Xây Dựng Quy Trình Định Lượng Đồng Thời Imidacloprid Và Azoxystrobin Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao

DỊCH VỤ VIẾT THUÊ ĐỀ TÀI TRỌN GÓI ZALO TELEGRAM : 0934.573.149
TẢI FLIE TÀI LIỆU – LUANVANTOT.COM
TRƯỜNG ĐAỊ HOC̣ TÂY ĐÔ
KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI IMIDACLOPRID VÀ
AZOXYSTROBIN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Giáo viên hướng dẫn:
Th.s. NGUYỄN PHƯỚC ĐỊNH
Sinh viên thực hiện: LÊ
HỮU BẢO TRÂN
MSSV: 12D720401175
Lớp: ĐH DƯỢC 7B

Cần Thơ, năm 2023

LỜI CÁM ƠN
Qua 5 năm học tập và rèn luyện tại trường ĐH Tây Đô, dưới sự chỉ bảo và giảng
dạy nhiệt tình của quý thầy cô, đặc biệt là quý thầy cô khoa Dược-Điều dưỡng đã
truyền đạt cho em những kiến thức về lý thuyết và thực hành để em có thể hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp. Chính vì thế, một trong những yếu tố không nhỏ tạo nên “sản
phẩm trí tuệ” này là sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của giáo viên hướng dẫn và các
thầy cô. Bên cạnh đó còn có sự ủng hộ của gia đình và bạn bè mà em mới có thể hoàn
thành khóa luận một cách thuận lợi nhất.
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths. Nguyễn Phước Định,
người trực tiếp hướng dẫn em trong quá trình làm luận văn. Không chỉ gợi ý và hướng
dẫn em trong quá trình tìm hiểu, đọc tài liệu và lựa chọn đề tài, thầy còn tận tình chỉ
bảo em những kĩ năng phân tích, khai thác tài liệu để có được những lập luận phù hợp
với nội dung của khóa luận. Hơn nữa, thầy còn rất nhiệt tình trong việc đốc thúc quá
trình viết khóa luận, đọc và đưa ra những nhận xét, góp ý để em có thể hoàn thành luận
văn một cách tốt nhất.
Bên cạnh đó, em cũng xin gửi đến các thầy cô giáo đang hoạt động, giảng dạy tại
phòng Kiểm Nghiệm lòng biết ơn sâu sắc về những kiến thức và kĩ năng mà các thầy
cô đã truyền đạt, chỉ em thêm những kiến thức em còn thiếu sót, cũng như đóng góp
thêm ý kiến cho việc hoàn thành khóa luận.
Cần Thơ, tháng 6 năm 2023
Sinh viên
Lê Hữu Bảo Trân

TÓM TẮT
Hai hóa chất bảo vệ thực vật phổ biến nhất là imidacloprid và azoxystrobin được
nhiều nông dân tin dùng vì hai loại này có hiệu quả cao trong việc ngăn ngừa sâu bệnh
và nấm mốc gây hại, nên imidacloprid và azoxystrobin được chọn trong nghiên cứu
này. Điều này đặt ra yêu cầu cần có phuơng pháp phân tích chính xác và đơn giản xác
định hai hoạt chất trên. Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định được quy trình định
lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC). Kết quả nghiên đã lựa chọn được với điều kiện sắc ký trong đó cột
sắc ký RP- C18 (250 x 4,6mm, 5µm), pha động gồm acetonitril –nước với tỷ lệ (55%:
45%), tốc độ dòng 1ml/phút và phát hiện ở bước sóng 250 nm. Cả hai chất đã tách
được hoàn toàn trong thời gian 15 phút. Giới hạn định lượng của imidacloprid và
azoxystrobin lần lượt là 0,0048 ppm và 0,048 ppm. Diện tích pic và nồng độ có mối
tương quan tuyến tính với hệ số tương quan của imidacloprid là 0,9978 và của
azoxystrobin là 0,997. Phương pháp có độ đúng nằm trong khoảng 98-102% và độ lặp
lại tốt với RSD < 2%. Vì vậy quy trình có thể sử dụng để định lượng nhanh
imidacloprid và azoxystrobin từ đó xác định dư lượng của hai chất này trong dược
liệu.
Từ khóa: imidacloprid, azoxystrobin, định lượng, HPLC.

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu, chữ viết tắt Từ nguyên (nghĩa tiếng Việt)
ACN : Acetonitrile
As : Hệ số đối xứng
DĐVN : Dược điển Việt Nam
HPLC : High Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
LC50 : Lethal concentration (Nồng độ gây chết 50% )
LD50 : Lethal dose (Liều gây chết 50%)
LOD : Limit of quantitation (Giới hạn định lượng)
LOQ : Limit of detection (Giới hạn phát hiện)
PDA : Photo Diode Array (Dãy diod quang)
ppm : Part per million (phần triệu)
Rs : Resolution (Độ phân giải)
RSD : Relative Standard Deviation
(Độ lệch chuẩn tương đối)
SD : Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)
Speak : Diện tích pic sắc kí
UV : Tử ngoại
Vis : Khả kiến

v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc của imidacloprid ..................................................................................................... 3
Hình 2.2. Cấu trúc của azoxystrobin..................................................................................................... 5
Hình 2.3. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC ............................................................................................. 9
Hình 2.4. Sắc ký đồ thời gian lưu của chất A và chất B............................................................ 14
Hình 4.1. Phổ hấp thụ của azoxystrobin và imidacloprid trong acetonitrile. ................... 31
Hình 4.2. Sắc ký đồ ACN/ Nước (90%:10%)................................................................................ 32
Hình 4.3. Sắc ký đồ ACN/ Nước (95%:5%)................................................................................... 32
Hình 4.4. Sắc ký đồ ACN/ Nước (85%:15%) ................................................................................ 33
Hình 4.8. Kết quả sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống ................................................... 36
Hình 4.9. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với imidacloprid và azoxystrobin................... 38
Hình 4.10. Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,048 ppm ........................ 39
Hình 4.11. Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,0048 ppm...................... 39
Hình 4.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của imidacloprid
..............................................................................................................................................................................42
Hình 4.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của azoxystrobin .. 42

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thông tin về độc tính cấp của imidacloprid.................................................................. 4
Bảng 2.2. Thông tin về độc tính cấp của azoxystrobin ................................................................. 6
Bảng 2.3. Lực rửa giải của một số dung môi.................................................................................. 18
Bảng 3.1. Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC ..................................... 21
Bảng 3.2. Danh mục máy móc - thiết bị phục vụ cho đề tài nghiên cứu............................ 21
Bảng 3.3. Tỷ lệ thành phần pha động của acetonitril và nước................................................ 24
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của imidacloprid .................................. 36
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống azoxystrobin .......................................... 37
Bảng 4.3. Cách pha loãng dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin
trước khi tiêm vào hệ thống HPLC..................................................................................................... 40
Bảng 4.4: Diện tích peak ứng với từng nồng độ imidacloprid trong dãy chuẩn............. 41
Bảng 4.5: Diện tích peak ứng với từng nồng độ azoxystrobin trong dãy chuẩn............. 41
Bảng 4.6. Phương trình hồi quy của azoxystrobin và imidacloprid ..................................... 43
Bảng 4.7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu azoxystrobin........................................... 43
Bảng 4.8. Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với mẫu imidaclopid..................................... 44
Bảng 4.9. Độ chính xác trung gian đối với mẫu imidacloprid................................................ 44
Bảng 4.10. Độ chính xác trung gian đối với mẫu azoxystrobin............................................. 45
Bảng 4.11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với mẫu Imidacloprid ............. 45
Bảng 4.12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với azoxystrobin........................ 46
Bảng 5.1: Giá trị LOD, LQD và khoảng tuyến tính cho 2 chất imidacloprid và
azoxystrobin.................................................................................................................................................. 48

vii

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nông nghiệp, có nhiều mối nguy làm ảnh hưởng xấu đến năng suất và
chất lượng nông sản như sâu bệnh, cỏ dại, chuột, mối mọt, nấm... Vì vậy hóa chất bảo
vệ thực vật đóng vai trò quan trọng để phòng và loại trừ các loại dịch bệnh cho các sản
phẩm nông nghiệp. Hiện nay, khi trồng hầu hết các loại dược liệu cần phải sử dụng
hóa chất bảo vệ thực vật nhằm tăng năng suất và chất lượng dược liệu.
Gần đây một trong những phương pháp phổ biến nhất là việc sử dụng
imidacloprid và azoxystrobin là hai loại phổ biến nhất trong nông nghiệp để ngăn ngừa
sâu bệnh, côn trùng, nấm mốc ảnh hưởng đến cây trồng. Các công trình nghiên cứu
nước ngoài đã thành công trong việc định lượng imidacloprid hoặc azoxystrobin với
nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật khác bằng các phương pháp như: quang phổ UV-
VIS, sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ, sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC)…Trong đó
HPLC là phương pháp thường được sử dụng nhất do phương pháp này rất phổ biến,
thuận lợi, đỡ tốn kém và cho độ chính xác cao hơn so với các phương pháp khác.
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật phân tích
mới và hiện đại đã được áp dụng vào việc phân tích, xác định hàm lượng của chúng
nhằm kiểm soát chất lượng của các sản phẩm, đảm bảo an toàn và sức khỏe của người
sử dụng. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong những phương
pháp phân tích hiện đại, chính xác và nhanh chóng để phân tích hàm lượng của các
loại hóa chất bảo vệ thực vật đang được nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế.
Trong nghiên cứu này định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và
azoxystrobin từ đó có thể xác định dư lượng của hai chất này trong lá, rễ từ dược liệu
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC). Vì vậy đề tài “Xây dựng quy
trình định lượng đồng thời chuẩn imidacloprid và azoxystrobin bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện với mong muốn tìm ra một phương
pháp nhanh, hiệu quả và phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng thí nghiệm.
1.2. MỤC TIÊU
Nghiên cứu này được thực hiện chủ yếu với hai mục tiêu sau:
 Xây dựng điều kiện phân tích đông thời imidacloprid và azoxystrobin bằng
phương pháp HPLC sử dụng detector UV-VIS.


