Bài Tập Tiểu Luận Môn Các Nguyên Lý Phân Tích Công Cụ.docx

Dịch vụ viết thuê đề tài – KB Zalo/Tele 0917.193.864 – luanvantrust.com
Kham thảo miễn phí – Kết bạn Zalo/Tele mình 0917.193.864
BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
BÀI TẬP CUỐI KHÓA MÔN HỌC
CÁC NGUYÊN LÝ PHÂN TÍCH CÔNG CỤ
ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SẮC KÝ LỎNG HPLC ĐỂ XÁC
ĐỊNH HÀM LƯỢNG PARACETAMOL TRONG DƯỢC PHẨM
GVHD: TS. Nguyễn Học Thắng
SVTH: Nông Khắc Huy
LỚP: 04SDHKTHH1
MSSV: 1004202007
Thành phồ Hồ Chí Minh, Tháng 07 năm 2021

Dịch vụ viết thuê đề tài – KB Zalo/Tele 0917.193.864 – luanvantrust.com
Kham thảo miễn phí – Kết bạn Zalo/Tele mình 0917.193.864
BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
BÀI TẬP CUỐI KHÓA MÔN HỌC
CÁC NGUYÊN LÝ PHÂN TÍCH CÔNG CỤ
ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SẮC KÝ LỎNG HPLC ĐỂ XÁC
ĐỊNH HÀM LƯỢNG PARACETAMOL TRONG DƯỢC PHẨM
GVHD: TS. Nguyễn Học Thắng
SVTH: Nông Khắc Huy
LỚP: 04SDHKTHH1
MSSV: 1004202007

ĐẠI HỌC CÔNGNGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNGNGHỆ HÓA HỌC
GVHD: TS. NGUYỄN HỌC THẮNG 1
Contents
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN................................................................................................................3
1.1. Paracetamol [1]
.........................................................................................................................3
1.2. Ibuprofen [1]
.............................................................................. Error! Bookmark not defined.
1.3. Các loại dược phẩm chứa Paracetamol và Ibuprofen...............................................................3
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước...............................................................................3
1.5. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao......................................................5
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM.......................................................................................................... 23
2. Hóa chất và dụng cụ............................................................................................................ 23
2.1 Hóa chất.............................................................................................................................. 23
2.2 Chất chuẩn .......................................................................................................................... 23
2.3 Dung môi............................................................................................................................. 23
2.4 Hóa chất khác....................................................................................................................... 23
2.5 Dụng cụ - Thiết bị................................................................................................................ 24
2.6 Nội dung nghiêncứu............................................................................................................ 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................................... 35
3.1. Khảo sát điều kiện phân tíchsắc ký..................................................................................... 35
3.1.1. Chọn cột và thể tích vòng mẫu...................................................................................... 35
3.1.2. Đặt bước sóng cho detector........................................................................................... 35
3.2. Xây dựng phương pháp định lượng..................................................................................... 44
3.3. Ứng dụng quy trình phân tích mẫu thật.............................................................................. 50
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.......................................................................................... 55
4.1. Kết luận............................................................................................................................... 55
5. Đề xuất................................................................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................................. 57

PHỤ LỤC...................................................................................................................................... 62

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Paracetamol [1]
Paracetamol (còn gọi là Acetaminophen) là một trong những dược chất phổ biến
nhất ở nước ta có tác dụng giảm đau, hạ sốt nhanh… .
1.1.1. Cấu tạo
Công thức phân tử: C8H9NO2. Khối
lượng phân tử: 151,17 g/mol.
Danh pháp IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl)acetamide
1.1.2. Tính chất vật lývà hóa học
Tỷ trọng: 1,263 g/cm3.
Nhiệt độ nóng chảy: 1690C (3360F).
Độ hòa tan trong nước: 0,1 – 0,5 g/100 ml ở 200C.
Paracetamol là một chất không mùi, có vị hơi đắng, tinh thể dạng bột màu trắng. Nó
hòa tan trong các dung môi hữu cơ như methanol và ethanol nhưng ít tan trong nước và
ether. Dung dịch bão hòa có pH = 5,5 – 6,5.
1.1.3. Dược tính
Paracetamol là thuốc giảm đau, hạ sốt nhưng có tác dụng chống viêm như aspirin.
So với các loại thuốc khác, Paracetamol ít có tác dụng phụ theo liều điều trị và được phép
bán không cần kê đơn.
Điều trị nhanh chóng hiệu quả các cơn đau đầu, hạ sốt, các triệu chứng cảm cúm,
đau sau khi tiêm vaccin, đau răng và khi mọc răng nhưng không trị viêm.
1.2. Các loại dược phẩm chứa Paracetamol
Danh mục thuốc có chứa Paracetamol: Aceralgin, Alaxan, Andol S, Decolgen Forte,
Panadol 500, Hapacol Extra, Efferalgan 500, Tiffy, Tatanol plus… .
Các loại thuốc trên được bán rộng rãi trên cả nước, trong các đại lý thuốc tây, bệnh
viện và nhà thuốc tư nhân.
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.3.1. Phân tích Paracetamol
Nghiên cứu “Định lượng đồng thời Paracetamol và Cafein trong chế phẩm bằng
phương pháp đo quang” năm 2008 của tác giả Đặng Thanh Thủy đã xây dựng phép định
lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần Paracetamol và Cafeine bằng các phương pháp
quang phổ tử ngoại như đạo hàm và đạo hàm tỷ đối.
Đồng thời áp dụng các phương pháp này để định lượng Paracetamol và Cafeine trong
một số biệt dược thông dụng trên thị trường hiện nay [2].
Cũng trong năm 2008, tác giả Đặng Quỳnh Chi đã nghiên cứu đề tài: “Định lượng
đồng thời Paracetamol và Codein Phosphat bằng phương pháp điện di mao quản”.
Với nghiên cứu này, tác giả đã xây dựng phương pháp có thể định lượng đồng thời
Paracetamol và Codein phosphat.
Trong điều kiện điện di, thời gian di chuyển của Codein Phosphat là 2,5 phút và của
Paracetamol là 2,9 phút, khoảng nồng độ tuyến tính 0,06 – 0,40 mg/ml của Codein
Phosphat và 0,19 – 0,120 mg/ml của Paracetamol. Phương pháp này nhằm khảo sát về sự
phù hợp độ lặp lại và độ đúng.
Những chế phẩm có hàm lượng hai thành phần chênh lệch nhau quá 20 lần thì phân
tích mẫu thử phải tiến hành ở độ pha loãng khác nhau. Phương pháp đã được áp dụng để
định lượng hàm lượng các hoạt chất trong viên nén Para Codein của công ty dược phẩm
3/2 [3].
Năm 2009, tác giả Deodhar MN và cộng sự đã áp dụng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao dùng cột pha đảo (RP - HPLC) để phân tích định lượng Paracetamol và
Aceclofenac với điều kiện cột pha đảo C18 ( 250x4,6 mm, 10 µm), pha động là hỗn hợp
methanol : nước có tỷ lệ 70 : 30 về thể tích (v/v), tốc độ dòng là 1 ml/phút với đầu dò
(detector) đặt ở bước sóng 275 nm. Thời gian lưu của Aceclofenac và Paracetamol là 1,8
và 2,7 phút. Khoảng tuyến tính là 2 – 50 ppm cho Aceclofenac và 5 – 50 ppm cho
Paracetamol. Độ thu hồi cho Aceclofenac và Paracetamol là 100,6 % và 100,7%. Phương
pháp này được đánh giá có độ chính xác, độ chọn lọc cao và nhanh chóng định lượng đồng
thời Aceclofenac và Paracetamol [4].
1.3.2. Phân tích đồng thời Paracetamol và Ibuprofen.

