8. 7
II.2 Phöông phaùp:
II.2.1 Nhaän dieän STEC (VTEC) baèng kyõ thuaät PCR:
a) Xöû lyù maãu:
Maãu phaân ñöôïc loïc nöôùc vaø xöû lyù vôùi phosphate-buffered saline (PBS)
vaø ñöôïc kieåm tra ñoä loaõng ñeå ñaûm baûo hoaït tính cuûa ñoäc toá coù taùc duïng treân
lôùp ñôn teá baøo Vero.
b) Quaù trình thöïc hieän:
™ Primers
Qua vieäc xaùc ñònh gen ñoäc löïc cuûa nhoùm STEC (gen stx), ngöôøi ta coù theå
nhaän dieän ñöôïc chuùng. Kyõ thuaät naøy söû duïng 2 caëp moài töông öùng khuyeách ñaïi
cho 2 gen VT-1 vaø VT-2:
) Theo baùo caùo cuûa Karam Ramotar vaø coäng söï naêm1995:
VT-1 Primer
GAAGAGTCCGTGGGATTACG
AGCGATGCAGCTATTAATAA
VT-2 Primer
TTAACCACACCCACGGCAGT
GCTCTGGATGCATCTCTGGT
Trong ñoù: VT-1 Primers duøng khuyeách ñaïi 130 caëp Nu (Töø Nu 1191 –
1320 cuûa gen VT-1)
VT-2 Primers duøng khuyeách ñaïi 346 caëp Nu (Töø Nu 426 – 771
cuûa gen VT-2)
9. 8
) Theo baùo caùo cuûa L. Mansouri-Najand vaø M. Khalili naêm 2007:
™ Vaät lieäu: Hoãn
hôïp thöïc hieän PCR chöùa:
- 5 μl Buffer
- 50 mM KCL
- 0,01 % gelatin
- 10 mM Tris-HCL (pH
8.3)
- 2,5 mM MgCl2
- 0,2 mM töøng loaïi dNTP
- 0,001 mM từng loại
Primers
- 1 μl ADN khuoân
- Phaûn öùng PCR baét ñaàu
vôùi 2.5 U Tag
polymerase
10. 9
™ Phaûn öùng:
- Khôûi ñaàu laø bieán tính ADN ôû 95o
C trong 5 phuùt
- 40 chu kì sau dieãn ra vôùi chu trình nhieät: 94o
C trong 1 phuùt, 55o
C trong 1
phuùt, 72o
C trong 1 phuùt
- Chu kì cuoái giöõ 72 o
C trong 7 phuùt
Saûn phaåm khuyeách ñaïi töø phaûn öùng PCR sau ñoù ñöôïc ñieän di treân gel Agarose
2% vaø ñöôïc nhuoäm vôùi Ethidium bromide.
11. 10
II.2.2 ÖÙng duïng kyõ thuaät PCR-RFLP trong chaån ñoaùn vi khuaån E.Coli
nhoùm STEC (Shiga-like toxin Escherichia coli):
Saûn phaåm khueách ñaïi cuûa phaûn öùng PCR coù theå ñöôïc söû duïng ñeå duøng
trong kyõ thuaät RFLP ñeå xaùc ñònh caùc chuûng trong nhoùm STEC. Kyõ thuaät RFLP
tieán haønh treân cô sôû söû duïng caùc enzyme caét khaùc nhau keát hôïp vôùi caùc trình
töï ADN ñöôïc caét cuõng khaùc nhau (trình töï ADN khaùc nhau laø saûn phaåm cuûa
phaûn öùng PCR tröôùc ñoù). Keát quaû laø thu nhaän ñöôïc saûn phaåm caét khaùc nhau
(mang tính ña hình). Vaø nhö vaäy cho pheùp phaân bieät ñöôïc caùc caù theå vôùi nhau.
Thoâng thöôøng trong kyõ thuaät PCR ñeå chaån ñoaùn vi khuaån nhoùm STEC
ngöôøi ta söû duïng caùc caëp moài xaùc ñònh gen stx1 vaø stx2, tuy nhieân ñeå chaån
ñoaùn moät soá vi khuaån ñaëc bieät thuoäc nhoùm STEC ngöôøi ta söû duïng theâm nhöõng
caëp moài cho pheùp xaùc ñònh caùc gen eae, stx2e … vaø caùc bieán theå cuûa chuùng.