 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin.
1

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT NGHIÊN CỨU
2.1.1. Khái niệm hóa chất bảo vệ thực vật
Hóa chất bảo vệ thực vật là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với mục
đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm vật chủ trung
gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn của
thực vật hoặc động vật gây hại hoặc ảnh hưởng đến các quá trình sản xuất, chế biến,
bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức ăn
chăn nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện hay
các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chúng. Hóa chất bảo vệ thực vật còn được
dùng làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây,
tác nhân làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm. Cũng có thể dùng hóa chất bảo
vệ thực vật cho cây trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không
bị hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển (Trần Cao Sơn, 2015).
2.1.2. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật
Các hóa chất bảo vệ thực vật được phân loại theo ba nhóm chính sau:
- Thuốc trừ sâu: là một loại chất được sử dụng để chống côn trùng. Chúng bao
gồm các thuốc diệt trứng và thuốc diệt ấu trùng để diệt trứng và ấu trùng của côn trùng
như: imidacloprid, dichlopropene, methyl isocyanate, chloropicrin, methyl bromide….
Một số chất khác như: aldicarb, dazomet và metham natri, hoạt động chủ yếu qua tiếp
xúc. Gần như tất cả các loại thuốc trừ sâu đều có nguy cơ làm thay đổi lớn các hệ sinh
thái; nhiều loại thuốc trừ sâu độc hại với con người; và các loại khác tích tụ trong
chuỗi thức ăn (Saed Mousa Diab Ali, 2012).
- Thuốc diệt cỏ: Thuốc diệt cỏ kiểu Hormon như 2,4,5-T; 2,4-D;…là những
chất không hiện diện trong đất nhưng có độc tính cao đối với thực vật và thấp đối với
động vật có vú. Các chất thuộc nhóm này ít ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường nhưng
lại hòa tan hoàn toàn trong nước và trong các mạch nước ngầm. Các loại thuốc diệt cỏ
ảnh hưởng trực tiếp trên thân, lá bao gồm: dintrophenols, xianophenols,
pentachlorophenol và Paraquat (Saed Mousa Diab Ali, 2012).
- Thuốc trừ nấm: là những chất độc có nguồn gốc từ tự nhiên hay hóa chất tổng
hợp được dùng để bảo vệ cây trồng và nông sản, chống lại sự phá hoại của nấm mốc,
vi khuẩn ảnh hưởng đến năng suất của cây trồng Nhiều loại thuốc trừ nấm khác nhau
được sử dụng, với các hóa chất có cấu trúc khác nhau. Hầu hết đều có độc tính tương

đối thấp, ngoại trừ các chất thuộc nhóm carbamat như benomyl. Độc tính của thuốc trừ
nấm ảnh hưởng lớn đến môi trường nhất là đối với hệ vi sinh vật trong đất nhưng ảnh
hưởng này chỉ trong thời gian ngắn (Saed Mousa Diab Ali, 2012).
2

Trong nghiên cứu này hai chất hóa chất bảo vệ thực vật khảo sát đó là
imidacloprid và azoxystrobin. Theo các tài liệu trong và ngoài nước đã phân loại
imidacloprid thuộc nhóm thuốc trừ sâu và azoxystrobin thuộc nhóm thuốc trừ nấm.
Dựa vào tính chất và đặc điểm của từng nhóm từ đó chọn ra phương pháp nghiên cứu
phù hợp.
2.1.3. Imidacloprid
2.1.3.1. Khái niệm
Imidacloprid là một trong những loại hoạt chất có phổ được sử dụng rộng rãi
nhất. Nó được dùng để trừ hầu hết các loại sâu hại trong nông nghiệp, lâm nghiệp, trừ
mối,….Do có độ độc bởi vòng Pyridin có gắn với nguyên tử Clo và dị vòng Azo 5
cạnh, có độ độc cao với côn trùng, diệt trừ sâu, bướm, rầy, rệp…(Sacramento, 2002).
2.1.3.2. Cấu tạo[31]
Hình 2.1. Cấu trúc của imidacloprid
- Tên chung quốc tế: imidacloprid
- Công thức phân tử: C9H10ClN5O2
- Khối lượng phân tử: 255,662 g/mol
- Danh pháp IUPAC: N-[1-[(6-chloropyridin-3-yl)methyl]-
4,5-dihydroimidazol-2-yl]nitramide
- Loại HCBVTV: thuốc trừ sâu
- Nhóm: Neonicotinoid
2.1.3.3. Tính chất vật lý và hóa học (Sprivastava, 2004)
- Dạng bột tinh thể màu hoặc bột màu be, có mùi đặc trưng nhẹ
-
Tỷ trọng: 1.54 g/cm3
- Nhiệt độ nóng chảy ở 144o
C
- Áp suất hơi: 1.00 x 10-7 mm Hg (20o
C)
- Độ ổn định: ổn định trong điều kiện bảo quản được khuyến cáo

- Độ tan trong nước: 0,61 g/l (20o
C)
- Thời gian bán hủy: Trên 30 ngày (25o
C ở pH 7)
- Độ hòa tan: Tan trong các dung môi như: nước, dchloromethane,
isopropanol, toluene ở nhiệt độ 20o
C
3

- 0.Phân hủy ở pH khoảng 5-11, khi đun nóng ở nhiệt độ cao, sinh ra khí độc
2.1.3.4. Độc tính của Imidacloprid (Raihanah, 2016)
Theo một số tài liệu nghiên cứu của các tác giả nước ngoài, imidacloprid gây
độc với động vật ở một liều nhất định, cụ thể trong bảng sau:
Bảng 2.1: Thông tin về độc tính cấp của imidacloprid
Động vật thí nghiệm Đường dùng Kết quả
miệng LD50 tương đương 130 mg/kg
da
LD50 > 5000 mg/kg và gây kích
ứng da nhẹ
hít LC50 > 5,33 mg/l
Chuột
Nuốt một lượng lớn có thể gây
tiêu hóa
nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, lơ
mơ, trầm cảm, chuột rút, run rẩy
và rối loạn hô hấp.
mắt Gây kích ứng mắt
Trong các trường hợp đã được khảo sát về độc tính của Imidacloprid ở người
ngộ độc cấp thường có các dấu hiệu bao gồm buồn ngủ, chóng mặt, nôn mửa, không
tỉnh táo và sốt. Các trường hợp ngộ độc này phụ thuộc vào hàm lượng imidacloprid có
trong chế độ ăn uống (Spivastava, 2004).

Liều dùng cho phép mỗi ngày (ADI) trong khẩu phần ăn hằng ngày ở người
có chứa imidacloprid là 0,06 mg/kg một ngày (Spivastava, 2004).