Năm 2010, tác giả Phạm Thu Quế đã xây dựng phép định lượng đồng thời hỗn hợp
hai thành phần Paracetamol và Ibuprofen bằng các phương pháp quang phổ đạo hàm, lấy
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) làm phương pháp đối chiếu.
Ứng dụng các phương pháp này để định lượng Paracetamol và Ibuprofen trong một
số lô của các chế phẩm: Alaxan, Dibulaxan và Febro [9].
Sau đó, tác giả M.R. Khoshayand và cộng sự đã ứng dụng phương pháp quang phổ
định lượng ba thành phầnParacetamol, Ibuprofen và Caffein trong các loại thuốc, tiến hành
quét phổ hấp thụ trong khoảng 200 nm đến 400 nm trong dung môi là hỗn hợp methanol :
HCl 0,1 M (3 : 1) [10].
Năm 2005, bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), tác giả Thái Duy
Thìn và cộng sự đã nghiên cứu định lượng Paracetamol, Ibuprofen và nhiều dược chất khác
trong các mẫu chế phẩm dược nội và ngoại.
Với điều kiện: cột pha đảo C18 (5μm, 150mm x 4,6mm), pha động là hỗn hợp ACN
và dung dịch axit phosphoric 0,1% (60: 40 v/v), tốc độ dòng là 1,0 ml/phút với bước sóng
đầu dò (detector) đặt ở miền tử ngoại là 224 nm. Thời gian lưu của Ibuprofen và
Paracetamol là 2,04 và 8,22 phút.
Điều kiện này, tiến hành khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng,
giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) [11].
Tác giả Prasanna Reddy Battu và MS Reddy trong năm 2009 đã định lượng thành
công Paracetamol và Ibuprofen bằng phương pháp HPLC dùng cột pha đảo C18 (5 µm, 150
mm x 4,6 mm), pha động là hỗn hợp dung môi ACN và dung dịch đệm phosphat (pH
= 7,04) tỷ lệ 60: 40 v/v, tốc độ dòng là 0,8 ml/phút với đầu đò UV ở 260 nm. Thời gian lưu
của Ibuprofen, Paracetamol là 2,48 và 4,45 phút.
Nghiên cứu trên đã khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính, LOD, LOQ… và định lượng
Paracetamol, Ibuprofen trong các loại dược phẩm bán trên thị trường [12].
1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là sắc ký lỏng
cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).

Phương pháp này ra đời năm 1967 – 1968trên cơ sở phát triểnvà cải tiếntừ phương
pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa
cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích.
Hiện nay, đây là phương pháp được ứng dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm
nghiệm nhất là kiểm nghiệm thuốc. Và hiện tại, đây là công cụ đắt lực nhất trong phép
phân tích định tính và định lượng các loại dược phẩm đa thành phần.
1.4.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất
lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc
một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên
kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ.
Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại
theo kích cỡ (rây phân tử).
1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai
sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi
ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc
ký chiết. Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử.
Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một pha
động. Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C…
vào cột phân tích, kết quả là các chất A, B, C… sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua
cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác.

Hình 1.1 Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên
khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại. Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được
quy định bởi ba lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố
ảnh hưởng không lớn. Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của
pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì F1
và F2 là khác nhau. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác
nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột như hình 1.2.
Hình 1.2 Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B.
1.4.3. Phân loại sắc ký hấp phụ
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các
chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột. Sự tách
một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Trong loại này có hai kiểu
hấp phụ:
+ Sắc ký hấp phụ pha thường (NP): pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực.
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP): pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực.
Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi, thành công để tách các hỗn hợp các chất
có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình
như các vitamin, các thuốc hạ nhiệt, giảm đau …
Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP).

Trong dược điển Mỹ USP (United State Pharmacy) khi chúng ta tra cứu cột có giá
trị tương ứng như sau:
L1: RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m.
L7: RP 8 Kích thước hạt tương ứng từ 5 – 10 m.
L3: Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m.
Và còn một số loại cột khác như Diol –Si-(CH2)2-O-CH2-CH(OH)-CH2OH, cột
aminopropyl –Si-(CH2)3- NH2, cột cyanopropyl –Si(CH3)2-(CH2)3- CN…
1.4.4. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ
Chất A Chất B thời gian
t0 : thời gian lưu chết.
trA: thời gian lưu chất A. trB: thời gian lưu chất B.
t’rA: thời gian lưu thực chất A. t’rB: thời gian lưu thực chất B.
Hình 1.3 Sắc ký đồ của chất A và chất B.
1.4.4.1. Thời gian lưu thực t’R
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất
đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất
trB
trA
t’rA
t’rB
t
o

khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn. Vì vậy
thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
+ Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
+ Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động Trong
một phép phân tích nếu tR
’ nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tR
’ quá lớn thì
peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo
nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém.
Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố đã trình bày ở trên.
1.4.4.2. Hệ số dung lượng K’
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha
động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan
trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.
K’=
𝑡𝑅−𝑡0
𝑡0
(1.1)
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì peak bị doãng. Trong
thực tế K’ từ 1 - 5 là tối ưu.
1.4.4.3. Độ chọn lọc α
Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A và B có
K’A và K’B khácnhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc
α=
𝐾′𝐵
𝐾′𝐴
(với K’B > K’A) (1.2)
với càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng.

Hình 1.4 Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B

1.4.4.4. Số đĩa lý thuyết
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký
nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là
H. Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó
một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha
tĩnh và pha động.
Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
+ Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh
+ Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động
+ Hệ số khuếch tán của các chất trong cột.
Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với
một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định.
Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau:
N= 5,54 (Ve / w0,5)
Trong đó, tR là thời gian lưu của chất phân tích.
W0,5 là độ rộng tại ½ của peak.
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ.
1.4.4.5. Độ phân giải
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều
kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của hai peak cạnh nhau phải được tính theo công thức
sau:
R= 2*
(𝑡𝑅2−𝑡𝑅1)
(𝑊2−𝑊1)
(1.4)

Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách nhau là R =
1,0. Trong phép định lượng R = 1,5 là phù hợp.
+ Nếu R nhỏ thì các peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích peak sẽ không chính
xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo ba cách sau:
* Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động (thay đổi độ
phân cực nếu là RP - HPLC, thay đổi cường độ ion nếu là IE – HPLC …)
* Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có
kích thước nhỏ hơn.
* Làm tăng độ chọn lọc bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá trình
tách hoặc thay đổi thành phần pha động .
+ Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kém.
Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình gradient dung môi.
Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký nếu dùng chương trình dung môi thì một số pha động
có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian
lưu và diện tích của các peak ta phân tích.
Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình gradient dung môi mà chủ yếu là
chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầu trong quá trình
phân tích.
1.4.4.6. Hệ số không đối xứng
Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của peak trên sắc ký đồ
thu được. T được tính bằng tỷ số độ rộng của hai nửa peak tại điểm 1/10 chiều cao peak:
T=
𝑎
𝑏
(1.5)
a b

Hình 1.5 Cách tích hệ số không đối xứng của peak.
Peak dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan tâm đến
hệ số không đối xứng T.
* Khi T 2,5 thì phép định lượng được chấp nhận.
* Khi T > 2,5 thì điểm cuối của peak rất khó xác định, vì vậy phép định lượng
cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho peak cân đối hơn theo các cách sau:
+ Làm giảm thể tích chết tức là đoạn nối từ cột đếndetector.
+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên.
+ Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm thể
tích tiêm mẫu.
1.4.5. Hệ thống HPLC
Hình 1.6 Các thiết bị trong hệ thống HPLC
Trong đó:
1 - Bình chứa dung môi pha động.
2 - Bộ phận khử khí.
3 - Bơm cao áp.
4 - Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler).
5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt.
6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu).
7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và

điều khiển toàn bộ hệ thống.
8 – Thiết bị in dữ liệu.
1.4.5.1. Bình đựng dung môi
Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho phép
chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và
tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100%.
Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một
lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa là 3 hoặc 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha
trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định .
Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải gradient dung môi theo
thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn.
Lưu ý: Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có
ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích.
Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất
tinh khiết phân tích và phải lọc qua hệ thống lọc 0,2 – 0,45 µm nhằm mục đích tránh làm
hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các peak tạp trong quá trình phân tích.
1.4.5.2. Bộ phận khử khí
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha
động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một
số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra:
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu
của peak thay đổi.
- Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể
Pump sẽ không hút được dung môi (bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng
hoạt động.
Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai.
1.4.5.3. Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải
tạo được áp suất cao khoảng 3000 - 6000 PSI hoặc 250 - 500 atm (1atm = 0,98 bar) và bơm
phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 ml/phút. Hiện nay đã có nhiều loại
pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar.
Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar. Tốc độ
dòng 0,1- 9,999 ml/phút.
Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt. Hiện tại bơm có 2 pistone
để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục.
1.4.5.4. Bộ phận tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với dung
tích của loop là 5 – 100 l.
Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng syringe) và
tiêm mẫu tự động (auto sampler).
1.4.5.5. Cột sắc ký
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm,
đường kính trong 1- 10 mm, hạt chất nhồi cỡ = 5 - 10 m. Ngoài ra còn có một số
trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt …
Với chất nhồi cột cỡ = 1,8 - 5 m có thể dùng cột ngắn 3 - 10 cm và nhỏ (đường
kính trong 1 - 4,6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao. Chất nhồi cột tùy theo lọai cột
và kiểu sắc ký (trong các dược điển USP 23, 24 có tiêu chuẩn hóa các lọai cột).
Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường) hoặc là silicagel đã được Silan
hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại
hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion.
* Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn
nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong thiết bị điều nhiệt. Lưu ý: tuyệt đối không đánh siêu
âm vì sẽ làm hư cột.

