Phản ứng kháng nguyên kháng thể Vi Sinh VMU ĐH Y Khoa Vinh

KỸ THUẬT MIỄN DỊCH
SỬ DỤNG TRONG CHẨN
ĐOÁN VI SINH VẬT

- Sự kết hợp giữa KN và KT phụ thuộc
vào cấu trúc bề mặt của KN và KT.
- Cấu trúc không gian càng phù hợp thì
liên kết càng cao
I. BẢN CHẤT CỦA SỰ KẾT HỢP GIỮA
KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ
Ái lực cao Ái lực thấp Không có ái lực

- Xảy ra giữa
một phần rất
giới hạn giữa:
• phân tử KN
(nhóm quyết
định)
• phân tử KT
(trung tâm hoạt
động).

Theo Pauling:
- KN đa hóa trị
KN + KT  phức hợp hình mạng lưới trong
không gian ba chiều (kích
thước rất lớn)
kết tủa
- phân tử KT thường hóa trị hai
ngưng kết

- phản ứng rõ rệt nhất lúc số phân tử
KN tương đương với số phân tử KT.
KN và KT có thể kết hợp với nhau theo
bất cứ tỷ lệ nào nhưng:
- phản ứng yếu đi nếu thừa hoặc
thiếu KN hoặc KT

Sự kết hợp giữa phân tử KN và KT xảy ra nhờ
các lực:
•lực liên kết ion
(lực tĩnh điện
Coulomb) giữa
các nguyên tử
hoặc các nhóm
hoá học mang
điện trái dấu, ví
dụ giữa NH3+
và COO-,

• lực liên kết của các cầu nối hydro giữa
các nguyên tử hydro mang điện tích
dương với các nguyên tử mang điện tích
âm

•lực Van der
Walls (lực
hấp dẫn liên
phân tử)
giữa hai
phân tử phụ
thuộc vào
tương tác
giữa các lớp
mây điện tử
ở mặt ngoài

2. MỤC ĐÍCH SỬ DỤNG CÁC PHẢN ỨNG KN-KT
2.1. Chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng
- Chẩn đoán trực tiếp: xác định tên vi sinh
vật bằng kháng huyết thanh mẫu (chứa
loại KT đã biết) →phát hiện trực tiếp KN
VSV trong bệnh phẩm.
- Chẩn đoán gián tiếp: dùng KN mẫu (đã
biết tên) để phát hiện KT đặc hiệu trong
các dịch của cơ thể, thường là trong huyết
thanh (HT), nên còn gọi là phản ứng HT
học.

2. MỤC ĐÍCH SỬ DỤNG CÁC PHẢN ỨNG KN-KT
2.2. Nghiên cứu dịch tễ học bệnh nhiễm trùng
2.3. Định loại vi sinh vật
2.4. Nghiên cứu sự đáp ứng của cơ thể đối
với KN VSV
- Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vacxin.
- Xác định hiệu đáp ứng miễn dịch bảo vệ.

3. PHẢN ỨNG KẾT HỢP KN-KT
Căn cứ cách nhân định kết quả chia làm 3
nhóm:
- Các phản ứng tạo thành hạt: phản ứng
ngưng kết, phản ứng kết tủa
- Các phản ứng dựa vào hoạt động sinh
học của kháng thể: phản ứng trung hòa,
kết hợp bổ thể
- Các phản ứng dùng KN-KT đánh dấu:
MDHQ, MD phóng xạ, ELISA, MD sắc ký

PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT
1. Nguyên lý: là phản ứng kết hợp giữa
KN hữu hình (tế bào hoặc tầm vóc tế
bào) và KT đặc hiệu tạo thành phức hợp
KN-KT dưới dạng hạt ngưng kết có thể
quan sát được bằng mắt thường
2. Điều kiện hình thành hạt ngưng kết
Ngoài tính đặc hiệu giưa KN và KT, phải
có thêm 2 điều kiện:
+ KN và KT đa giá (có nhiều vị trí kết
hợp)
+ KN và KT có nồng độ tương đương

KN
KT
Thừa KN KN và KT tương đương Thừa KT

3.Các loại phản ứng ngưng kết
• Ngưng kết trực tiếp (NK chủ động):
KN ngưng kết trực tiếp với KT đặc hiệu tạo
thành mạng lưới ngưng kết
Vi khuẩn
KT