2.1.3.5. Cơ chế tác động của imidacloprid (Spivastava, 2004)
Imidacloprid thuộc nhóm Neonicotinoid là nhóm hóa chất bảo vệ thực vật gây
kích thích thần kinh có cấu trúc tương tự nicotin. Cơ chế gây độc là do các sản phẩm
này này gắn với các receptor của acetylcholin, gây độc thần kinh trung ương.
Imidacloprid có độc tính cao với côn trùng vì nó gắn kết tốt hơn với các thụ thể của tế
bào thần kinh của côn trùng. Đường tiếp xúc qua da có độc tính thấp, có thể gây đỏ và

ngứa mắt nhẹ. Chưa có các bằng chứng về gây ngộ độc cấp tính trên người. Các
nghiên cứu cũng cho thấy các chất này phân hủy nhanh trong đường tiêu hóa và loại
trừ qua phân, nước tiểu trong vòng 48 giờ.
4

2.1.4. Azoxystrobin (Bursic Vojislava and Lazic Sanja, 2012)
2.1.4.1. Khái niệm
Azoxystrobin là một loại thuốc diệt nấm phổ rộng có hoạt tính chống lại một số
bệnh trên nhiều cây ăn quả và cây cảnh nhằm mục đích ngăn ngừa các bệnh ở lúa, nấm
mốc, rụng lá …gây hại ảnh hưởng đến năng suất trồng trọt.
2.1.4.2. Cấu tạo
Hình 2.2. Cấu trúc của azoxystrobin
- Tên chung quốc tế: Azoxystrobin
- Công thức phân tử: C22H17N3O5
- Khối lượng phân tử: 403,4 g/mol
- Danh pháp IUPAC: Methyl (E)-2-[2-[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4-
yl]oxyphenyl]-3-methoxyprop-2-enoate.
- Loại HCBVTV: thuốc trừ nấm
- Nhóm: methoxyacrylates
2.1.4.3. Tính chất vật lý và hóa học (Rao Nageswara, 2012)
- Dạng bột tinh thể màu trắng
- Nhiệt độ nóng chảy ở 116 o
C
- Tỷ trọng: 1.25 g/cm3
(ở 25 ºC)
- Độ ổn định: ổn định trong điều kiện bảo quản được khuyến cáo
- Độ hòa tan: Tan trong các dung môi như: hexane, methanol, toluen, acetone,
ethyl acetat, acetonitril, dichloromethane, nước ở nhiệt độ 20o
C.
- Phân hủy khi đun nóng ở nhiệt độ cao, sinh ra khí độc nitrogen oxide (N2O)
2.1.4.4. Độc tính của azoxystrobin (Sh.A.Ashorkr, 2006)
Theo tác giả T.Nageswara Rao và cộng sự năm 2012 đã khảo sát độc tính của
azoxystrobin qua các thí nghiệm trên các động vật thí nghiệm như bảng sau:

5

Bảng 2.2. Thông tin về độc tính cấp của azoxystrobin
Động vật thí nghiệm Đường dùng Kết quả
Chuột đực uống
LD50 > 2000 mg / kg.
Không có tác dụng phụ
Chuột đực và cái da
LD50 > 2000 mg / kg
Không có tác dụng phụ
Chuột đực và cái hít
LC50 tương đương 0,38 mg /l trong
không khí
Thỏ đực da Không gây kích ứng trên da
Thỏ đực và cái mắt Không gây kích ứng trên da

Liều dùng cho phép mỗi ngày (ADI) trong khẩu phần ăn hằng ngày ở người có
chứa azoxystrobin khoảng 0-0,2 mg/ kg một ngày (T.Nageswara Rao và cộng sự, 2012).

2.1.4.5. Cơ chế tác động (T.Nageswara Rao và cộng sự, 2012).
Azoxystrobin là một chất diệt nấm phổ rộng thuộc nhóm methocyacrylate.
Được bắt nguồn từ các strobilurin tự nhiên xảy ra. Nó hoạt động với chất diệt nấm
bằng cách ức chế ty thể trong nấm. Chúng tạo thành một lớp bảo vệ trên bề mặt thực
vật và ức chế sự phát triển của bào tử nấm.
2.1.5. Các loại hóa chất bảo vệ thực vật chứa imidacloprid và azoxystrobin
- Danh mục thuốc có chứa imidacloprid: Confidor 100 SL, Actador 100WP,
Javidan 100 WP, Anvado 100WP, Conphai 10WP, Kola 700WO, Abamix 1,45SP,
Aba- plus 100EC…[32]
- Danh mục thuốc có chứa azoxystrobin: Amistar Top 250 SC, Amistar Top
325 SC, Mi stop 350 SC, Ohho 3255SC, Neoamistagold 360SC, 400SC, 450SC,
500SC, Ammisdotop 400SC, Dovatop 400SC , Paramax 400SC[34].
Các loại thuốc trên được bán rộng rãi trên cả nước, trong các đại lý thuốc trừ
sâu, hóa chất bảo vệ thực vật.

2.1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.1.6.1. Một số phương pháp định lượng imidacloprid bằng phương pháp HPLC
Phương pháp 1(J.Serb, 2009)
6

- Cột C18 (250 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Đầu dò UV-Vis
- Pha động: acetonitril / 0,01 M dung dịch đệm phosphate (pH 3.0) với tỉ lệ
25%: 75%
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Nhiệt độ 25o
C
- Bước sóng: 270 nm
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
Phương pháp 2 (Sacramento, 2002):
- Cột C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Đầu dò UV-Vis
- Pha động: acetonitril 30% : Nước 70%
- Bước sóng 270 nm
- Thời gian lưu của imidacloprid: 5,5 phút
Phương pháp 3 (Sprivastava, 2004):
- Cột C18 (75 cm x 4,6 mm, 3,5 µm)
- Đầu dò khối phổ QuEChERS
- Pha động: acetonitril 20%: Nước 80%
- Bước sóng: 270 nm
Phương pháp 4 (Raihanah, 2004):
- Cột C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Đầu dò UV-Vis
- Pha động: acetonitril 20% : nước 80%
Các phương pháp này đã được thẩm định về độ tuyến tính, giới hạn phát hiện
(LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung

gian), và độ đúng (phục hồi). Phương pháp này cho kết quả phân tích tốt với độ tuyến
tính có hệ số tương quan cao, độ phục hồi nằm trong giới hạn cho phép. Nên phương
pháp này có thể thực hiện trong phòng thí nghiệm.
7

2.1.6.2. Các phương pháp định lượng azoxysrobin bằng phương pháp HPLC
Phương pháp 1 (Bursic Vojilava and Lazic Sanja, 2012):
- Cột C18 (250 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Đầu dò UV-Vis
- Thời gian lưu của azoxystrobin: 11,07 phút.
Phương pháp 2 (Burket and Sapiests, 2005):
- Cột RP C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Đầu dò UV-Vis
- Thời gian lưu của azoxystrobin: 8,3 phút
Phương pháp 3 (Rao Nageswara, 2012):
- Cột C18 (250 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Đầu dò UV-Vis
- Pha động: acetonitril 70% : acid formic 30%
2.1.6.3. Phương pháp định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và
azoxystrobin.
Hiện chưa có nghiên cứu nào trong và ngoài nước định lượng đồng thời hai chất
imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC. Nhưng đã có nghiên cứu định
lượng đồng thời hai hóa chất bảo vệ thực vật khác bằng phương pháp HPLC. Ví dụ
như định lượng đồng thời imidacloprid hoặc azoxystrobin với một hóa chất bảo vệ

thực vật khác thuộc nhóm thuốc trừ sâu, thuốc trừ nấm hay thuốc diệt cỏ bằng phương
pháp sắc ký lỏng nâng cao hay sắc ký khối phổ.
Năm 2015 tác giả Trần Cao Sơn đã nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất vảo
vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ. Trong
8

nghiên cứu này tác giả nêu ra một số phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật
trong đó có cả imidacloprid và azoxystrobin bao gồm phương pháp xử lý mẫu và các
kỹ thuật dùng để phân tích. Các kỹ thuật dùng để phân tích hóa chất bảo vệ thực vật
như sắc ký khí và sắc ký lỏng. Nhưng trong nghiên cứu này tác giả chọn sắc ký lỏng vì
có khả năng ứng dụng rộng, phù hợp với các dung môi phân cực như methanol,
acetonitril, nước và được sử dụng phổ biến ở Việt Nam (Trần Cao Sơn, 2015).
2.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
2.2.1. Khái niệm
HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cở sở của sự phân tách các chất trên một
pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc
ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy vào loại pha tĩnh
sử dụng (Võ Thị Bạch Huệ, 2016)
2.2.2. Phân loại
Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: sắc ký lớp mỏng áp suất cao
(HPTLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Trong nhóm HPLC, tùy theo bản chất của quá trình sắc kí của pha tĩnh trong cột
tách mà người ta chia thành:
- Sắc kí phân bố của chất tan giữa hai pha không tan (trộn) vào nhau.
- Sắc kí hấp phụ pha thường.
- Sắc kí hấp phụ pha ngược hay pha đảo.
- Sắc kí trao đổi ion và cặp ion.
- Sắc kí rây phân tử.
2.2.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC (Thái Duy Thìn, 2013)

Hình 2.3: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC
9

Trong đó:
1 - Bình chứa dung môi pha động.
2 - Bộ phận khử khí.
3 - Bơm cao áp.
4 - Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler).
5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt.
6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu).
7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và
điều khiển toàn bộ hệ thống.
8 - Thiết bị in dữ liệu
2.2.3.1. Bình đựng dung môi
Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho
phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong
muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100%. Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì
chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa
là 3 hoặc 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động
đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định.

Lưu ý: Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết
và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích. Tất cả các
hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết
phân tích và phải lọc qua hệ thống lọc 0,2 – 0,45 µm nhằm mục đích tránh làm hỏng
cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các peak tạp trong quá trình phân tích.

2.2.3.2. Bộ phận khử khí
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi
pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt
khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra:
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian
lưu của peak thay đổi.

- Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có
thể Pump sẽ không hút được dung môi (bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ
ngừng hoạt động. Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai.
10

2.2.3.3. Bơm cao áp
Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc kí, rửa giải chất tan ra
khỏi cột sắc kí. Bơm phải điều chỉnh được áp suất (0 – 200 bar) để tạo ra được những
tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc kí, phải có tốc độ
nằm trong vùng 0,5 – 2 ml/phút.
2.2.3.4. Bộ phận tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với
dung tích của loop là 5 – 100 µl. Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ
công (tiêm bằng syringe) và tiêm mẫu tự động (auto sampler).
2.2.3.5. Cột sắc ký
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm,
đường kính trong 1- 10 mm, hạt chất nhồi cỡ 5 - 10 µm. Ngoài ra còn có một số trường
hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt …
Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký (trong các dược điển USP 23, 24
có tiêu chuẩn hóa các lọai cột). Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường)
hoặc là silicagel đã được silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo),
ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao
đổi ion.
Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp
hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong thiết bị điều nhiệt.

Lưu ý: Tuyệt đối không đánh siêu âm vì sẽ làm hư cột.

2.2.3.6. Đầu dò
Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi
cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo
tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và
phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.
Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp để
đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như khi định lượng chúng. Hiện

nay, detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ hay UV-Vis đang được dùng phổ biến
nhất vì nó thích hợp cho nhiều loại chất và lại ko quá đắt.
2.2.3.7. Bộ phận ghi tín hiệu
Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang.
11

+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ,
thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao….
+ Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất
cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, hệ số phân giải...
trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của
người sử dụng như: nồng độ, RSD…
2.2.3.8. Thiết bị in dữ liệu
Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra
giấy để hoàn thiện hồ sơ.
2.2.4. Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột (Võ Thị Bạch Huệ, 2016)
Mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động. Pha này có thể là một chất khí,
chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không
hòa lẫn với nó. Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn. Các chất tan
là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy
thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác
nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích
định tính và định lượng.
Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định và là yếu tố quyết
định bản chất của quá trình sắc ký.
Có 4 kỹ thuật sắc ký căn bản: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, trao đổi ion và
sắc ký rây phân tử. Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng nhiều nhất trong kiểm
nghiệm.
2.2.5. Sắc ký phân bố hiệu năng cao (Trần Tử An và Thái Nguyễn Hùng Thu, 2007)
Sắc ký phân bố là phương pháp phân tách dựa trên độ khác biệt về phân bố của
các cấu tử giữa pha tĩnh và pha động. Sắc ký phân bố được chia làm 2 loại tùy thuộc
vào pha tĩnh: sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết.
 Pha tĩnh:
Sắc ký lỏng - lỏng: Pha tĩnh gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề
mặt các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác. Các tiểu phân này thường
có đường kính từ 3 đến 10 µm (kích thước hạt có thể đến 50 µm hoặc lớn hơn trong

sắc ký điều chế). Pha tĩnh kiểu này có nhược điểm là: bị rửa trôi dần theo dòng pha
động, hiệu lực cột sẽ giảm dần trong quá trình sử dụng.
Sắc ký pha liên kết: Pha tĩnh được liên kết hóa học với chất mang nên khắc
12

phục được nhược điểm của sắc ký lỏng - lỏng. Trong pha tĩnh loại này, các nhóm chức
hữu cơ liên kết với bề mặt của các tiểu phân silica qua nhóm silanol. Tính phân cực
của loại pha tĩnh này phụ thuộc vào tính phân cực của các nhóm chức liên kết.
 Pha động
Pha động trong sắc ký phân bố có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp nhiều dung
môi. Người ta có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ các
thành phần dung môi.
Tùy thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh, người ta chia sắc ký phân bố
thành 2 loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.
- Sắc ký pha thuận: Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực
được gọi là sắc ký pha thuận. Dung môi pha động thường là các hydrocacbon mạch
thẳng như: pentan, hexan, heptan…Trong sắc ký pha thuận các chất không phân cực sẽ
được rửa giải sớm, thứ tự rửa giải sẽ chậm dần theo chiều tăng của độ phân cực của
các thành phần trong mẫu thử.
- Sắc ký pha đảo: Hệ pha động phân cực và pha tĩnh không phân cực gọi là sắc
ký pha đảo. Đây là phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm. Chất
càng tan tốt trong dung môi phân cực thì càng được rửa giải sớm. Dung môi pha động
thường là: nước, methanol, acetonitril…Việc đuổi khí hòa tan trong pha động rất quan
trọng trong sắc ký pha đảo.
2.2.6. Các thông số đặc trưng trong HPLC (Trần Tử An, 2007)
2.2.6.1. Thời gian lưu tR
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi
chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các
chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn.
Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất. Thời gian lưu phụ
thuộc vào các yếu tố:

Bản chất sắc ký của pha tĩnh.



Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.



Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.



Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.


Trong một phép phân tích nếu tR’ nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tR’ quá lớn
thì peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời
kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép
phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố mà tR phụ thuộc.
13

Hình 2.4. Sắc ký đồ thời gian lưu của chất A và chất B
2.2.6.2. Hệ số phân bố K
Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:
KCS
CM
Trong đó: Cs là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh (mol/l)
CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động (mol/l)
Hệ số K phụ thuộc bản chất của pha động, pha tĩnh và chất hòa tan. Trị số K
càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn
hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn.
2.2.6.3. Hệ số dung lượng K’
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai
pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất
tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.
K ' tR
t0 t0
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì peak bị doãng.

Trong thực tế K’ từ 1 - 5 là tối ưu.
14

2.2.6.4. Hệ số tách α
Hệ số tách α (hay còn gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B) là đại
lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ
số phân bố và là tỉ số của hệ số phân bố của hai chất.
  K
K
A  KA t
B KB t
RA
RB
Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α ≠ 1
2.2.6.5. Số đĩa lý thuyết
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc
ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều
cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà
trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất
tan trong pha tĩnh và pha động. Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh



Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động



Hệ số khuếch tán của các chất trong cột.

Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối
với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định. Số đĩa lý thuyết
được tính theo công thức sau:
 t 
2
R
N 5,54 
W
 
 0,5 
Trong đó: tR là thời gian lưu của chất phân tích.
W0,5 là độ rộng tại ½ của peak.
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ.
2.2.6.6. Độ phân giải RS

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một
điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của hai peak cạnh nhau phải được tính theo công
thức sau:
15

R  2 t  t
RB RA
S
W W
A
B
Trong đó: tRA, tRB: thời gian lưu của hai peak liền kề nhau
WB, WA: độ rộng pic đo ở các đáy peak
Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách
nhau là RS = 1,0. Trong phép định lượng RS = 1,5 là phù hợp.
Nếu R càng lớn thì hai chất A và B càng tách ra xa nhau, nếu hai chất này tách
nhau quá xa làm cho đường nền càng kéo dài thì cũng không cần thiết. Vì như thế tốn
nhiều dung môi (pha động) để rửa giải các chất hơn. Do đó giá trị RS chỉ vừa đủ để
tách hoàn toàn hai chất ra khỏi nhau là tốt. Nghĩa là chỉ cần hai peak vừa tách ra khỏi
hẳn nhau dứt khoát là được.
2.2.6.7. Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký
Để đánh giá tính đối xứng của pic sắc ký người ta dùng các đại lượng:
 Hệ số bất đối AF:
AF
b
a
Trong đó: a: nửa chiều rộng phía trước peak
b: nửa chiều rộng phía sau peak
(cả a và b được đo ở 1/10 chiều cao peak)
Giá trị AF càng gần 1, peak càng đối xứng.
 Hệ số kéo đuôi AS
A a b
s
2a
- Với a và b đo ở 1/20 chiều cao peak
- Nếu AS càng lớn hơn 1, peak kéo đuôi càng nhiều, peak càng mất cân đối.
- Hệ số kéo đuôi của peak chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ AS ≤ 1,5).
2.2.7. Phương pháp chọn điều kiện sắc ký

Muốn có một kết quả tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho
một hỗn hợp mẫu, các điều kiện đó bao gồm:
Pha tĩnh:
16

- Loại pha tĩnh.
- Kích thước cột.
Pha động:
- Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ… nếu là chương trình rửa giải
isocratic.
- Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình dung môi…
nếu là chương trình rửa giải gradient.
2.2.7.1. Lựa chọn pha tĩnh
Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong
mẫu phân tích; ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thường, cột pha đảo
hay các loại cột khác nhau….
Thông thường ta dùng 2 loại cột pha thường (NP) và cột pha đảo (RP).
 Cột pha thường (NP): Silicagel trung tính. Pha tĩnh loại cột này dùng để tách
các chất có độ phân cực thấp hay trung bình. Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa
các nhóm – OH phân cực ưa nước.