1.4.5.6. Đầu dò
Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột
và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng.
Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích
hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.
A = k.C (1.6)
Trong đó: A là tín hiệu đo được
C Nồng độ chất phân tích
k là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn
Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang; cường độ phát xạ; cường độ điện thế; độ
dẫn điện; độ dẫn nhiệt; chiết suất …
Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai detector sau:
+ Detector quang phổ tử ngoại từ 200 đến 380 nm.
+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV/Vis): từ 190 đến 900 nm.
+ Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự
nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang. Đây là loại detector có độ chọn lọc
cao nhất.
+ Loại hiện đại hơn có detector Diod Array, ELSD (detector tán xạ bay hơi)
các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại
của các chất .
Ngoài ra còn có một số loại detector khác là:
+ Detector điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng….
+ Detector chiết suất vi sai: detector khúc xạ.
+ Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt.
1.4.5.7. Bộ phận ghi tín hiệu
Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang.

+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký
đồ, thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao….
+ Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu
tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, hệ số phân
giải... trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu
của người sử dụng như: nồng độ, RSD….
1.4.6. Phương pháp chọn điều kiện sắc ký
Muốn có một kết quả tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một
hỗn hợp mẫu, các điều kiện đó bao gồm:
Pha tĩnh: - Loại pha tĩnh.
- Kích thước cột.
Pha động: - Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ… nếu là chương
trình rửa giải isocratic.
-Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình dung
môi… nếu là chương trình rửa giải gradient.
1.4.6.1. Lựa chọn pha tĩnh
Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu
phân tích; ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thường, cột pha đảo hay các loại
cột khác nhau….
Thông thường ngành ta dùng 2 loại cột pha thường (NP) và cột pha đảo (RP). Ngoài
ra ta có thể dùng một số loại cột khác như cột cyanopropyl, cột aminopropyl, cột diol....
Cột pha thường (NP): silicagel trung tính
Pha tĩnh: loại cột này dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực.
Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm – OH phân cực ưa nước.
Pha động : dùng cho loại này là các dung môi không phân cực hay ít phân
cực như: methanol, benzen, acetonitril, chlorofom …
Cột pha đảo (RP): silicagel đã alkyl hóa

Pha tĩnh: loại cột này dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các
chất phân cực có thể tạo cặp ion. Trên bề mặt hoạt động các nhóm – OH đã bị alkyl hóa
tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch carbon thẳng (C8 hay C18 tương đương RP-8
hay RP-18) hay các mạch carbon vòng (phenyl- tương đương cột phenyl). Vì thế nó ít phân
cực hay phân cực rất ít.
Pha động : Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực như:
methanol, acetonitril, nước hay các loại dung dịch đệm, hỗn hợp của các dung môi - đệm.
Sự tách của chất nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó được ứng dụng chủ yếu
trong phân tích dược phẩm. Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu.
Hiện nay pha tĩnh trên nền silicagel đã có hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vào
nhóm thế của nguyên tử H, ngoài ra còn có các lọai pha tĩnh trên nền oxid nhôm, trên nền
chất hữu cơ cao phân tử, trên nền mạch carbon ….
1.4.6.2. Lựa chọn pha động
Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu
phân tích; ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất
có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời phải có thời
gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi, hóa chất, thời gian phân tích mẫu,
giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị.
Pha động có thể làm thay đổi:
+ Độ chọn lọc α.
+ Thời gian lưu.
+ Hiệu năng tách của cột.
+ Độ phân giải.
+ Tính đối xứng của peak.
Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù
hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích. Chính
vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau:

+ Pha động phải trơ với pha tĩnh. Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi
hóa học ( ví dụ giá trị pH: 2,5 < pH < 8,5).
+ Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng
đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không
làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột. Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay
bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên cột.
+ Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất
là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu.
+ Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích
+ Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
+ Phải phù hợp với loại detector: detector UV/Vis thì dung môi không được
hấp thụ quang (ví dụ: acid acetic hấp thụ ở bước sóng thấp < 220 nm). Detector huỳnh
quang thì dung môi không được phát quang.
+ Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt. Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP
- HPLC), pha động là dung môi phân cực: nước, ACN, MeOH, acid hay base hữu cơ và
một vài amin hay aminoacid …
+ Ngoài các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều
trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm để ổn định pH. Chất tạo phức, tạo
cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất.
+ Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải E của dung môi theo
bảng sau:
Bảng 1.1 Lực rửa giải của một số dung môi

Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây
dựng chương trình sắc ký. Chỉ khi lựa chọn điều kiên sắc ký tốt, phù hợp thì chúng tamới
có thể định tính, định lượng được các lọai thuốc đa thành phần một cách nhanh chóng và
hiệu quả cao.
Tất nhiên phần lý thuyết nói rất nhiều về các phương pháp chọn điều kiện sắc ký,
tuy nhiên để chọn được chương trình sắc ký tốt đòi hỏi phải có thời gian, tài liệu và một
phần kinh nghiệm của những người làm sắc ký.
1.4.7. Các bước tiến hành sắc ký
1.4.7.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc
Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt, cho
kết quả phân tíchcó độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc đô dòng, năng lượng
đèn UV… đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra.
Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có
nghi ngờ về khả năng tách và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy sắc ký:
Ví dụ: sắc ký pha thường NP-HPLC: rửa bằng methanol; không rửa bằng nước.
Còn sắc ký pha đảo RP-HPLC: khi chạy pha động có các loại muối thì phải
rửa nước trước cho sạch.
Tỷ lệ ACN hay methanol : Nước là 50 : 50 v/v cho sạch hết các chất còn đọng lại
trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu.
Dung môi Lực rửa giải E
n-Hexan 0,1
Tetra chloro carbon 1,6
Toluen 2,4
Methanol 5,11
Acetonitril 5,8
Nước cất H2O 10,20

Tuyệt đối tránh tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đóđể cột một thời gian không
sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng được. Lưu ý: nếu rửa cột không tốt
thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các yêu cầu phân tích.
1.4.7.2. Chuẩn bị dung môi pha động
Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết dành cho HPLC. Các hóa chất dùng
phải là loại tinh khiết phân tích. Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để
ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu. Lọc dung môi qua màng lọc
0,2 – 0,45 μm.
1.4.7.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC
Mẫu thử: xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, quy trình theo nguyên tắc:
- Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường
hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu.
- Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được
bằng cách lọc hay chiết ….
- Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm.
- Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Có
thể gây ra nghẽn cột.
Mẫu chuẩn:
Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi,
riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng
độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.
1.4.7.4. Cách vận hành thiết bị
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm điều
khiển hệ thống sắc ký HPLC. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau:
- Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống
ống dẫn trước khi cho vào cột.
- Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như :

* Cấu hình máy
* Tỷ lệ các dung môi pha động
* Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích
yêu cầu.