- Phản ứng ngưng kết trực tiếp trên phiến
kính:
Trên phiến kính sạch:
Dùng que cấy lấy VK cần xác định hòa riêng
biệt vào 2 giọt đó. Sau 30”-1’ đọc kết quả
Huyết thanh (KT mẫu)
NaCl 0,9%
(+) (-) (±)

- Phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm
+ Huyết thanh được pha với nồng độ giảm dần.
+ Cho thêm vào một lượng nhất định KN đã biết
tên
+ Phản ứng dương tính khi có các hạt ngưng
kết lắng xuống đáy ống nghiệm
+ Ví dụ: phản ứng Widal

• Ngưng kết gián tiếp:
KN hòa tan được gắn lên nền mượn hữu
hình (hồng cầu, hạt latex) khi gặp KT đặc
hiệu xảy ra phản ứng ngưng kết trên nền
mượn đó
Nền mượn
KN
KT

Phản ứng TPHA:
KN giang mai được gắn lên hồng cầu
(cừu, ngỗng, gà…)

Phản ứng SFD:
KN HIV được gắn trên hạt Gelatin
KN HIV g¾n
trªn h¹t gelatin
KT kh¸ng HIV
(huyÕt thanh BN)
T¹o thµnh m¹ng líi
ngng kÕt
HIV-1: gp41, p24
HIV-2: gp36

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
AA
BB
CC
DD
EE
FF
GG
HH
Ph¶n øng ngưng kết hạt SFD

- Phản ứng kết tủa là sự kết hợp giữa
kháng nguyên hòa tan (KN ở tầm phân tử)
lúc gặp kháng thể tương ứng, tạo thành tủa
có thể quan sát trực tiếp bằng mắt thường
hoặc nhờ soi kính lúp.
1. Nguyên lý
PHẢN ỨNG KẾT TỦA
- Phản ứng có thể thực hiện ở môi trường
lỏng hoặc môi trường gel.

2. Các loại phản ứng
• Phản ứng kết tủa trong môi trường lỏng
Khi dung dịch KN và
dung dịch KT được
trộn với nhau theo
một tỷ lệ thích hợp,
phức hợp KN-KT sẽ
được hình thành
dưới dạng những
hạt kết tủa

Lượng KN thêm vào
Lượng tủa thu được
Đường biểu diễn các vùng tương tác giữa KN và KT
a: quá ít KN, b: KN và KT tương đương, c: thừa KN
Lượng tủa phụ thuộc vào số lượng tuyệtLượng tủa phụ thuộc vào số lượng tuyệt
đối của KN, KT và mối tương quan vềđối của KN, KT và mối tương quan về
lượng giữa KN, KT.lượng giữa KN, KT.
cba

Phản ứng RPR:
KN là chất cardiolipin lấy từ tim bò có cấu
trúc giống chất lipoid của VK giang mai
-Phản ứng âm
tính: đám đen
mịn tập trung ở
giữa vòng tròn
hoặc màu xám
đồng nhất.
-Phản ứng dương tính: hạt kết tủa màu đen
ở rìa vòng tròn phản ứng hoặc khắp mặt
vòng tròn.

• Phản ứng kết tủa trong gel thạch
- Kỹ thuật khuếch tán đơn: chỉ có KN hoặc
KT khuếch tán trong thạch
+ Khuếch tán trong ống nghiệm (Oudin)
Cho thạch đã hòa đều KT vào đoạn
dưới ống nghiệm rồi cho dung dịch KN lên
trên. KN sẽ khuếch tán xuống thạch. Càng
xuống sâu, nồng độ KN càng thấp. Tại
vùng KN và KT tương đương sẽ xuất hiện
đường tủa

+ Khuếch tán trên phiến kính hoặc đĩa Petri
(Mancini)
Phủ một lớp mỏng thạch đã hòa đều
KT lên phiến kính hoặc cho vào đĩa Petri.
Khi thạch đông, đục các lỗ đựng KN theo
nồng độ giảm dần. Quanh các lỗ sẽ xuất
hiện vòng kết tủa tại nơi lượng KN và KT
tương đương. Nồng độ KN càng cao,
vòng càng rộng

