2. CRISPR
■ CRISPR è l’acronimo per Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats. Sequenze ripetute di DNA che i batteri utilizzano come un vero e
proprio sistema immunitario per proteggersi da acidi nucleici provenienti da
altri organismi batterici o da virus.
■ Fu scoperto per la prima volta da Francisco Mojica (1993) studiando gli
archeobatteri, credeva fosse una caratteristica di questo tipo di batteri.
Fu smentito da ricerche eseguite da Ruud Jansen mentre lavorava su determinati
batteri (Streptococco Thermophylus)
■ Queste sequenze (spacer) erano complementari al materiale genetico contenuto in
alcuni virus che infettavano questi batteri, e che la presenza di queste sequenze
aumentava la resistenza dei batteri contro i virus stessi
3. COME FUNZIONA
Una volta che avviene l’infezione, il batterio prende una piccola parte del materiale
genetico per conservarlo in maniera tale da creare degli RNA complementari che
avranno la funzione di riconoscere altre nuove eventuali infezioni. Nel momento di
una nuova infezione, gli RNA derivanti dalle sequenze Crispr
(spacer), riconoscono e si legano al materiale virale
(appaiamento). Viene allora prodotto l’enzima CAS-9
che attacca e spezza il materiale virale facendo
in modo che non possa andare a
danneggiare il DNA della cellula in questione
4. CAS-9
Il Cas-9 (CRISPR Associated) è
una endonucleasi, che viene
utilizzato dal complesso CRISPR-
CAS9 appunto per lavorare sui geni.
L’enzima Cas-9 è formato da due
lobi, uno superiore (REC lobe= lobo
di riconoscimento) che serve a
riconoscere la parte da tagliare, e
uno inferiore (NUC lobe= lobo
nucleatico) dove avviene la funzione
nucleatica vera e propria ovvero
dove avviene il taglio e la
sostituzione della parte desiderata.
5. COME
TAGLIA
1. Il DNA viene tagliato nella parte in cui
è complementare all’RNA guida
2. Il taglio avviene 3 coppie di nucleotidi
prima dell’inizio della sequenza PAM
(Sequenza di 2/6 coppie di nucleotidi
prima della sequenza da sostituire)
(sequenza adiacente al Protospacer)
3. L’HDR (Homology Directed Repair)
lega la nuova sequenza al posto del
segmento di DNA tagliato ed
eliminato.
6. CHARPENTIER E DOUDNA
Il Premio Nobel per la chimica 2020 è stato assegnato a Jennifer Doudna e a
Emmanuelle Charpentier "per lo sviluppo di un metodo per il genome editing".
Hanno scoperto che si poteva isolare la proteina Cas9, fornirgli un DNA bersaglio,
un piccolo RNA guida, disegnato con sequenza complementare al DNA bersaglio
che guidasse Cas9 sul sito specifico, come avrebbe fatto per il DNA del
batteriofago. E lo avrebbe tagliato esattamente come avrebbe fatto nel batterio
Una volta trovato il sito specifico, grazie al gRNA, e inciso il DNA dalla
endonucleasi Cas, i sistemi di riparazione della cellula, grazie alla struttura e alle
informazioni presenti sull'RNA guida, avrebbero fatto il resto modificando il sito a
nostro piacimento, per esempio inserendo una mutazione, o una piccola
sequenza, o tagliando via un pezzo.
7. PROBLEMI CAS-9
■ Alcuni scienziati hanno dichiarato che questo sistema di editing genetico possa facilitare
l’insorgenza del cancro. Quando le forbici genetiche di CRISPR tagliano la sequenza
genetica identificata, si attiva un sistema di riparazione cellulare, come se avessimo appena
aperto la cassetta del pronto intervento. Questa cassetta contiene alcuni strumenti, tra cui il
gene p53, che una volta attivato può svolgere la sua funzione in due modi: può annullare la
modificazione genetica appena generata da CRISPR-Cas9 o innescare una serie di reazioni
che portano la cellula modificata alla distruzione. A prescindere da quale delle due strade il
gene p53 scelga, è ovvio che la sua soppressione è fondamentale per far funzionare
CRISPR Cas9. Qui le noti dolenti: questo gene è un importante soppressore tumorale, il suo
malfunzionamento espone le cellule al rischio di tumore.
■ Un altro dei problemi evidenziati nel corso di questi anni è sicuramente legato alle sue
dimensioni: il complesso è troppo grande (1300 enzimi) per muoversi tranquillamente
all’interno della cellula, questo potrebbe portare il complesso a modificare tratti indesiderati di
DNA, modificando quindi porzioni che non codificano per nessuna patologia.
■ Per risolvere il problema, secondo alcuni scienziati, basti semplicemente sostituire la Cas-9
con la nuova Cas-x.
8. CAS X
È più maneggevole della Cas9 in quanto è più piccola. (1300 amminoacidi vs <1000
amminoacidi).
Secondo uno studio pubblicato su Nature, CasX è, in effetti, un editor genetico potente
ed efficiente sia nei batteri che nelle cellule umane. Il suo design è simile a Cas9, ma è
abbastanza diverso da sembrare che si sia evoluto nei batteri in maniera indipendente
rispetto alle altre proteine Cas. CasX può tagliare DNA a doppio filamento come Cas9,
può legarsi al DNA per regolare i geni e può essere indirizzato a specifiche sequenze di
DNA come le altre proteine Cas. Inoltre, poiché proviene da batteri che non si trovano
negli esseri umani, il sistema immunitario umano dovrebbe accettarlo più facilmente di
Cas9, questo potrebbe risolvere forse in parte il problema del gene p53, che secondo
molto ricercatori innesca proprio una risposta immunitaria cosiddetta “self”.
9. ZFN ETALEN
■ Il complesso ZFN opera attraverso la endonucleasi Fokl, che taglia il DNA in maniera aspecifica.
Non è in grado di riconoscere i singoli nucleotidi ma le triplette (e quindi un amminoacido, 3
nucleotidi =1 amminoacido). Pertanto, non è molto precisa.
■ Ha come endonucleasi Fokl, la stessa di ZFN, solo che a differenza di quest’ultima è in grado di
riconoscere il singolo nucleotide, allo stesso modo della Cas9.
■ Sia ZFN che TALEN producono dei tagli sticky (irregolari) e non piatti facilitando la ricombinazione
omologa