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2. Hóa chất và dụng cụ
2.1 Hóa chất
2.2 Chất chuẩn
Bảng 2.1 Danh mục chất chuẩn do viện kiểm nghiệm thuốc cung cấp.
STT Tên chất chuẩn Số lộ hiện hành Số lô thay thế Hàm lượng nguyên trạng (%)
1 Paracetamol QT009 121911 QT009 130312 99,87%
2 Ibuprofen QT026 070611 QT026 080612 99,70%
2.3 Dung môi
Bảng 2.2 Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC.
STT Tên dung môi Nhà sản xuất Tiêu chuẩn Hàm lượng nguyên trạng (%)
1 Acetonitril
Merk KGaA
Đức
Dùng cho
HPLC
99,80 %
2 Methanol
Merk KGaA
Đức
Dùng cho
HPLC
99,80 %
3 Water
Merk KGaA
Đức
Dùng cho
HPLC
99,80 %
2.4 Hóa chất khác
Bảng 2.3 Danh mục các loại hóa chất khác dùng trong đề tài nghiên cứu.
STT Tên hóa chất Nhà sản xuất Tiêu chuẩn Hàm lượng nguyên trạng (%)
1 Chlorofom
Merk KGaA
Đức
Dùng cho
HPLC
99,80 %
2
Acid
Phosphoric
Merk KGaA
Đức
Dùng cho
HPLC
85,00 %

3 NaOH
Merk KGaA
Đức
Dùng cho
HPLC
99,80 %
4 Aceton Trung Quốc Thông thường
2.5 Dụng cụ - Thiết bị
2.5.1.1 Thiết bị
Bảng 2.4 Danh mục thiết bị - máy móc phục vụ đề tài nghiên cứu.
STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã số
1
Bình dựng dung
môi 4 kênh
Pyrex 1000 ml Germany 00330341
2 Bơm cao áp Pump Perkin Elmer Series 200
3
Bộ loại khí cho
dung môi
Vacuum Degasser Perkin Elmer Series 200
4
Thiết
mẫu
bị tiêm Syringe 100 μl Hamilton 80665
5 Thiết bị nạp mẫu Injector 20 μl USA
6 Cột sắc ký
Brownlee
RP - 18
Columns
Perkin Elmer
Brownlee Columns
07110017
7
Thiết bị ghi tín
hiệu
UV/Vis Detector Perkin Elmer Series 200
8
Thiết bị nhận tín
hiệu và phần
mềm điều khiển
hệ thống
Bộ PC cài đặt phần
mềm Total Chrom
Workstation ver 6.1.3
Intel
Phần mềm do Perkin
Elmer cung cấp
9
Bộ lọc dung môi
dùng giấy lọc
0,45
Glassico India

10
Máy
không
rút Chân
Neuburger KNF-Germany N035AN.18
11 Giấy lọc 0,45
Membrane
Sterile
Filter Whatman, Japan 7141104
12 Máy lắc KS130 Basic IKA - Germany KS130B
13
Máy
âm
đánh Siêu
S100H Elmasonic Elma - Germany 101141013
14 Cân phân tích
Balances and Precious
Metal scales
Sartorius 98648-012-13
15 Máy đo quang
Lambda 25 UV/Vis
Spectrometor
Perkin Elmer 101N7062504
16
Máy lọc nước
siêu sạch
Water Pro PS LABCONCO 091118524
2.5.1.2 Dụng cụ
- Bình định mức 1000 ml, 100ml, 50ml, 25ml, 10ml.
- Pipet: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml.
- Bình tam giác 250ml, cốc thủy tinh 100 ml
- Ống nhỏ giọt, bình tia, phễu lọc, cối sứ, chày sứ, giấy lọc.
2.6 Nội dung nghiên cứu
2.6.1 Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký HPLC
2.6.1.1 Chọn thể tích vòng mẫu
Độ chính xác, độ đúng, lượng mẫu cần thiết nạp vào cột sắc ký không những phụ
thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu.
Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi được thể
tích bơm mẫu vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng làm chân peak sắc ký doãng ra. Nếu

vòng mẫu quá dài, lượng mẫu quá lớn thì hiện tượng doãng peak xảy ra càng lớn gây ra sự
chen lấn peak trong quá trình tách.
Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta lựa chọn. Với thể tích
mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích
của peak sẽ tăng tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu = V0 mà vẫn tiếp tục tăng thể tích mẫu thì
chiều cao peak sắc ký sẽ không tăng nữa và lúc đó peak sắc ký sẽ tù, doãng chân và không
sắc nét. Vì vậy việc lựa chọn thể tích cũng rất quan trọng.
Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu có thể tích càng nhỏ càng tốt
để tạo nên peak có độ sắc nét cao và tránh doãng peak.
Trong phân tích HPLC người ta thường sử dụng các vòng mẫu 10, 20, 30, 40, 50,
100 μl trong đó vòng mẫu 20 μl thường hay được sử dụng nhất.
Trong đề tài này, để định lượng Paracetamol và Ibuprofen chúng tôi chọn thể tích
vòng mẫu là 20 μl phù hợp với thiết bị nạp mẫu (injector) 20 μl được trang bị trong phòng
thí nghiệm.
2.6.1.2 Chọn cột
Trong đề tài nghiên cứu này, Paracetamol và Ibuprofen là những chất rất ít phân cực
và dựa vào dược điển Mỹ USP 23, 24 quy định về chỉ tiêu phân tích định lượng các thành
phần trong dược phẩm, nên ta phải chọn các loại cột RP – HPLC. Trên thị trường có rất
nhiều hãng sản xuất cột sắc ký pha đảo C8 và C18 ….
Tuy nhiên cột Brownlee RP – 18 của hãng Perkin Elmer được sử dụng rộng rãi trong
ngành kiểm nghiệm dược phẩm nhờ danh tiếng thương hiệu, chất lượng cột cũng như tính
kinh tế so với các loại cột khác.
Hiện nay, phòng thí nghiệm của ta có trang bị loại cột này và được kỹ thuật viên
thường xuyên kiểm tra, đánh giá tình trạng. Vì vậy, ta chọn cột Brownlee RP – 18, kích
thước hạt 5 μm, 220x4,6 mm cho phép định lượng này.
2.6.1.3 Chọn bước sóng cho detector

Trong phép phân tích đồng thời, việc lựa chọn bước sóng rất quan trọng vì nó quyết
định tới độ nhạy của phép phân tích. Do phương pháp phân tích là HPLC sử dụng đầu dò
là detector UV-Vis cố định bước sóng, ta cần khảo sát điều kiện nhằm chọn bước sóng tối
ưu để phân tích đồng thời các chất.
Dựa vào tài liệu tham khảo và cực đại hấp thụ của PA và IB, ta chọn các bước sóng
tiêu biểu. Sau đó tiến hành khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC lần lượt tại các bước
sóng λ bằng 220 nm, 224 nm, 250 nm, 260 nm.
2.6.1.4 Khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC
Dựa vào kết quả thực nghiệm ở mục 2.2.1.3 ta tiến hành tiêm mẫu là hỗn hợp PA và
IB nồng độ 48 ppm vào hệ thống HPLC với điều kiện như sau:
Cột tách: RP – 18, 5 μm, 220x4,6 mm.
Pha động: C: Acetonitril (CH3CN); D: dung dịch H3PO4 0,01M.
Thời gian: 0 – 5 phút, 95%C : 5%D.
Nồng độ mẫu: 4,8 ppm.
Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
Detector: UV- Vis. Đặt tại các bước sóng ở mục 2.2.1.3.
Thể tích vòng mẫu: 20 μl.
2.6.1.5 Khảo sát nồng độ acid phosphoric
Nồng độ acid H3PO4 ảnh hưởng trực tiếp tới pH của hệ có thể ảnh hưởng lớn tới độ
phân cực của dung môi nên ảnh hưởng tới khả năng tách của hệ và độ đối xứng của
peak sắc ký. Để khảo sát sự ảnh hưởng của chúng, ta tiến hành chạy sắc ký với điều kiện
sau:
Cột tách: RP – 18, 5 μm, 220x4,6 mm.
Pha động: C: Acetonitril (CH3CN);
D: dung dịch H3PO4 0,001M; pH = 3,10.
E: dung dịch H3PO4 0,005M; pH = 2,47.
F: dung dịch H3PO4 0,01M; pH = 2,25.

G: dung dịch H3PO4 0,05M; pH = 1,81.
Thời gian: 0 – 5 phút, 95% C : 5% (D, E, F, G).
Nồng độ chất phân tích: 4,8 ppm.
Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 224 nm.
2.6.1.6 Khảo sát thành phần pha động và Ki
’
Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa giải
các chất mẫu ra khỏi cột. Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc trưng cho
quá trình sắc ký. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môipha
động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích qua đó làm thay
đổi hệ số lưu của chất phân tích đó. Vì vậy để có được tỷ lệ thành phần pha động phù hợp
cần tiến hành khảo sát hệ sắc ký với tỷ lệ thành phần pha động khác nhau với các điều kiện
sắc ký như nhau:
Cột tách: RP – 18, 5 μm, 220x4,6 mm.
Pha động: C: Acetonitril (CH3CN); D: dung dịch H3PO4 0,010 M.
Thời gian: 0 – 5 phút,60%
Nồng độ chất phân tích: 48 ppm.
Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 224 nm. Thể
tích vòng mẫu: 20 μl
2.6.1.7 Khảo sát tốc độ dòng
Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng đến
quá trình thiết lặp cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng quá nhỏ
sẽ gây ra hiện tượng doãng peak, thời gian rửa giải lâu hơn.
Tuy nhiên nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không
tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau. Vì vậy cần
phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích.