KN
KT hòa đều
Đường tủa
Vòng tủa
KN

- Kỹ thuật khuếch tán kép: cả KN và KT đều
khuếch tán trong thạch
+ Khuếch tán trong ống nghiệm
Trong ống nghiệm, giữa KN và KT có
một lớp gel thạch. Cả KN và KT đều
khuếch tán vào lớp gel này. Tại vùng KN,
KT tương đương sẽ xuất hiện đường tủa
+ Khuếch tán trên phiến kính hoặc đĩa
Petri (Ouchterlony)
Phủ một lớp thạch mỏng lên phiến
kính hoặc đĩa petri. Sau khi thạch đông,

đục 2 lỗ, 1 lỗ đựng KN và một lỗ đựng KT.
KN và KT sẽ khuếch tán ra xung quanh.
Nơi KN, KT gặp nhau với nồng độ tương
đương sẽ tạo thành đường tủa.
KN
KT
Đường
tủa

PHẢN ỨNG TRUNG HÒA
1. Nguyên lý
KT đặc hiệu có khả năng trung hòa độc
tố, độc lực của VSV hoặc làm mất đi một
tính chất nào đó của VSV hoặc sản
phẩm của nó
2. Các loại phản ứng
1) Phản ứng trung hòa in vitro (trên dụng
cụ thí nghiệm):
Phản ứng ASLO, ngăn ngưng kết hồng
cầu, trung hòa virus

Phản ứng ASLO:
Chẩn đoán thấp tim do Liên cầu A
KN Steptolysin O (SLO) + Hồng cầu
→tan HC
Cho huyết thanh bệnh nhân (nghi ngờ có
KT chống lại Streptplysin O
(Antistreptolysin O (ASLO)) + SLO, ủ
370
C/30ph. Sau đó cho thêm hỗn dịch hồng
cầu, ủ 370
C/45ph.
Nếu HC tan: không có KT ASLO
Nếu HC không tan: có KT ASLO đã trung
hòa KN SLO, làm mất khả năng gây tan
hồng cầu của KN này

Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu
Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu chẩn
đoán virus (cúm, sởi, Dengue…).
Nguyên lý:
Virus + HC → HC bị ngưng kết
(Virus + KT mẫu) + HC
Nếu HC bị ngưng kết, virus không cùng
tên với KT mẫu.
Nếu HC không bị ngưng kết, virus cùng
tên với KT mẫu.

Phản ứng ngưng kết hồng cầu

Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu
phát hiện KT

2) Phản ứng trung hoà invivo:
SAD
VK nghi ngờ bạch hầu???
NaCl 0,9%
Chuột sống
Chuột chết
VK bạch hầu
Phản ứng trung hoà trên chuột lang xác
định ngoại độc tố bạch hầu

Phản ứng Schick
•Xác định tình trạng cảm nhiễm bạch hầu
•Tiêm vào trong da độc tố bạch hầu:
Phản ứng (+): nơi tiêm nổi quầng đỏ ≥
10mm → cơ thể chưa có KT kháng bạch
hầu
Phản ứng (-):
nơi tiêm không nổi
quầng đỏ hoặc
quầng đỏ < 10mm
→ cơ thể có KT
kháng bạch hầu Schick (+)

PHẢN ỨNG KẾT HỢP BỔ THỂ
• Nguyên lý:
Kháng thể đặc hiệu với sự tham gia của
bổ thể gây ly giải tế bào
• Các thành phần của phản ứng:
- Hệ thống phản ứng:
+ KN đã biết và được chuẩn độ
+ Huyết thanh bệnh nhân (KT?)
- Hệ thống phát hiện:
+ Hồng cầu cừu (HC)
+ Kháng thể kháng hồng cầu cừu (KHC)

- Bổ thể (C’): được chuẩn độ trước và hoạt
động tự do, có thể tham gia vào hệ thống
phản ứng hoặc hệ thống phát hiện. Nếu
tham gia vào hệ thống phát hiện:
C’+HC+KHC → tan HC
• Tiến hành phản ứng:
- Bước 1: Cho KN, huyết thanh cần xét
nghiệm và bổ thể ủ 370
C/30 phút
- Bước 2: Cho thêm HC + KHC vào hỗn
hợp trên, ủ 370
C/30 phút.

