alpha amylase tái tổ hợp từ Eco.li

1. Sản xuất -amylase chịu nhiệt
tái tổ hợp từ E. coli

2. Giới thiệu
 -amylase là enzyme cắt nội phân tử, thuỷ
phân liên kết -1,4-glucoside.
 Enzyme này được sử dụng để thuỷ phân tinh
bột thành các oligosaccharide trong quá trình
chế biến tinh bột.
 -amylase chịu nhiệt được tổng hợp từ các vi
khuân chịu nhiệt như là từ Archaeobacteria,
Bacillus.
 Tuy nhiên các vi khuẩn này rất khó để nuôi
trong điều kiện binh thường.

3. Sản xuất -amylase chịu nhiệt
từ E. coli
 Tế bào E. coli BL21 là tế bào chủ thường
được sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp.
 Vector pYTB2 được dùng để chuyển gene -
amylase.
 Gene -amylase được phân lập từ
pyrococcus woesei.
 Quá trình chuyển gene được thực hiện bằng
phương pháp shock nhiệt.

4. Nhe I Xho I
-amylase gene
Amp R
T7 promoter
Intein-CBD
T7 terminator
Nhe I
Xho I
pTYB2 plasmid
Diested by Xho I and Nhe I
Ligated by DNA ligase
Transformed into
E. coli
pTYB2 -amyl
T7 promoter
Intein-CBD
T7 terminator
-amylase gene
Amp R
Transformed E. coli
Recombinant plasmid

5. Lên men
 Lên men mẻ
 Môi trường LB
 Sự biểu hiện được kích thích bởi isopropyl-β-
D-thiogalactopyranoside (IPTG)
Air

6. Tinh sạch và đóng gói
Dịch chiết sau lên men
E. coli
Li tâm
Dịch chiết ko tế bào
Phá vỡ tế bào
Li tâm
Inclusion bodies mảnh vỡ
Gia nhiệt, ly tâm
Enzyme thô Enzyme thô
Renatured
Chế phẩm enzyme
(65%)
Chế phẩm enzyme
(35%)
Sắc ký Sắc ký

7. Chiến lược nâng cao hiệu quả
 Tăng khả năng sản xuất enzyme hoà tan
bằng cách đồng biểu hiện với chaperones.
 Tiết enzyme vào môi trường
 Tối ưu hoá quá trình nên men
 Kiểm soát tốc độ biểu hiện để làm giảm sự
hình thành inclusion bodies (enzyme ko hoà
tan).

8. Kiểm soát chất lượng
 Chế phẩm enzyme dược sản xuất, tinh sạch
và đóng gói trong điều kiện vệ sinh.
 Quá trình sản xuất được thiết kế giảm nguy
cơ nhiễm.
 Kiểm soát nghiêm ngặt trong quá trình nuôi
cấy, tinh sạch và đóng gói.

9. Ưu điểm
 Lượng enzyme được sản xuất bởi E. coli
bằng hai lần được sản xuất bởi P. woesei.
 Khác với enzyme -amylase thông thường,
enzyme này không cần Ca2+  giảm giá
thành.
 Có thể hoạt động trong một dai pH rộng.

10. Tinh bột
Oligosaccharides
Maltose Glucose
Syro fructose
- Hồ hoá (100oC)
- -amylase
-amylase
Quá trình chế biến tinh bột
-amylase
Duong hoa
Dịch hoá
Fructose isomerase

11. Kế hoạch nghiên cứu cho tương
lai
 Đồng biểu hiện với chaperone để tăng khả
năng hoà tan.
 Tìm điều kiện để tiết enzyme ra ngoài môi
trường: dùng xung điện, thêm cơ chất khác.