Cột tách: RP – 18, 5 μm, 220x4,6 mm.
Pha động: C: Acetonitril (CH3CN); D: dung dịch H3PO4 0,01M.
Thời gian: 0 – 5 phút, 97%C : 3%D.
Nồng độ chất phân tích: 48 ppm.
Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút; 0,7 ml/phút; 0,8 ml/phút; 0,9 ml/phút; 1 ml/phút.
Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng = 224 nm.
2.6.2 Xây dựng phương pháp định lượng hỗn hợp Paracetamol
2.6.2.1 Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định
lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng.
Giới hạn phát hiện là giá trị nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân
tích còn cho tín hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của đường
nền.
Giới hạn định lượng được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống
phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có nghĩa định lượng so với tín hiệu mẫu
trắng hay tín hiệu nền. Thông thường LOQ được tính như sau:
Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: pha loãng từ 5 – 7 lần
mẫu chuẩn chứa hỗn hợp PA và IB nồng độ 9,6 ppm và chuẩn bị một mẫu trắng (chứa dung
môi pha động). Sau đó tiêm vào thiết bị HPLC và ghi kết quả. Sắc ký đồ nào thể hiện chiều
cao peak khoảng gấp 3 lần đường nền thì nồng độ của mẫu chuẩn đó chính là giới hạn phát
hiện LOD của thiết bị.
Giới hạn định lượng được suy ra từ công thức: LOQ = 10/3 LOD (2.1)
2.6.2.2 Xác định khoảng nồng độ tuyến tính
Khoảng nồng độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích. Một
chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ
của chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính.

Để khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ của Paracetamol và diện tích peak sắc
ký, ta lần lượt pha các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 4,8 ppm đến 480 ppm trong dung
môi pha động.
Sau đó tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 1.2.2,
ghi giá trị và dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 xây dựng đường hồi quy.
Các thông tin về đường chuẩn được trình bày trong phần phụ lục.
2.6.2.3 Khảo sát độ lặp lại của phép đo
Một phương pháp phân tích tốt ngoài yêu cầu về độ đúng của phương pháp, người
ta còn chú ý đến độ lặp lại của phương pháp.
Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp 6 lần cùng một mẫu
chuẩn hỗn hợp Paracetamol và Ibuprofen (có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính) vào
hệ thống sắc ký với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 1.2.2. Kết quả được đánh giá
thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký
Speak và thời gian lưu tR.
2.6.3 Ứng dụng quy trình phân tíchcác mẫu dược phẩm
2.6.3.1 Khảo sát quy trình chiết chất:
Cân 10 viên mẫu thuốc, ghi lại kết quả cân.
Nghiền mịn mẫu bằng chén sứ sau đó cân chính xác 0,2504 gam mẫu.
Cho 0,2504 g mẫu vào bình bình tam giác có chứa 30 ml dung dịch pha động. Lắc
trong 15 phút. Sau đó lọc tách phần cặn không tan và phần dung dịch.
Tương tự lặp lại các bước như sơ đồ sau:

Hình 2. 1 Quy trình khảo sát phương pháp chiết mẫu
Cứ thực hiện cho đến khi chất đã chiết hoàn toàn. Thu lấy các dịch lọc có chứa chất
và dịch lọc không chứa chất (làm mẫu trắng).
2.6.3.2 Xác định hệ số thu hồi của phương pháp
Nhằm đánh giá và kiểm tra độ đúng của phương pháp, ta tiến hành xác định hệ số
thu hồi bằng cách sau:
Tiêm lặp 3 lần dung dịch chứa đồng thời PA và IB nồng độ C01, C02 xác định (C01
và C02 phải nằm trong khoảng tuyến tính). Ghi số liệu, dựa vào đường chuẩn của PA và IB
tính nồng độ C1, C2 của PA và IB. Sau đó suy ra hệ số thu hồi theo công thức sau:

2.6.3.3 Phân tíchđịnh lượng một số mẫu dược phẩm
Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại dược phẩm có chứa PA, IB và đồng thời
PA, IB trong cùng một chế phẩm. Dựa vào phương pháp này ta có thể định lượng PA, IB
hay đồng thời PA và IB trong cùng một chế phẩm. Tuy nhiên, ta không thể tránh khỏi sự
ảnh hưởng của các chất khác trong các loại dược phẩm đa thành phần. Vì vậy, ta nên chọn
các loại dược phẩm chỉ chứa một thành phần PA hoặc IB hay đồng thời hai thành phần PA
và IB. Ngoài ra, ta cũng có thể định lượng PA và IB trong một số dược phẩm đa thành phần
mà dược điển cho phép hoặc có các tài liệu chứng minh chất lạ không ảnh hưởng đến phép
phân tích.
Bảng 2.5 Thông tin về các mẫu thuốc được thu thập
Tên mẫu Tên thuốc
Thành phần chính
trong một viên thuốc
Nhà sản xuất – số lô HSD
M01 Alaxan
Paracetamol 325 mg
Ibuprofen 200 mg
United Pharma Việt
Nam - 118691
23/05/2014
M11 Alaxan
Paracetamol 325 mg
Ibuprofen 200 mg
United Pharma Việt
Nam - 118901
24/10/2014
Tiến hành xử lý mẫu thuốc theo quy trình thực nghiệm suy ra từ mục 2.2.3.1. Thu
lấy toàn bộ dịch chiết, lọc qua màng lọc 0,45 µm, sau đó cho toàn bộ dịch lọc vào bình
định mức 250 ml. Định mức đến vạch bằng dung môi pha động và pha loãng như sau:
Bảng 2.6 Cách pha loãng mẫu trước khi tiêm vào thiết bị HPLC.

Stt Mẫu thuốc Alaxan Cách pha loãng
1 M01
Rút 2,5 ml mẫu cho vào bình 25 ml, định mức đến vạch bằng
dung môi pha động.
2 M11
Rút 7,5 ml mẫu cho vào bình 25 ml, định mức đến vạch bằng
Tiến hành tiêm lặp 3 lần các mẫu M01, M11 vào hệ thống HPLC và ghi kết quả.
Dựa vào phương trình hồi quy tính nồng độ của chất phân tích và hệ số thu hồi.
2.6.4 Phương pháp xử lý và đánh giákết quả
Theo lý thuyết sắc ký lỏng, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời
gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều cao
và diện tích peak sắc ký có liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất. Trong một vùng nồng
độ nhất định và không lớn, thì chúng ta có mối quan hệ tuyến tính như sau:
Hi = k1 .Ci = f(C) (2.3)
Si = k2 .Ci = f(C) (2.4)
trong đó:
Hi và Si là chiều cao và diện tích của peak sắc ký của cấu tử i. Ci
là nồng độ của cấu tử i với thời gian lưu tRi.
k1, k2 là các hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký cũng như
bản chất pha tĩnh.
Dựa trên (2.3) và (2.4) ta có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo phương
pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn.
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê toán học với các
đặc trưng sau:
Giá trị trung bình: 𝑥̅ =
1
𝑛
∑ 𝑥𝑖
𝑛
𝑖=1
(2.5)

Độ lệch chuẩn:
Độ lệch chuẩn tương đối:
(2.6)
(2.7)

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát điều kiện phân tíchsắc ký
Sau khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát theo mục 2.2.1, ta thu được kết quả như sau:
3.1.1. Chọn cột và thể tích vòng mẫu
Dựa vào các tài liệu tham khảo trong mục 1.4.3 và trang thiết bị của phòng thí
nghiệm cho phép ta chọn cột và thể tích vòng mẫu như sau:
Cột sắc ký pha đảo RP – 18, kích thước 220x4,4 mm, kích thước hạt 5 µm.
Thể tích vòng mẫu: injector 20 µl.
3.1.2. Đặt bước sóng cho detector
Bước sóng λ của detector là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến độ nhạy của
phương pháp. Vì thế ta phải nghiên cứu, khảo sát sao cho tín hiệu của chất phân tích tại
bước sóng λ là tốt nhất.
Hình 3.1 Phổ hấp thụ của PA và IB trong dung môi NaOH 0,1M [13].