• Kết quả:
- HC không tan chứng tỏ bổ thể đã được
sử dụng ở bước 1 → huyết thanh bệnh
nhân có KT đặc hiệu với KN → Phản ứng
(+)
- HC tan chứng tỏ huyết thanh bệnh nhân
không có KT đặc hiệu với KN và bổ thể
hoạt động ở hệ thống phát hiện làm tan
HC → Phản ứng(-)

Âm tính: Hồng cầu
tan thành dung
dịch đỏ đều
Dương tính: Hồng
cầu lắng xuống
thành một chấm
nhỏ
KT (-)
KHC HCKN KT BT
a. trong huyết thanh có KT, b: trong huyết thanh không có kháng thể
a
b

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH
HUỲNH QUANG
Chất đánh dấu là
chất màu huỳnh
quang. Phức hợp
KN-KT-HQ được
phát hiện dưới
kính hiển vi huỳnh
quang.

1. Phản ứng MDHQ trực tiếp
Dùng KT gắn huỳnh quang (HQ) phát hiện KN
• Nguyên lý:
KN được phát hiện nhờ KT mẫu gắn HQ
• Các bước tiến hành:
Soi KHV HQ
ủ 30’, rửa
KT-HQ
KN KN

2. Phản ứng MDHQ gián tiếp
Dùng kháng kháng thể (KKT) gắn chất
màu HQ để phát hiện KT.
• Nguyên lý:
KT được phát hiện nhờ KN mẫu và KKT
mẫu gắn HQ.
Soi kính hiển vi
huỳnh quang
KTKN
KKT-HQ
ủ, rửa
ủ, rửa

KTMDHQ trực tiếp, gián tiếp , sandwich

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH
PHÓNG XẠ
1. Nguyên lý:
KT được gắn chất đồng vị phóng xạ khi
gặp KN tương ứng tạo thành phức hợp
miễn dịch được phát hiện do chất phóng
xạ phát ra các tia xạ, đọc trên máy đếm
phóng xạ.
2. Các phản ứng:

Định lượng MDPX một KN
• Nguyên tắc: dùng KT đã biết gắn chất
đồng vị phóng xạ để phát hiện KN.
• Tiến hành:
- Ủ KT đã biết vào các giếng của tấm thử
- Cho dịch cần tìm KN vào các giếng của
tấm thử, ủ, rửa tấm thử
- Cho KT đặc hiệu đã biết gắn chất phóng
xạ I125
, ủ, rửa tấm thử.
- Đếm độ phóng xạ đo ở các giếng. Mức
phóng xạ tỷ lệ thuận với nồng độ KN

Định lượng phóng xạ một KT
• Nguyên tắc: dùng KKT gắn chất đồng vị
phát hiện KT
• Cách tiến hành:
- Cố định KN đã biết vào các giếng của
tấm thử.
- Cho dịch cần tìm KT vào tấm thử, ủ, rửa
tấm thử.
- Cho KKT đã biết và đã gắn chất đồng vị
phóng xạ.
- Đếm độ phóng xạ đo ở các giếng. Mức
phóng xạ tỷ lệ thuận với nồng độ KT.

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH ENZYM
(ELISA)
1. Nguyên lý:
Phức hợp miễn dịch KN-KT được phát
hiện nhờ enzym gắn trên KT hoặc kháng
kháng thể tác động lên cơ chất đặc hiệu
làm thay đổi màu cơ chất, được đọc
bằng máy quang kế đo mật độ quang
học (OD).
2. Các loại phản ứng:

ELISA gián tiếp
• Phát hiện KT
• KT trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu
với KN đã được cố định sẵn trên các giếng
của phiến nhựa. Phức hợp KN-KT này
được nhận biết bởi kháng kháng thể người
gắn enzym và sẽ cho phản ứng màu với cơ
chất. Giá trị mật độ quang của phản ứng
màu (OD) tỷ lệ thuận với lượng KT có trong
mẫu thử.

• Các bước tiến hành
Đọc kết quảKN
KT
KKT-E
Cơ
chất
Ủ, rửa Ủ, rửa Ủ
KN HIVKN KT (bÖnh nh©n) Kh¸ng KT người
g¾n E
KN-KT-KKT-E (ph¶n øng ®æi mµu
c¬ chÊt)

ELISA cạnh tranh
• Phát hiện KT
• Nguyên tắc của kỹ thuật dựa trên sự cạnh
tranh của KT có trong huyết thanh bệnh
nhân và KT mẫu đã gắn enzym để được
gắn lên các KN đã cố định trên giếng. Giá
trị mật độ quang (OD) tỷ lệ nghịch với
lượng KT có trong mẫu thử.