 Cột pha đảo (RP): Silicagel đã alkyl hóa. Pha tĩnh loại cột này dùng để tách
các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp ion. Trên bề
mặt hoạt động các nhóm – OH đã bị alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các
mạch carbon thẳng (C8 hay C18 tương đương RP-8 hay RP-18) hay các mạch carbon
vòng (phenyl- tương đương cột phenyl). Vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít.
2.2.7.2. Lựa chọn pha động
Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong
mẫu phân tích; ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn
các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời
phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi, hóa chất, thời gian
phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị. Pha động có thể làm thay đổi:
+ Độ chọn lọc α.
+ Thời gian lưu.
+ Hiệu năng tách của cột.
+ Độ phân giải.

+ Tính đối xứng của peak.
Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần
phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân
17

tích. Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau:
- Pha động phải trơ với pha tĩnh. Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa
học ( ví dụ giá trị pH: 2,5 < pH < 8,5).
- Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng
đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để
không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột. Ví dụ: đệm
phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên cột.
- Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là
pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu.
- Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích.
- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Phải phù hợp với loại detector: detector UV-Vis thì dung môi không được hấp
thụ quang (ví dụ: acid acetic hấp thụ ở bước sóng thấp < 220 nm). Detector huỳnh
quang thì dung môi không được phát quang.
- Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt. Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP -
HPLC), pha động là dung môi phân cực: nước, ACN, MeOH, acid hay base hữu cơ và
một vài amin hay acid amin …
- Ngoài các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều
trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm để ổn định pH. Chất tạo phức,
tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất.

Khichọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải E của dung môi theo
bảng sau:
Bảng 2.3. Lực rửa giải của một số dung môi
Dung môi Lực rửa giải E
n-Hexan 0,1
Tetrachlorua carbon 1,6
Toluen 2,4
Methanol 5,11
Acetonitril 10,20

Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây
dựng chương trình sắc ký. Chỉ khi lựa chọn điều kiên sắc ký tốt, phù hợp thì chúng ta
mới có thể định tính, định lượng được các lọai hóa chất một cách nhanh chóng và hiệu
18

quả cao. Tất nhiên phần lý thuyết nói rất nhiều về các phương pháp chọn điều kiện sắc
ký, tuy nhiên để chọn được chương trình sắc ký tốt đòi hỏi phải có thời gian, tài liệu và
một phần kinh nghiệm của những người làm sắc ký.
2.2.8. Các bước tiến hành sắc ký (Võ Thị Bạch Huệ, 2012)
2.2.8.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc
Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt,
cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc đô dòng,
năng lượng đèn UV… đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra.
Cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi
ngờ về khả năng tách và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy sắc ký:
Ví dụ: Sắc ký pha thường NP-HPLC: Rửa bằng methanol; không rửa bằng
nước. Còn sắc ký pha đảo RP-HPLC: khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa
nước trước cho sạch.Tỷ lệ ACN hay methanol: Nước là 50%: 50% cho sạch hết các
chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu. Tuyệt đối
tránh tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó để cột một thời gian không sử dụng
chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng được.

Lưu ý: Nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng
được các yêu cầu phân tích.

2.2.8.2. Chuẩn bị dung môi pha động
Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết dành cho HPLC. Các hóa chất
dùng phải là loại tinh khiết phân tích. Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã
nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu
2.2.8.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC
 Mẫu thử: Xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, quy trình theo nguyên tắc sau:
- Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường
hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu.
- Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được
bằng cách lọc hay chiết ….
- Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm.
- Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Có thể
gây ra nghẽn cột.

 Mẫu chuẩn:
Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi,
riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng
19

nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.
2.2.8.4. Cách vận hành thiết bị
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm điều
khiển hệ thống sắc ký HPLC. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau:
- Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống
dẫn trước khi cho vào cột.
- Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như:
 Cấu hình máy

 Tỷ lệ các dung môi pha động

 Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu.

20

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.1.1. Chất chuẩn
- Chất chuẩn: imidacloprid và azoxystrobin.
- Nhà sản xuất: Sigma Aldrish
- Hàm lượng: imidacloprid: 99,82%
azoxystrobin: 99,60%
3.1.1.2. Dung môi
Bảng 3.1. Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC
STT Tên dung môi Nhà sản xuất Tiêu chuẩn
1 Acetonitril Đức Dùng cho HPLC
2 Methanol Đức Dùng cho HPLC
3 Nước cất hai lần ĐH Cần Thơ Dùng cho HPLC
Bảng 3.2. Danh mục máy móc - thiết bị phục vụ cho đề tài nghiên cứu
STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất
1 Bơm cao áp Pump Germany
2 Bộ loại khí cho dung môi Vacuum Degasser Germany
3 Thiết bị tiêm mẫu Syringe 100µl Hamilton
4 Thiết bị nạp mẫu Injector 20µl USA
3.1.2. Dụng cụ - Thiết bị
3.1.2.1 Thiết bị
3.1. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ
3.1.1. Hóa chất

5 Cột sắc ký Columns Germany
RP-18, 250x4,6 mm,
kích thước hạt 5µm
6 Thiết bị ghi tín hiệu UV/Vis Detector Germany
21

STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất
7 Bộ lọc dung môi dùng giấy Glassico India
lọc 0,45µm
8 Máy rút chân không Neuburger Germany
9 Máy đánh siêu âm S100H Elmasonic Germany
10 Cân phân tích Balances and Precious USA
Metal scales
11 Bộ lọc nước Dùng cho HPLC
3.1.2.2. Dụng cụ
- Bình định mức 100 ml, 50 ml, 25 ml, 10 ml.
- Pipet chính xác: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 25 ml.
- Cốc thủy tinh 50 ml, 100 ml.
- Ống nhỏ giọt, bình tia.
- Bơm tiêm, vial
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như sau:

Lựa chọn điều kiện sắc ký


- Lựa chọn cột sắc ký
- Lựa chọn pha động và các điều kiện pha động
- Tốc độ dòng, thể tích tiêm
- Lựa chọn bước sóng phát hiện

Đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng bằng cách thẩm định quy trình


- Độ thích hợp của hệ thống sắc ký
- Độ đặc hiệu
- Khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak
- Độ lặp lại
- Độ đúng

22

3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Chuẩn bị dung dịch
 Chuẩn bị dung môi pha mẫu
- Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp với các tài
liệu tham khảo, khảo sát lựa chọn ra dung môi pha mẫu thích hợp.
- Tiến hành pha dung môi pha mẫu để phục vụ cho quá trình phân tích
 Chuẩn bị dung dịch gốc và dung dịch mẫu chuẩn
Để có thể định lượng được imidacloprid và azoxystrobin, việc chuẩn bị dung
dịch gốc và các mẫu chuẩn là rất cần thiết. Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các
chất nghiên cứu, kết hợp các tài liệu tham khảo lựa chọn ra dung môi pha và bảo quản
dung dịch chuẩn gốc.
3.3.2. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký (Vũ Thị Quỳnh, 2013)
3.3.2.1. Chọn cột
Trên thị trường có rất nhiều hãng sản xuất cột sắc ký pha đảo C8 và C18 …. Tuy
nhiên cột RP –18 được sử dụng rộng rãi trong ngành kiểm nghiệm dược phẩm nhờ
danh tiếng thương hiệu, chất lượng cột cũng như tính kinh tế so với các loại cột khác.
Hiện nay, phòng thí nghiệm có trang bị loại cột này và được kỹ thuật viên
thường xuyên kiểm tra, đánh giá tình trạng. Vì vậy, ta chọn cột RP – 18, kích thước hạt
5 μm, 250 x 4,6 mm cho phép định lượng này.
3.3.2.2. Chọn bước sóng cho detector
Trong phép phân tích đồng thời, việc lựa chọn bước sóng rất quan trọng vì nó
quyết định tới độ nhạy của phép phân tích. Do phương pháp phân tích là HPLC sử
dụng đầu dò là detector UV-Vis cố định bước sóng, ta cần khảo sát điều kiện nhằm
chọn bước sóng tối ưu để phân tích đồng thời các chất.
Dựa vào tài liệu tham khảo và cực đại hấp thụ của imidacloprid và azoxystrobin
ta chọn các bước sóng tiêu biểu. Sau đó tiến hành khảo sát bước sóng trên thiết bị
HPLC lần lượt tại các bước sóng λ bằng 220 nm, 250 nm, 255 nm, 260nm. Bên cạnh
đó sử dụng máy UV-VIS SHIMADZU quét phổ khoảng từ 200-400nm để phát hiện ra
bước sóng tối ưu nhất cho cả hai chất imidacloprid và azoxystrobin.