Hình 3.2 Phổ hấp thụ của PA, IB và CA trong dung môi MeOH : HCl 0,1M (3:1 v/v) [11].
Nhận xét: PA hấp thu cực đại trong khoảng bước sóng 250 – 260 nm. IB hấp thụ
cực đại trong khoảng 220 – 230 nm.
Tiến hành khảo sát bước sóng trên detector đặt tại các bước sóng 220 nm, 224 nm,
250 nm, 260 nm. Tiêm hỗn hợp chứa PA và IB nồng độ 48 ppm trong dung môi phađộng
vào hệ thống HPLC với điều kiện như mục 2.2.1.4.
Bảng 3.1 Sự phụ thuộc của chiều cao peak sắc ký vào bước sóng của detector
Bước sóng detector
Chiều cao peak
PA IB
220 325 265
224 1510 1230
250 220 217
260 112 102
mV mV

mV
(c) (d)
Hình 3.3 Sắc ký đồ thể hiện chiều cao peak sắc ký tại các bước sóng
(a) 220 nm, (b) 224 nm, (c) 250 nm, (d) 270 nm.
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
215 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265
Hình 3.4 Sự phụ thuộc của chiều cao peak sắc ký vào bước sóng của detector.
Như vậy, từ các kết quả trên ta nhận thấy: tốc độ và thành phần pha động có thể làm
chuyển dịch cực đại hấp thụ của PA và IB. Để tách được đồng thời PA và IB, ta chọn bước
sóng 224 nm cho các nghiên cứu tiếp theo.
mV
PA
IB

3.1.3. Khảo sát nồng độ acid phosphoric
Trong nghiên cứu này, ta chọn acid phosphoric vì PA và IB theo lý thuyết đều có
tính acid yếu. Nếu chọn môi trường trung tính hoặc base thì PA và IB có thể tồn tại ở dạng
muối và kết tinh trên cột khi gặp MeOH hay ACN.
Tuy nhiên ta cũng cần phải kiểm soát nồng độ của acid H3PO4. Nếu pH quá thấp,
vượt quá giới hạn của cột tách sẽ làm biến đổi pha tĩnh.
Tiến hành khảo sát nồng độ acid H3PO4 theo mục 2.2.1.5. Kết quả được thể hiện
trong bảng 3.2 và hình 3.5 như sau:
Bảng 3.2 Sự phụ thuộc hệ số lưu Ki’ vào nồng độ acid H3PO4:
3.2
3.1
3
2.9
2.8
2.7
2.6
2.5
2.4
2.3
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Hình 3.5 Sự phụ thuộc thời gian lưu vào nồng độ acid H3PO4.
PA
IB

Hình 3.6 Sắc ký đồ của hỗn hộp PA và IB (4,8 ppm) với nồng độ acid H3PO4 0,001M.
Dựa vào kết quả phân tích được, ta chọn nồng độ acid H3PO4 là 0,01 M cho các
nghiên cứu tiếp theo vì tại nồng độ này, pH nằm trong giới hạn cho phép của cột, peak sắc
ký rõ nét, cân đối, ít tốn thời gian phân tích và dung môi pha động.
3.1.4. Khảo sát thành phần pha động
Thành phần pha động ảnh hưởng trực tiếp đến lực rửa giải các chất phân tích, ảnh
hưởng đến thời gian lưu và hệ số tách của hai chất. Theo dược điển Mỹ USP 23, 24 và các
tài liệu tham tham khảo ở mục 1.4 thì dung môi pha động thường là hỗn hợp ACN và một
acid yếu như: acid acetic, acid formic, acid phosphoric… Trong đề tài này, ta chọn acid
phosphoric vì nó là acid vô cơ, không hấp thụ ở bước sóng 224 nm.
mV
tIB =3,95
tPA = 3,23
t0 = 0,93
Thời gian(phút)

Thời gian(phút)
mV mV
Tiến hành khảo sát thành phần pha động như mục 2.2.1.6. Kết quả được thể hiện
trong hình 3.7 như sau:
mV mV
(3) (4)
Thời gian(phút)

Thời gian(phút)
mV mV
(7) (8)
mV
Hình 3.7. Sắc ký đồ của hỗn hợp PA và IB
với pha động là:
(1) ACN/ H3PO4 0.01M (60:40 v/v).
(2) ACN/ H3PO4 0.01M (70:30 v/v).
(3) ACN/ H3PO4 0.01M (80:20 v/v).
mV mV
Thời
gian(phút)
Thời

(4) ACN/ H3PO4 0.01M (90:10 v/v).
(5) ACN/ H3PO4 0.01M (95:5 v/v).
(6) ACN/ H3PO4 0.01M (96:4 v/v).
(7) ACN/ H3PO4 0.01M (97:3 v/v).
(8) ACN/ H3PO4 0.01M (98:2 v/v).
(9)(9) ACN/ H3PO4 0.01M (99:1 v/v).
Dựa vào hình 3.7, ta thấy rằng thành phần pha động ảnh hưởng lớn đến thời gian
lưu, hệ số lưu, hệ số tách và hệ số đối xứng của peak.
Tỷ lệ ACN càng lớn thì thời gian lưu càng ngắn, hệ số tách càng nhỏ, peak đẹp, cân
đối, hiện tượng kéo đuôi giảm dần. Tuy nhiên, khi tỷ lệ ACN lên đến 98 – 99 % thì hệ số
tách quá nhỏ, hai peak không tách rời nhau. Vì vậy ta chọn thành phần pha động làhỗn hợp
dung môi ACN và dung dịch H3PO4 0,01M (97:3 v/v) cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.1.5. Khảo sát tốc độ dòng
Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng đến
quá trình thiết lặp cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng quá nhỏ
sẽ gây ra hiện tượng doãng peak, thời gian rửa giải lâu hơn. Tuy nhiên nếu tốc độ dòng quá
lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra
hiện tượng chồng chéo peak lên nhau. Vì vậy cần phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù
hợp với hệ phân tích.
Tiến hành khảo sát theo mục 2.2.1.7. Kết quả khảo sát được thể hiện ở hình 3.8
Từ kết quả trong hình 3.8 ta thấy rằng, tốc độ dòng ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu,
hệ số tách. Tốc độ dòng từ 0,6 – 1,0 ml/phút cho thấy thời gian lưu giảm dần, peakrõ đẹp,
tách nhau hoàn toàn, hệ số tách giảm dần. Tốc độ dòng lớn sẽ làm hao tốn dung môi và
tăng áp suất cột tách, nhưng tốc độ quá nhỏ sẽ kéo dài thời gian phân tích và làm doãng
Thời gian(phút)

peak gây ra hiện tượng kéo đuôi. Do đó, ta chọn tốc độ dòng là 0,7 ml/phút để tiến hành
định lượng PA và IB.
Tóm lại, điều kiện tối ưu được đề xuất như sau:
Cột tách: RP – 18, 5 μm, 220x4,6 mm.
Pha động: Acetonitril (CH3CN) : dung dịch H3PO4 0,01M (97:3 v/v).
Thời gian: 0 – 4,5 phút.
Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút.
Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng = 224 nm.
mV mV
(1) (2)

(3) (4)
mV
Hình 3.8 Sắc ký đồ hỗn hợp PA và
IB với tốc độ dòng thay đổi
(1) tốc độ dòng = 1,0 ml/phút
(5) (5) tốc độ dòng = 0,6 ml/phút.
3.2. Xây dựng phương pháp định lượng
3.2.1. Xác định LOD và LOQ của thiết bị
Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định
lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng.
Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: chuẩn bị một mẫu trắng
làm nền, pha loãng liên tiếp 2 đến 5 lần mẫu chuẩn chứa hỗn hợp PA và IB. Sau đó tiêm
mV mV
Thời gian(phút) Thời gian(phút)
T gian(phút)

vào thiết bị HPLC. Đến khi nào chiều cao peak = 3 lần chiều cao đường nền thì lấy đó là
LOD.
Hình 3.9 Mẫu hỗn hợp PA và IB nồng độ 1,2 ppm (a) và mẫu trắng (b).
Kết quả: khi nồng độ PA và IB là 1,2 ppm thì chiều cao = 3 lần đường nền. Do đó:
LOD của PA là 1,2 ppm
LOD của IB là 1,2 ppm
Từ đó suy ra: LOQ của PA = 10/3 LOD = 4 ppm.
LOQ của IB = 10/3LOD = 4 ppm.
3.2.2. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
Khoảng nồng độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích. Một
chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ
của chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính.
Để khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ của Paracetamol, Ibuprofen và diện tích
peak sắc ký, ta lần lượt pha các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 4,8 ppm đến 360 ppm trong
(a) (b)