Những dòng E. Coli được tìm thấy đều tạo độc tố verotoxin (VT) hoặc
Shiga-like toxin (SLT). Có 3 loại riêng biệt: VT-1 (SLT-1), VT-2 (SLT-2), và Vte
(là biến thể của VT-2: SLT-IIv). Dòng E. Coli O91:H21 được nghiên cứu là sản
xuất ra độc tố này. Sau khi giải trình tự và dòng hóa dòng vi khuẩn này, ta xác
định được 2 gen riêng biệt mã hóa cho 2 độc tố đặc tính tương tự như VT-2. Gen
thứ nhất gọi là vtx2ha mã hóa cho độc tố VT2v-a, gen thứ hai gọi là vtx2hb mã
hóa cho độc tố VT2v-b
12. 11
™ Caùch thöïc hieän: Chẩn đoán gen tiểu phần B biến thể của Verotoxin loại
2 (VT2v-b):
B1: Chọn dòng vi khuẩn trong bảng sau:
13. 12
B2: Thực hiện phản ứng PCR như trình bày ở trên thêm một số cặp mồi:
Trong ñoù: VT2-c & VT2-d laø primers ñaëc tröng cho VT2 vaø bieán theå VT2;
VT2v-1 & VT2v-2 laø primers ñaëc tröng cho bieát theå VT2
B3: Sử dụng Enzyme cắt giới hạn:
Ñoái vôùi chuûng O157 coù theå duøng caùc RE: XbaI, AvrII, SpeI.
14. 13
B4: Ñieän di:
Nhöõng trình töï ADN ñöôïc khuyeách ñaïi sau phaûn öùng PCR sau khi ñöôïc
caét bôûi enzyme caét giôùi haïn seõ taïo ra nhieàu trình töï ADN nhoû ñaëc tröng cho
töøng loaïi vaø ñöôïc xaùc ñònh qua phöông phaùp ñieän di gel agarose 2%.
RFLP cuûa saûn phaåm PCR chaån ñoaùn gen VT2 (stx2)
(A) Duøng enzyme caét HaeIII
(B) Duøng enzyme caét RsaI
(C) Duøng enzyme caét Nci
a: Thang chuaånI
b, c, d, e, f, g: caùc chuûng E.Coli
15. 14
B5: Nhuoäm baïc theo phöông phaùp cuûa Sambrook vaø coäng söï thu nhaän keát quaû.
™ Öu ñieåm cuûa kyõ thuaät PCR-RFLP:
- Do tính chaát chuyeân bieät raát cao cuûa enzyme caét neân kyõ thuaät naøy cho pheùp
xaùc ñònh söï töông ñoàng hoaëc khaùc bieät raát nhoû giöõa caùc doøng vi khuaån hoaëc
virus.
- Coù theå xaùc ñònh nguoàn goác caên beänh ôû caùc oå dòch khoâng chæ trong phaïm vi
moät vuøng maø caû toaøn theá giôùi.
- Coù theå keát hôïp vôùi kyõ thuaät lai trong chaån ñoaùn caùc taùc nhaân gaây beänh.
™ Khuyeát ñieåm:
- Kyõ thuaät naøy khoâng cho pheùp phaân bieät caùc chuûng vi sinh vaät neáu söï bieán ñoåi
gen cuûa chuùng xaûy ra ngoaøi vò trí caét ñaëc hieäu.
16. 15
III. KEÁT LUAÄN:
Chaån ñoaùn ñöôïc vi khuaån E.Coli nhoùm STEC baèng kyõ thuaät PCR-RFLP
thoâng qua gen ñoäc toá cuûa töøng chuûng.
Xaùc ñònh ñöôïc caùc bieán theå ñoäc toá cuûa vi khuaån nhoùm STEC
17. 16
IV. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO
Coâng ngheä Sinh hoïc trong thuù y
(Nguyeãn Ngoïc Haûi)
Giaùo trình Vi sinh vaät hoïc moâi tröôøng
(Traàn Caåm Vaân)
Identification of Verotoxin Type 2 Variant B Subunit gens in E.Coli by
PCR and RFLP
(S.D Styler vaø coäng söï - Taäp 29, soá 7)
Direct Detection of Verotoxin-Producing Escherichia coli in Stool Samples
by PCR
(KaRam Ramotar vaø coäng söï – Taäp 33, soá 3)
Typing of Bovine Attaching and Effacing Escherichia coli by Multiplex in
vitro amplification of Virulence-Associated genes
(Bernard China et al – Taäp 62, soá 9)
http://www.scribd.com/doc/17465542/Phan-loi-vi-sinh-bng-Sinh-Hc-Phan-T
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
18. 17
I. ÑAËT VAÁN ÑEÀ
II. TOÅNG QUAN
II.1 Tröïc khuaån Escherichia coli E. Coli ...................................................3
II.1.1 Ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa E. Coli.......................................................4
II.1.2 Khaû naêng gaây beänh........................................................................5
II.1.3 Caùc phöông phaùp chaån ñoaùn E. Coli..............................................6
II.2 Phöông phaùp.........................................................................................7
II.2.1 Nhaän dieän STEC (VTEC) baèng kyõ thuaät PCR...............................8
II.2.2 ÖÙng duïng kyõ thuaät PCR-RFLP trong chaån ñoaùn vi khuaån E.Coli
nhoùm STEC (Shiga-like toxin Escherichia coli)....................................11
III. KEÁT LUAÄN
IV. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO