonium acetate cho 6 loại như avermectin; acetonitril-amoniacetate cho 3 loại
như diènoconanole

51. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Tối ưu hóa điều kiện MS
Các ion tiền thân được chọn (M+H)+ ,(M-H)-
, (M+Na)+
, điện áp nhận điện tử 200V, kỹ
thuật ghi phổ MRM

52. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Tối ưu hóa điều kiện MS

53. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Thời gian lưu của 54 loại thuốc trừ sâu

54. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Xây dựng được giới hạn phát hiện định tính và định
lượng

55. BÀI BÁO
3. Kết quả và thảo luận
* Độ lệch chuển tương đối

56. BÀI BÁO
3. Kết luận
Trong bài báo phương pháp QuEChERS-
UPLC-MS/MS được tối ưu hóa để nhanh
chóng phát hiện dư lượng 54 loại thuốc trừ
sâu trong các loại rau quả. Tỷ lệ thu hồi tiêu
chuẩn 73,2%-134,3%, Độ lệch chuẩn tương
đối RSD là 1,0%-13,8%, giới hạn phát hiện
LOD, LOQ.

57. BÀI BÁO
3. Kết luận
Thông qua việc xác định phương pháp tối ưu là đơn
giản, thuận tiện, nhanh chóng, nhạy cảm và đáng tin
cậy, nó có thể tăng tốc độ phát hiện và thông lượng
để cung cấp một phương pháp phân tích hiệu quả
cao và đáng tin cậy để xử lý rủi ro và xử lý tình
trạng dư lượng thuốc trừ sâu trong các loại trái cây
và rau quả.