Bảng 3.3 Cách pha loãng dung dịch mẫu trước khi tiêm vào hệ thống HPLC
Thể tích (ml) hút từ dung
dịch chuẩn 1200 ppm
Hệ số pha loãng Nồng độ của dung dịch
sau khi pha loãng
0,1 0,1/25 4,8
0,2 0,2/25 9,6
0,5 0,5/25 28,8
1,0 1,0/25 57,6
2,0 2,0/25 115,2
5,0 5,0/25 240
7,5 7,5/25 360
Sau đó tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 1.2.2,
ghi giá trị và dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 xây dựng đường hồi quy.
Bảng 3.4 Diện tích peak ứng với từng nồng độ của PA trong dãy chuẩn.
Paracetamol
C (ppm) Speak
4,8 1624,11
9,6 111005,47
28,8 397690,90
57,6 914222,87
115,2 1945623,06
240 4042599,58
360 5975959,25

Bảng 3.5 Diện tích peak ứng với từng nồng độ của IB trong dãy chuẩn.
Ibuprofen
C (ppm)
Spea
k
4,8 224205,66
9,6 320008,04
28,8 841851,68
57,6 1528423,76
115,2 2894882,44
240 6028463,40
360 9161289,52
Hình 3.10 Đồ thị biểu sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của Paracetamol.

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của IB
Dựa vào kết quả khảo sát, ta có các phương trình hồi quy sau được biểu diễn trong hìnhm
3.10, 3.11 và bảng 3.6.
Bảng 3.6 Phương trình hồi quy của PA và IB
Chất phân tích Phương trình hồi quy
Hệ số tương quan
R2
Khoảng nồng độ
tuyến tính (ppm)
Paracetamol Y = 16879x – 54957 0,9997 4,8 – 360
Ibuprofen Y = 25061x + 78528 0,9998 4,8 - 360
Nhận xét: qua các kết quả phân tích và thống kê ta thấy, tỷ lệ diện tích peak sắc ký
và nồng độ các acid béo phụ thuộc tuyến tính với nhau một cách chặt chẽ với hệ số tương
quan cao, R = 0,9997. Khoảng nồng độ tuyến tính rộng đối với cả hai chất PA và IB từ 4,8
– 360 ppm. Do đó, ta có thể sử dụng các phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn để
định lượng PA và IB trong mẫu thật ở khoảng tuyến tính đã khảo sát.
3.2.3. Khảo sát độ lặp lại của phép đo
Một phương pháp phân tích tốt ngoài yêu cầu về độ đúng của phương pháp, người
ta còn chú ý đến độ lặp lại của phương pháp. Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát
bằng cách tiêm lặp 7 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp PA và IB vào hệ thống HPLC với

điều kiện tối ưu ở mục 1.2.2. Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch
chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký Speak và thời gian lưu tR.
Bảng 3.7 Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu PA
Thứ tự
Thời gian lưu của PA Diện tích peak của PA
Thời gian lưu Các thông số thống kê Diện tích Các thông số thống kê
1 2,25 Giá trị trung bình
Xtb = 2,27
SD = 0,011
RSD(%) = 0,47 %
274172,44 Giá trị trung bình
Xtb = 275718,71
SD = 2206,77
RSD(%) = 0,80 %
2 2,26 274378,18
3 2,27 278549,62
4 2,27 278947,38
5 2,27 275137,04
6 2,28 275626,77
7 2,28 273219,56
Bảng 3.8 Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu IB
Thứ tự
Thời gian lưu của IB Diện tích peak của IB
Thời gian lưu Các thông số thống kê Diện tích Các thông số thống kê
1 3,89 Giá trị trung bình
Xtb = 3,90
Sai số ngẫu nhiên:
SD = 0,011
RSD(%) = 0,29 %
575941,83 Giá trị trung bình
Xtb = 577933,34
Sai số ngẫu nghiên:
SD = 3263,80.
RSD(%) = 0,56 %
2 3,90 576812,77
3 3,89 580467,34
4 3,90 583875,91
5 3,91 577994,18
6 3,91 576278,13
7 3,92 574163,22
Theo kết quả khảo sát ta thấy hệ thống sắc ký lỏng có độ lặp lại tốt. Đối với phép
định lượng, thông số diện tích peak Speak là 0,80 % và 0,56 % ứng với PA và IB. Quy trình
phân tích ổn định và có thể áp dụng để phân tích mẫu thật.

3.3. Ứng dụng quy trình phân tích mẫu thật
3.3.1. Quy trình chiết mẫu
Mẫu thuốc Alaxan được thu thập từ các hiệu thuốc về, ghi lại các thông tín về bao
bì, ngày sản xuất, hạn sử dụng, số đăng kiểm và thành phần như trong bảng 2.5.
Sau khi thực hiện quy trình khảo sát phương pháp chiết mẫu, kết quả thu được thể
hiện trong bảng 3.9 và hình 3.12:
Bảng 3.9 Diện tích peak với số lần chiết tách PA và IB trong mẫu thật.
nhkh
Hình 3.12 Sự phụ thuộc của diện tích peak vào số lần chiết PA (a) và IB (b).
Số lần chiết i
Mẫu Alaxan
Speak PA Speak IB
2 2262527,5 339689,29
3 109617,87 24555,11
4 46703,42 14352,24
5 16639,31 11064,97
6 5589,70 4183,39
7 4845,69 1946,18
(a) (b)

Nhận xét, như vậy sau 7 lần lắc và chiết xem như ta đã tách hoàn toàn PA và IB ra
khỏi mẫu ban đầu là 250 mg thuốc Alaxan. Dựa vào đây, ta có thể áp dụng quy trình này
để chiết tách PA và IB cho phép định lượng.
3.3.2. Xác định hệ số thu hồi của phương pháp
Để xác định độ đúng của phương pháp, ta cần xác định hệ số thu hồi.
Tiêm lặp 3 lần dung dịch chứa đồng thời PA và IB nồng độ 120 ppm. Ghi số liệu,
dựa vào đường chuẩn của PA và IB trong bảng 3.7, tính nồng độ của PA và IB. Sau đó tính
hệ số thu hồi theo công thức 2.2.
Kết quả của phép đo được thể hiện trong bảng 3.10:
Bảng 3.10 Hệ số thu hồi của phương pháp trên mẫu chuẩn PA và IB
Mẫu PA IB
Nồng độ Cx (ppm) 115,23 113,38
Nồng độ C0 (ppm) 120 120
Hệ số thu hồi R% 96,03 % 94,48 %
3.3.3. Định lượng PA và IB trong một số mẫu dược phẩm
Với phương pháp định lượng PA và IB đã xây dựng, ta tiến hành phân tích 2 mẫu: Alaxan
có số lô và ngày sản xuất khác nhau.
Khối lượng 10 viên thuốc lấy từ mẫu M01: 7,2061 gam. Khối
lượng 10 viên thuốc lấy từ mẫu M11: 7,2045 gam.
Suy ra khối lượng trong 1 viên thuốc lấy từ mẫu M01: 720,61mg. khối lượng
trong 1 viên thuốc lấy từ mẫu M11: 720,45 mg.
Tiến thành cân lấy mẫu: Khối lượng mẫu M01 = 250,9 mg.
Khối lượng mẫu M11 = 251,1 mg
Quy trình xử lý mẫu và chiết chất thực hiện theo mục 2.2.3.1 và pha chế theo bảng
2.6. Dựa vào phương trình hồi quy từ bảng 3.6 để xác định hàm lượng PA và IB trong mẫu.
Kết quả phân tích được thể hiện trong bảng và hình sau:

Hình 3.13 Sắc ký đồ của mẫu M01.
Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu M11.

Bảng 3.11 Kết quả phân tích mẫu dược phẩm Alaxan M01 và M11.
Mẫu Speak PA Speak IB CPA (ppm) CIB (ppm)
M01
708161 673225 45,2
Ctb = 45,2 ±
0,30
23,73
Ctb = 23,9
± 0,4
709626 679240 45,3 23,97
705685 680242 45,0 24,01
M11
2266033 1906727 137,5
Ctb = 137,3 ±
3,4
72,95
Ctb = 72,9
± 0,5
2290019 1898207 138,9 72,61
2231189 1905224 135,4 72,89
Từ nồng độ PA và IB tìm được trong mẫu, ta quy đổi sang hàm lượng của chúng có trong
100 mg mẫu như sau:
mcpt = Cx.V.F
trong đó:
mcpt là khối lượng chất phân tích có trong 0,2509 gam mẫu (đối với mẫu M01) và 0,2511
gam mẫu (đối với mẫu M11).
Cx là nồng độ chất phân tích tính theo phương trình hồi quy. V: thể tích pha loãng.
F: hệ số pha loãng (10-3).
Suy ra: mcpt = Cx . 250.
25
2,5
. 10−3
= 2,5Cx đối với mẫu M01
mcpt = Cx . 250.
25
7,5
. 10−3
= 0,83Cx đối với mẫu M01
Như vậy, theo quy trình phân tích ở trên ta có hàm lượng PA và IB trong mẫu dược
phẩm Alaxan được tóm tắt như sau:

Bảng 3.12 Khối lượng PA và IB trong mẫu M01 và M11.
Mẫu Khối lương
cân (mg)
Khối lượng PA
(mg)
Khối lượng IB
(mg)
Khối lượng PA
trong 1 viên
thuốc
Khối lượng IB
trong 1 viên
thuốc
M01 250,9 112,9 ± 0,7 59,8 ± 0,9 324,5 ± 2,2 171,6 ± 2,7
M11 251,1 113,9 ± 2,8 60,5 ± 0,4 326,9 ± 8,0 173,5 ± 1,2
Bảng 3.13 Hàm lượng PA và IB trong mẫu dược phẩm Alaxan
Mẫu
Hệ số thu hồi (%)
PA IB
M01 99,8 ± 0,7 85,8 ± 1,4
M11 100,6 ± 2,5 86,8 ± 0,6
Dựa vào kết quả phân tích hàm lượng PA và IB ở trên ta nhận xét như sau
Hàm lượng PA và IB trong hai mẫu Alaxan khá ổn định. Đối với PA khối lượng từ 324,5
– 326,9 mg và đối với IB khối lượng từ 171,6 – 173,5 mg trong một viên nén thành phẩm
Alaxan.
Giữa hai mẫu thuốc Alaxan lấy từ hai nhà thuốc khác nhau, hàm lượng PA và IB chênh
lệch nhau không nhiều, qua khảo sát hai mẫu ta thấy rằng hàm lượng PA và IB trong các
mẫu tương đối ổn định suy ra quy trình sản xuất ổn định.

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
4.1. Kết luận
Kết quả đề tài “Định lượng Paracetamol trong một số dược phẩm bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” cho những kết luận sau:
1. Chọn điều kiện phù hợp để tách và xác định đồng thời PA và IB trong một số
chế phẩm thuốc dạng viên nén bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectorUV/Vis.
Cột tách RP – 18; 220x4,4 mm; kích thước hạt 5 µm
Thể tích vòng mẫu 20 µl
Bước sóng detector 224 nm
Nồng độ acid phosphoric 0,01M
Thành phần pha động ACN : H3PO4 0,01M (97 : 3 v/v)
Tốc độ dòng 0,7 ml/phút
2. Đề xuất quy trình chuẩn bị mẫu – chiết chất tối ưu.
Cân chính xác khối lượng 10 viên thuốc, nghiền mịn thành bột.
Cân chính xác 0,250 g mẫu, cho vào bình tam giác, thêm 30 ml dung dịch pha động,
đánh siêu âm trong 5 phút và lắc trong 15 phút (v = 480 vòng/phút). Lọc tách phần dung
dịch và phần rắn. Lặp lại 6 lần (có thể kiểm tra dịch chiết lần thứ 6 bằng cách tiêm dịch
chiết vào hệ thống HPLC và kiểm tra peak tại thời gian lưu của chất phân tích).
Thu toàn bộ dịch chiết, lọc qua màng lọc 0,45 µm, sau đó cho vào bình 250 ml và
định mức đến vạch bằng dung dịch pha động.
3. Xác định LOD, LOQ và khoảng tuyến tính cho 2 chất PA và IB như sau:
Tên chất Paracetamol Ibuprofen
LOD (ppm) 1,2 1,2
LOQ (ppm) 4,0 4,0

Phương trình hồi quy Y = 16879x – 54957 Y = 25061x + 78528
Hệ số tương quan R = 0,9997 R = 0,9998
Khoảng tuyến tính 4,8 – 360 ppm 4,8 – 360 ppm
4. Khảo sát và phân tích 2 mẫu thuốc Alaxan. Kết quả khảo sát cho thấy, hàm lượng PA và
IB trong các mẫu thuốc tương đối phù hợp với thành phần ghi trên bao bì. Ngoài ra, hai
mẫu có thành phần tương đương nhau và ổn định trong thời hạn sử dụng.
5. Đề xuất
Như vậy, với kết quả thu được, ta thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao, độ lặp
lại tốt, thích hợp cho việc phân tích đồng thời PA và IB trong các mẫu dược phẩm cũng
như phân tích PA hoặc IB trong các loại thực phẩm đơn thành phần.
Chúng tôi hi vọng những nghiên cứu trêncó thể góp phần vào việc ứng dụng phương
pháp RP - HPLC nói riêng và phương pháp HPLC nói chung để xác định các dược chất
trong các mẫu thuốc mới – ngày càng đa dạng về thành phần và hoạt chất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Đặng Thanh Thủy (2008), “Định lượng đồng thời Paracetamol và
Ibuprofen trong chế phẩm dược bằng phương pháp đo quang”, NXB ĐH Dược Hà Nội.
[2] Đặng Quỳnh Chi (2008), “Định lượng đồng thời Paracetamol và Codein
Phosphat bằng phương pháp điện di mao quản”, NXB ĐH Dược Hà Nội.
[3] Nguyễn Hữu Mỹ và cộng sự (2007), “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp
HPLC định lượng ibuprofen trong huyết tương chó”, Báo cáo y học, Học viện Quân Y,
NXB Đại học Dược Hà Nội.
[4] Nguyễn Thành Lộc (2013), “Xác định đồng thời Paracetamol và Ibuprofen
trong các dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)”, Khóa luận
tốt nghiệp,
[5] Phạm Thanh Huyền (2008),“Nghiên cứu xây dựng phương phápđịnh lượng
ibuprofen trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Khóa luận tốt nghiệp, Học
viện Quân Y, NXB Đại học Dược Hà Nội.
[6] Phạm Thu Quế (2010), “Định lượng đồng thời Paracetamol và Ibuprofen
trong viên nén bằng phương pháp quang phổ đạo hàm”, NXB ĐH Dược HàNội.
[7] Thái Duy Thìn và cộng sự (2003), “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và đo quang phổ UV – vis để định tính và định lượng các
hoạt chất trong thuốccó từ 2 đến5 thànhphần”, Viện kiểm nghiệm thuốc Bộ Y tế, Trường
Đại học Dược Hà Nội.
[8]

PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1. Một số sắc ký đồ của dãy chất chuẩn Paracetamol
Hình 1.1 Sắc ký đồ của chất chuẩn Paracetamol, C = 360 ppm

64
Hình 1.2 Sắc ký đồ của chất chuẩn Paracetamol, C = 240 ppm

65
Hình 1.3 Sắc ký đồ của chất chuẩn Paracetamol, C = 115,2 ppm

66

67

68
PHỤ LỤC 3. Sắc ký đồ của mẫu M01
Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu M01 tiêm lần 4.

69

70
PHỤ LỤC 4. Sắc ký đồ mẫu M11.

Bài Tập Tiểu Luận Môn Các Nguyên Lý Phân Tích Công Cụ.docx

Bài Tập Tiểu Luận Môn Các Nguyên Lý Phân Tích Công Cụ.docx

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Bài Tập Tiểu Luận Môn Các Nguyên Lý Phân Tích Công Cụ.docx

Similar to Bài Tập Tiểu Luận Môn Các Nguyên Lý Phân Tích Công Cụ.docx (20)

More from Dịch vụ viết đề tài trọn gói Zalo/Tele: 0917.193.864

More from Dịch vụ viết đề tài trọn gói Zalo/Tele: 0917.193.864 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Bài Tập Tiểu Luận Môn Các Nguyên Lý Phân Tích Công Cụ.docx