- KN đã được gắn lên giếng của phiến
nhựa
- Huyết thanh bệnh nhân (chứa KT cần tìm)
được cho cùng KT mẫu có gắn enzym rồi
đem ủ.
- Đọc kết quả.
KN KT trong huyÕt thanh BN
vµ KT gắn enzym c¹nh
tranh víi nhau
KN-KT, KN-KT-E.
KN-KT-E ph¶n øng
®æi mµu c¬ chÊt

ELISA Sandwich
• Phát hiện KN hoặc KT.
• Phát hiện KN: KN có trong mẫu thử sẽ kết
hợp đặc hiệu với KT đặc hiệu gắn sẵn
trong các giếng của phiến nhựa. Phức
hợp này được phát hiện bởi KT mẫu có
gắn enzym cho phản ứng màu với cơ
chất. Giá trị OD tỷ lệ thuận với lượng KN
có trong mẫu thử.

k n h iv k t k h ¸ n g
h iv (bn )
k n vir us
g ¾n enzy m
k n - k t - KN_en zy m
(ph ¶n øn g ®æi mµu)
ph ¶n øng el is a s and w ic h
KN KT (huyÕt thanh bn) KN g¾n enzym KN-KT-KN-E ph¶n øng ®æi mµu c¬
chÊt
• Phát hiện KT: KT trong mẫu thử sẽ kết
hợp đặc hiệu với KN cố định trên giếng và
được phát hiện bởi KN gắn enzym. Giá trị
OD tỷ lệ thuận với lượng KT có trong mẫu
thử.

KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH
• Nguyên lý:
- KKTgắn chất màu được phân bố đều trên
bản giấy sắc ký
- KN của vi sinh vật được gắn cố định tại
“vạch phản ứng”
- Khi nhỏ huyết thanh lên bản sắc ký, KT đặc
hiệu (nếu có) sẽ kết hợp với KKT gắn màu,
- Phức hợp KT-KKT gắn màu di chuyển trên
giấy sắc ký sẽ bị giữ lại tại “vạch phản ứng”

KN
KKT gắn màu
KT (bệnh nhân)
do KT kết hợp với KN  “vạch phản ứng”
hiện màu.
- Nếu trong huyết thanh không có KT đặc
hiệu, ở “vạch phản ứng” KN không thể giữ
được KKT gắn màu, vì vậy không hiện
màu.

D-¬ng tÝnh ¢m tÝnh Kh«ng Kh«ng
gi¸ trÞ gi¸ trÞ
ViÕt m· sè BN
Tªn XN
M· sè XN
Vïng ®äc v¹ch chøng
Vïng ®äc KQ
Vïng nhá mÉu thö
Test Determine HIV - 1/2

4. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG KẾT
HỢP KN-KT
• Định tính:
Kết quả định tính cho biết trong mẫu xét
nghiệm có hay không KN hoặc KT cần
tìm.
• Định lượng:
Kết quả định lượng trong chẩn đoán huyết
thanh cho biết hiệu giá kháng thể. Nồng
độ kháng thể trong huyết thanh cao hay
thấp được đánh giá qua hiệu giá kháng
thể.

Hiệu giá KT (titer): là nồng độ huyết thanh
pha loãng nhất mà phản ứng còn dương
tính.
Động lực KT: là đại lượng đặc trưng cho
mức độ thay đổi hiệu giá KT theo thời
gian, được tính bằng thương số giữa hiệu
giá KT lần thứ 2 và lần thứ nhất. Động lực
KT thường ≥ 4 mới có giá trị chẩn đoán.

• Dương tính giả:
•
⇒

Phản ứng kháng nguyên kháng thể Vi Sinh VMU ĐH Y Khoa Vinh

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Phản ứng kháng nguyên kháng thể Vi Sinh VMU ĐH Y Khoa Vinh

Similar to Phản ứng kháng nguyên kháng thể Vi Sinh VMU ĐH Y Khoa Vinh (20)

More from TBFTTH

More from TBFTTH (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Phản ứng kháng nguyên kháng thể Vi Sinh VMU ĐH Y Khoa Vinh