Căn cứ phổ đồ thu được, kết hợp các tài liệu tham khảo và tiến hành khảo sát để
lựa chọn bước sóng phát hiện phù hợp
3.3.2.3. Khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC
Dựa vào kết quả thực nghiệm ở mục 3.3.2.3 ta tiến hành tiêm mẫu là hỗn hợp
23

azoxystrobin và imidacloprid nồng độ 50 ppm vào hệ thống HPLC với điều kiện như sau:
- Cột tách: RP – 18, 5 μm, 250 x4,6 mm.
- Pha động: C: acetonitril (CH3CN); D: Nước
- Thời gian: 0 – 20 phút, 55%C: 45%D.
- Nồng độ mẫu: 50 ppm.
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Detector: UV- Vis đặt tại các bước sóng 220 nm, 250 nm, 255 nm, 260nm.
- Thể tích vòng mẫu: 20 µl.
3.3.2.4. Khảo sát thành phần pha động
Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa
giải các chất mẫu ra khỏi cột. Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc
trưng cho quá trình sắc kí. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của
dung môi pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích
qua đó làm thay đổi hệ số lưu của chất phân tích đó. Vì vậy để có được tỷ lệ thành
phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát hệ sắc kí với tỷ lệ thành phần pha động
khác nhau với các điều kiện sắc kí như nhau:
- Cột tách: RP – 18, 5 μm, 250 x 4,6 mm.
- Thể tích vòng mẫu: 20 μl
- Nồng độ chất phân tích: 50 ppm.
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Pha động: C: acetonitril (CH3CN); D: nước
- Thời gian: 0 -20 phút
- Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 250 nm
Khảo sát pha động bằng cách thay đổi thành phần pha động (gradient) lần lượt
với tỷ lệ như sau:
Bảng 3.3. Tỷ lệ thành phần pha động của acetonitril và nước
Acetonitril (%) Nước (%)
95 10
90 5

85 15
80 20
24

Acetonitril (%) Nước (%)
60 40
55 45
50 50
40 60
3.3.2.5. Khảo sát tốc độ dòng
Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng
đến quá trình thiết lặp cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng
quá nhỏ sẽ làm dãn rộng chân peak, thời gian rửa giải lâu hơn. Tuy nhiên nếu tốc độ
dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn,
nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau. Vì vậy cần phải khảo sát để tìm
ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích.
- Cột tách: RP – 18, 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 μm
- Pha động: C: acetonitril (CH3CN); D: nước
- Thời gian: 0 – 20 phút, 55%C: 45%D.
- Nồng độ chất phân tích: 50 µg/ml.
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; 0,8 ml/phút; 1 ml/phút; 1,2 ml/phút; 1,5ml/phút
- Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 250 nm.
- Thể tích vòng mẫu: 20 μl
3.3.3. Thẩm định phương pháp (ICH, 1996)
 Định nghĩa: Thẩm định quy trình phân tích là quá trình thiết lập bằng thực
nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh quy trình phân tích đó
có phù hợp và có đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Khi tiến hành thử nghiệm các sai
số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được (Bộ y tế, 2009)

 Mục đích:
- Giúp thực hiện các chỉ tiêu kiểm nghiệm trong tiêu chuẩn kiểm nghiệm.
- Là công việc bắt buộc có tính chất định kỳ nhằm đảm bảo phương pháp phân
tích là phù hợp và kết quả phân tích đạt độ tin cậy trong suốt quá trình phân tích.
- Để đưa vào chuyên luận Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở (Bộ y tế, 2009)

3.3.3.1 Tính phù hợp hệ thống
Tiến hành sắc ký với hỗn hợp chứa mẫu chuẩn imidacloprid và azoxystrobin
với nồng độ khoảng 50 ppm, tiến hành sắc ký 6 lần.
25

Tính phù hợp hệ thống được xác định dựa trên các thông số đặc trưng của sắc
ký như: diện tích peak (S), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ số đối xứng (AS), số
đĩa lý thuyết (N) là những thông số thường được dùng để đánh giá độ ổn định của hệ
thống khi tiêm lặp lại 6 lần. Yêu cầu:
- Số đĩa lý thuyết ≥ 2000.
- Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 1,0% và của diện tích peak phải ≤ 2,0% (với
phép thử định lượng). Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải có sự giải thích phù hợp.
- Hệ số đối xứng của peak chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ AS ≤ 1,5).
- Độ phân giải giữa peak chính và peak phụ phải lớn hơn 1,5 (RS ≥ 1,5).

Các thông số khác của píc phải đáp ứng yêu cầu chung của phương pháp HPLC
quy định trong Dược điển và quy định cụ thể trong quy trình phân tích thẩm định.

3.3.3.2. Tính đặc hiệu
 Khảo sát tính đặc hiệu trên mẫu chuẩn
Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích:

Mẫu trắng: dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu.



Mẫu chuẩn:dung dịch chứa chất chuẩn imidacloprid
dung dịch chứa chất chuẩn azoxystrobin
dung dịch chứa hỗn hợp hai chất chuẩn.
Yêu cầu:
- Sắc ký đồ hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin phải cho peak có thời gian
lưu tương ứng với thời gian lưu trên sắc ký đồ của riêng tưng chất chuẩn.
- Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện píc ở trong
khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng pic
phải ≤ 1,0%, so với đáp ứng của pic mẫu chuẩn.
Để quy trình định lượng có ý nghĩa trong ứng dụng thực tế ta nên thực hiện
khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu giả định.
 Khảo sát tính đặc hiệu trên mẫu giả định
Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích

Mẫu trắng:dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu.

Mẫu chuẩn: dung dịch chứa chất chuẩn imidacloprid
dung dịch chứa chất chuẩn azoxystrobin

dung dịch chứa hỗn hợp hai chất chuẩn.

Mẫu giả định: dịch chiết dược liệu (không có chất cần phân tích) đã được
cho thêm chất chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin

26


Ghi lại sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích; độ tinh
khiết của peak hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu giả định.


Yêu cầu:

- Sắc ký đồ trong dung dịch mẫu giả định cho peak có thời gian lưu khác nhau
không có ý nghĩa thống kê với peak của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. Trên
sắc ký đồ mẫu giả định: peak của các chất cần phân tích phải tách nhau hoàn toàn.

- Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện peak ở trong
khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng peak
phải ≤ 1,0%, so với đáp ứng của peak mẫu chuẩn.

- Peak của chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu giả định phải tinh khiết.
3.3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn
định lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng.
 Giới hạn phát hiện (LOD) là giá trị nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà
hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay
tín hiệu của đường nền.

 Giới hạn định lượng (LOQ) được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích
mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có nghĩa định lượng so
với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau:
- Pha loãng từ 5 - 7 lần mẫu chuẩn chứa hỗn hợp imdacloprid và azoxystrobin
nồng độ 10 ppm và chuẩn bị một mẫu trắng (chứa dung môi pha động).
- Tiêm vào thiết bị HPLC và ghi kết quả.

Sắc ký đồ nào thể hiện chiều cao peak khoảng gấp 3 lần đường nền thì nồng
độ của mẫu chuẩn đó chính là giới hạn phát hiện LOD của thiết bị.


Giới hạn định lượng được suy ra từ công thức: LOQ =
10
3 × LOD

3.3.3.4. Tính tuyến tính
Khoảng nồng độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích.
Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi
nồng độ của chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính.

- Khảo sát khoảng tuyến tính từ 20-160% của nồng độ đo. Tiến hành pha 5
dung dịch (ứng với 5 nồng độ 40%, 80%, 100%, 120%, 160%), thực hiện tiêm 3 lần
cho mỗi mẫu.
- Tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 3.3.2
27

- Ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích peak trung bình của mỗi mẫu. Dùng
phần mềm Microsoft Excel 2003 vẽ đồ thị biểu diễn và thiết lập phương trình hồi quy
của diện tích pic theo nồng độ.
Yêu cầu:
Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2
≥ 0,995). Trường hợp r < 0,997 phải
có sự giải thích phù hợp.
3.3.3.5. Độ chính xác
Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian.
 Độ lặp lại của phép đo
Đô ̣lăp̣ laịcủa hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng
một mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin (có nồng độ nằm trong khoảng
tuyến tính) vào hệ thống sắc ký với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 3.3.2.
Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối
(RSD) của diện tích peak sắc ký S peak và thời gian lưu tR.

Yêu cầu: Với phép thử định lượng: Giá trị RSD ≤ 2,0%. Các trường hợp giá
trị RSD trên 2%, cần phải có sự giải thích phù hợp.


 Độ chính xác trung gian

Tiến hành như độ lặp lại và làm trong 3 ngày khác nhau cùng với điều kiện và
người thực hiện.

Yêu cầu: Gía trị RSD từ 6 mẫu chuẩn trong một ngày và 6 mẫu chuẩn trong
ngày khác đều có RSD ≤ 2,0%.
3.3.3.6. Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %)
Thực hiện ở ba mức nồng độ 80%, 100% và 120% của nồng độ đo. Mỗi mức
pha ba dung dịch, mỗi dung dịch tiến hành sắc ký một lần. Tính diện tích peak và dựa
vào phương trình hồi quy suy ra nồng độ tìm thấy. So với nồng độ khi pha sẽ tính ra tỷ
lệ phục hồi. Xác định độ đúng của phương pháp theo công thức tính tỷ lệ phục hồi:
R%
M
M
Trong đó:
- Ms: Nồng độ khi pha (g/ml)
- Mt: Nồng độ tìm thấy
(g/ml) từ phương
Yêu cầu:

t 100
s trình hồi quy của đường tuyến tính
- Tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ: 98,0% – 102% cho quy trình phân tích định lượng.
28

- RSD tỷ lệ phục hồi ở mỗi mức nồng độ phải ≤ 2,0 % ở mỗi mức nồng độ
Trường hợp nằm ngoài khoảng này, phải có sự giải thích phù hợp.
3.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả
Theo lý thuyết sắc ký lỏng, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời
gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều cao
và diện tích peak sắc ký có liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất. Trong một vùng nồng
độ nhất định và không lớn, thì chúng ta có mối quan hệ tuyến tính như sau:
Hi = k1 . Ci = f(C) (1)
Si = k2 . Ci = f(C) (2)
Trong đó:
Hi và Si là chiều cao và diện tích của peak sắc ký của cấu tử i.
Ci là nồng độ của cấu tử i với thời gian lưu tRi.
k1, k2 là các hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký
cũng như bản chất pha tĩnh.
Dựa trên (1) và (2) ta có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo phương
pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn.
1 n
Giá trị trung bình: x  xi
n i1
n
 1  x 
x
2
Độ lệch chuẩn: SD i1
n1
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD%
s
.100
x

29

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
4.1.1. Chuẩn bị dung dịch
 Chuẩn bị dung môi pha mẫu
Các chất được khảo sát đều tan tốt trong acetonitril nên tôi lựa chọn dung môi
pha mẫu là acetonitril và đây cũng là thành phần chính trong pha động.
 Chuẩn bị dung dịch gốc và dung dịch mẫu chuẩn

Dung dịch mẫu chuẩn gốc:

- Cân chính xác lượng chất chuẩn tương ứng với 10 mg, cho vào bình định mức
25 ml. - Thêm khoảng 10 ml acetonitril, đánh siêu âm 10 phút, để nguội, thêm
acetonitril đến vạch, lắc kĩ. Làm đồng thời với cả hai chất chuẩn imidacloprid và
azoxystrobin. Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 400 ppm.
- Dung dịch này được pha loãng tới nồng độ thích hợp để khảo sát và xây dựng
dãy dung dịch chuẩn.
Dung dịch mẫu chuẩn đơn:
- Hút chính xác 6 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức dung tích 50
ml, thêm acetonitrile tới vạch và lắc kĩ.
- Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 µm trước khi đem chạy sắc ký.
Dung dịch chuẩn đơn này có nồng độ chất chuẩn 50 ppm.
- Làm đồng thời với imidacloprid và azoxystrobin.
- Hút 1 ml dung dịch chuân gốc imidacloprid và hút 5 ml dung dịch chuẩn gốc
azoxystrobin vào bình định mức dung tích 50 ml.
- Thêm acetonitril tới vạch và lắc kĩ.
- Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi đem chạy sắc ký. Dung dịch thu được là
hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin có nồng độ 50 ppm.
4.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký
Sau khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát theo mục 3.3.2, ta thu được kết quả
như sau:
4.1.2.1. Đặt bước sóng cho detector

Bước sóng λ của detector là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến độ nhạy của
phương pháp. Vì thế ta phải nghiên cứu, khảo sát sao cho tín hiệu của chất phân tích
tại bước sóng λ là tốt nhất. Tiến hành quét phổ ở nồng độ từ 200-400 nm có kết quả
như hình sau:
30

1.500
1.000 azoxystrobin
Abs.
imidacloprid
0.500
0.000
-0.500
200.00 250.00 300.00 350.00 400.00
nm.
Hình 4.1: Phổ hấp thụ của azoxystrobin và imidacloprid trong acetonitrile.
Từ hình 4.1 cho thấy azoxystrobin có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 207 nm,
imidacloprid có hấp thụ cực đại tại bước sóng 270 nm. Hai phổ này có độ hấp thu giao
nhau tại bước sóng 250 nm. Vì vậy tôi chọn bước sóng 250 nm để định lượng đồng
thời hai chất này.
4.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động
Để khảo sát thành phần pha động, tiến hành chạy chương trình sắc kí như mục
3.3.2 đã trình bày với sự thay đổi thành phần pha động. Dung dịch chất chuẩn hỗn hợp
của imidacloprid và azoxystrobin được pha loãng từ dung dịch gốc 400 ppm. Thành
phần dung môi pha động được chọn để khảo sát là acetonitril và nước với các tỉ lệ thể
tích khác nhau.
Tiến hành khảo sát thành phần pha động như mục 3.3.2.4. Kết quả được thể
hiện trong các hình như sau:

31

Hình 4.2. Sắc ký đồ ACN/ Nước (90%:10%).

32

Hình 4.4. Sắc ký đồ ACN/ Nước (85%:15%)

33

Dựa vào hình 4.2; 3.3; 4.4; 4.5; 4.6; 4.7, ta thấy rằng thành phần pha động ảnh
hưởng lớn đến thời gian lưu, hệ số lưu, hệ số tách và hệ số đối xứng của peak. Tỷ lệ
ACN càng lớn (80%-95%) thì hai chất không tách nhau, cả hai peak càng dính nhau,
pic không sắc nét, thời gian rửa giải lâu hơn. Ngược lại, tỷ lệ ACN càng thấp, hai peak
tách nhau rõ ràng, peak đẹp, cân đối, hiện tượng kéo đuôi giảm dần. Ngoài ra khi tỷ lệ

nước càng cao thì peak imidacloprid càng không đẹp, hệ số kéo đuôi tăng. Vì vậy ta
chọn thành phần pha động là hỗn hợp dung môi ACN và nước cất có tỷ lệ gần bằng
nhau (55%:45%) cho những nghiên cứu tiếp theo.
34

4.1.2.3 Khảo sát tốc độ dòng
Sự ảnh hưởng của tốc độ dòng đến quá trình sắc ký được khảo sát bằng cách
tiến hành chạy sắc kí hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin với các tốc độ khác nhau:
o 0,5 ml/phút.
o 0,8 ml/phút.
o 1 ml /phút o
1,2 ml/phút o
1,5 ml/phút
Các điều kiện còn lại của quá trình sắc kí không đổi, cụ thể như sau:
- Cột tách: RP – 18, 5µm, 250 x 4,6 mm.
- Nồng độ chất phân tích: 50 ppm
- Detector UV-Vis: 250 nm.
- Pha động: pha động đã khảo sát ở 3.3.2.4.
Tiến hành khảo sát theo mục 3.3.2.5. Theo kết quả được khảo sát qua các lần
tiêm ta thấy rằng, tốc độ dòng ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu, hệ số tách.
- Tốc độ dòng từ 0,6 – 0,8 ml/phút cho thấy thời gian lưu tăng dần, peak chưa
đẹp và không có sự cân đối, tách nhau hoàn toàn, hệ số tách giảm dần.
- Tốc độ dòng 1 ml/phút cho thấy thời gian lưu giảm dần, peak rõ đẹp, hai peak
tách nhau hoàn toàn, hệ số tách giảm dần, áp suất ổn định.
- Tốc độ dòng lớn (> 1 ml/phút) sẽ làm hao tốn dung môi và tăng áp suất cột
tách, nhưng tốc độ quá nhỏ sẽ kéo dài thời gian phân tích và làm doãng peak gây ra
hiện tượng kéo đuôi.

Dođó, ta chọn tốc độ dòng là 1 ml/phút để tiến hành định lượng
azoxystrobin và imidacloprid.
4.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI CHẤT
IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN
4.2.1. Thẩm định quy trình
4.2.1.1. Tính phù hơp hệ thống
Pha dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid nồng độ 50 ppm.
Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần.

35

Hình 4.8: Kết quả sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của imidacloprid
Số lần tiêm tR Speak (µAU x
As Rs imi K’ N
mẫu (phút) giây)
1 3,954 626144 1,140 0,941 0,00 39194,789
2 3,949 634100 1,126 0,955 0,00 39100,101
3 3,969 638942 1,138 0,967 0,00 39103,700
4 3,947 642210 1,156 0,942 0,00 38679,280
5 3,974 643648 1,162 0,951 0,00 39004,980
6 3,960 660550 1,128 0,960 0,00 38243,829
Trung bình 3,957 640932 1,142 0,953 0,00 38887,780
%RSD 0,309 1,797 1,282 0,011 0,00 0,933

SD 0,012 11517 0,015 0,0101 0,00 362,722
36

Bảng 4.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống azoxystrobin
Số lần tiêm
tR (phút)
Speak (µAU
As Rs azo K’ N
mẫu x giây)
1 12,058 1805578 1,013 2,012 2,056 76407,704
2 12,081 1814130 1,009 2,212 2,059 75540,833
3 12,165 1824734 1,007 2,411 2,065 75960,530
4 12,072 1832351 1,021 2,254 2,059 76049,748
5 12,215 1835474 1,014 2,211 2,074 76593,872
6 12,144 1828874 0,999 2,231 2,067 73276,171
Trung bình 12,122 1823524 1,010 1,889 2,063 75638,143
%RSD 0,513 0,631 0,731 21,12 0,315 1,605
SD 0,012 11498 0,0073 0,399 0.0065 1213,992
Kết quả ở hai bảng 4.1 và 4.2 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của thời
gian lưu (tR), diện tích peak (S), số đĩa lý thuyết đều không quá 2%, hệ số đối xứng
(AS) nằm trong khoảng 0,8-1,5, độ phân giải (RS) lớn hơn 1,5, nên khẳng định rằng hệ
thống có tính phù hợp, có thể tiếp tục tiến hành những bước đánh giá tiếp theo với điều
kiện sắc kí tương tự.

37

4.2.1.2 Tính đặc hiệu
Hình 4.9: Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với imidacloprid và azoxystrobin
Kết quả khảo sát khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn cho thấy:
- Sắc ký đồ pha động và dung môi pha mẫu không xuất hiện pic nào tại thời
gian lưu của imidacloprid và azoxystrobin trong trong sắc ký đồ của imidacloprid và
sắc ký đồ của azoxystrobin.
- Trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn của hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin:
Xuất hiện hai peak có thời gian lưu tương ứng với thời thời gian lưu của pic sắc ký đồ
riêng của imidacloprid và pic azoxystrobin. Ngoài peak imidacloprid và azoxystrobin
chỉ có 1 peak lạ có thời gian lưu ở 2,606 phút trong sắc kí đồ hỗn hợp chuẩn và sắc ký
đồ riêng từng chất imidacloprid và azoxystrobin giống như peak xuất hiện trong sắc ký
đồ mẫu trắng, chứng tỏ peak lạ này là của mẫu trắng. Peak imidacloprid và
azoxystrobin tách nhau hoàn toàn.
Kết quả khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu tự tạo cho thấy:

Đối với dung dịch chuẩn, trên sắc ký đồ xuất hiện hai peak imidacloprid và
azoxystrobin rõ rang ở tại thời gian lưu 3,959 phút và 12,210 phút.
- Đối với sắc ký đồ trên mẫu trắng, trên sắc ký đồ không có peak nào xuất hiện
38

tương ứng tại thời gian lưu của imidacloprid và azoxystrobin
- Đối với mẫu giả định, sắc ký đồ cho hai peak tương ứng với peak của
imidacloprid và azoxystrobin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn về thời gian lưu.
Từ kết quả trên, có thể khẳng định quy trình phân tích có tính đặc hiệu.
4.2.1.3. Xác định LOD và LOQ của thiết bị
Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn
định lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng.
Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: pha loãng từ 5 – 7
lần mẫu chuẩn chứa hỗn hợp imdacloprid và azoxystrobin nồng độ 10 ppm và chuẩn bị
một mẫu trắng (chứa dung môi pha động) Sau đó tiêm vào thiết bị HPLC. Đến khi nào
chiều cao peak = 3 lần chiều cao đường nền thì lấy đó là LOD
Hình 4.10: Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,048 ppm
Hình 4.11. Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,0048 ppm

Kết quả từ hình 4.10 và 4.11 cho thấy khi nồng độ azoxystrobin là 0,048 ppm
và imidacloprid là 0,0048 ppm thì chiều cao = 3 lần đường nền. Do đó:
- LOD của azoxystrobin là 0,048 ppm
39

- LOD của imidacloprid là 0,0048 ppm.
Từ đó suy ra:
10 10
- LOQ của azoxystrobin = 3 LOD = 3 x 0,048 = 0,16 ppm.
10 10
- LOQ của imidacloprid = 3 LOD = 3 x 0,0048 = 0,016 ppm.
4.2.1.4. Tính tuyến tính
Khoảng tuyến tính của imidacloprid và azoxystrobin được khảo sát bằng cách
pha một dãy dung dịch chuẩn khoảng từ 0,4-1,6 ppm có nồng độ tăng dần như sau: 0,4
ppm; 0,8 ppm; 1 ppm; 1,2 ppm; 1,6 ppm ứng với 40%, 80%, 100%, 120%, 160%. Tiến
hành pha dãy chuẩn như sau:
- Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin gốc có nồng
độ 2 ppm thành 50 ml có nồng độ 1,6 ppm: hút chính xác 40 ml dung dịch gốc cho vào
bình định mức 50 ml, định mức bằng acetonitril cho đến vạch.
- Pha dãy chuẩn từ dung dịch 1,6 ppm vừa thu được ở trên: hút chính xác Vx ml
cho vào bình định mức 10 ml và định mức bằng acetonitril. Cụ thể như sau:
Bảng 4.3: Cách pha loãng dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin
trước khi tiêm vào hệ thống HPLC
C(ppm) 0,4 0,8 1 1,2 1,6
Vx ml 2,5 5 6,25 7,5 10
Vacetonitrile Định mức đến vạch
Sau đó, tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã khảo sát với chương
trình sắc kí sau:
- Cột tách: RP – 18, 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5µm
- Pha động: kênh C: ACN 55%;
kênh D: Nước: 45%
- Tốc độ pha động: 1 ml/phút.
- Detector UV-Vis: λ = 250 nm.

Từ các giá trị diện tích pic S thu được, xây dựng phương trình hồi quy giữa diện
tích pic S và nồng độ C của mỗi dãy chuẩn.
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được chỉ ra trong bàng, bảng, hình và hình,
ghi giá trị và dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 xây dựng đường hồi quy.
40

Bảng 4.4. Diện tích peak ứng với từng nồng độ imidacloprid trong dãy
chuẩn Imidacloprid
C (ppm) Speak
0,4 81789
0,8 152152
1 226200
1,2 291980
1,6 368627
Bảng 4.5. Diện tích peak ứng với từng nồng độ azoxystrobin trong dãy chuẩn
azoxystrobin
C (ppm) Speak
0,4 185609
0,8 357070
1 506195
1,2 670685
1,6 870305

41

Hình 4.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của imidacloprid
Hình 4.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của azoxystrobin
Dựa vào kết quả khảo sát, ta có các phương trình hồi quy sau được biểu diễn
trong hình 4.12, 4.13 và Bảng 4.4 và 4.5.

42

Bảng 4.6. Phương trình hồi quy của azoxystrobin và imidacloprid
Chất phân tích Phương trình hồi quy
Hệ số tương Khoảng nồng độ
quan R2
tuyến tính (ppm)
imidacloprid Y=74105x R2
=0,9978 0,4-1,6
azoxystrobin Y=171865x R2
=0,997 0,4-1,6
Nhận xét: Qua các kết quả phân tích và thống kê ta thấy, tỷ lệ diện tích peak sắc
ký và nồng độ phụ thuộc tuyến tính với nhau một cách chặt chẽ với hệ số tương quan
cao đạt yêu cầu ở mục 3.3.3.4. Khoảng nồng độ tuyến tính rộng đối với cả hai chất
azoxystrobin và imidacloprid từ 0,4 – 1,6 ppm. Do đó, ta có thể sử dụng các phương
pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn để định lượng azoxystrobin và imidacloprid trong
mẫu thử ở khoảng tuyến tính đã khảo sát.
4.2.1.5. Độ chính xác
 Độ lặp lại của phép đo
Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp 6 lần cùng một
mẫu chuẩn hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid vào hệ thống HPLC với điều kiện tối
ưu ở mục 3.3.2. Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn
tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký Speak và thời gian lưu tR.
Bảng 4.7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu azoxystrobin
Thời gian lưu của azoxystrobin Diện tích peak của azoxystrobin
TT
Thời
Các thông số thống kê Diện tích Các thông số thống kê
gian lưu
1 12,081 Gía trị trung bình 6472807 Giá trị trung bình
2 12,077 Xtb=12,162 6535964 Xtb=6495348.67
3 12,132 Độ lệch chuẩn 6475974 Độ lệch chuẩn
4 12,167 SD=0,088 6419486 SD=60348.26

5 12,205 Độ lệch chuẩn tương đối 6475006 Độ lệch chuẩn tương đối
6 12,311 RSD(%)=0,72% 6592855 RSD(%)=0,92%
43

Xây Dựng Quy Trình Định Lượng Đồng Thời Imidacloprid Và Azoxystrobin Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao

Xây Dựng Quy Trình Định Lượng Đồng Thời Imidacloprid Và Azoxystrobin Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Xây Dựng Quy Trình Định Lượng Đồng Thời Imidacloprid Và Azoxystrobin Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao

Similar to Xây Dựng Quy Trình Định Lượng Đồng Thời Imidacloprid Và Azoxystrobin Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao (20)

More from Dịch Vụ Viết Thuê Đề Tài 0934.573.149 / Luanvantot.com

More from Dịch Vụ Viết Thuê Đề Tài 0934.573.149 / Luanvantot.com (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Xây Dựng Quy Trình Định Lượng Đồng Thời Imidacloprid Và Azoxystrobin Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao