Genus Bacillus

PENDAHULUAN :
GENUS BACILLUS
Bab 1
1. Genus Bacillus
Pada tahun 1872, Ferdinand Cohn, menggolongkan bakteri Bacillus subtilis. Organisme ini
termasuk Gram-positif, yang mampu tumbuh dengan adanya oksigen, dan mampu membentuk
jenis yang unik dari sel resisten yang disebut endospora, mewakili anggota pertama dari apa yang
menjadi genus besar dan beragam dari bakteri yang disebut Bacillus, dalam Famili Bacillaceae.
Mana-mana dan keragaman bakteri ini, perlawanan endospora mereka untuk kimia dan agen fisik,
siklus perkembangan pembentukan endospora, kemampuan untuk memproduksi antibiotik,
toksisitas spora dan kristal protein bagi banyak serangga, telah menarik minat berlangsung sejak
mereka penemuan pada 1870-an (Kennet Todar, 2009).
1.1 Klasifikasi dan Filogeni
Heterogenitas dalam ekologi, fisiologi, dan genetika dari spesies Bacillus dibuat sulit untuk
mengkategorikan genus Bacillus. Konsep modern dari genus Bacillus dapat berasal sebagian besar
karya Nathan R. Smith, Francis E. Clark, dan Ruth E. Gordon, dalam tahun 1930-an kelompok ini
ilmuwan, mengembangkan definisi genus Bacillus yang merupakan "bakteri berbentuk batang
mampu membentuk endospora aerobik refractile yang lebih tahan dari sel vegetatif terhadap
panas, pengeringan, dan lembaga lainnya yang merusak agen". Upaya pertama untuk
mengklasifikasikan spesies Bacillus didasarkan pada dua karakteristik utama: pertumbuhan
aerobik dan pembentukan endospora. Hal ini mengakibatkan pengelompokan banyak bakteri
yang memiliki fisiologi yang berbeda dan menduduki berbagai habitat. Dalam Manual Bergey
tentang Bakteriologi Sistematik (1st ed. 1986), Bab G+C dari spesies yang diketahui pada Bacillus
dilaporkan berkisar dari 32-69% (Holt, 1986), menggambarkan heterogenitas genom dari genus.
Ada variasi dari spesies ke spesies, tapi kadang-kadang dapat diamati perbedaan yang mendalam

dalam Bab G+C dalam strain dari spesies yang sama. Filogenetik klasifikasi dilaporkan dalam
Manual Bergey tentang Bakteriologi Sistematik (2nd ed 2004.) Kelompok dua jenis yang paling
menonjol dari bakteri endospora pembentuk, clostridia dan basil, dalam dua Kelas yang berbeda
Firmicutes: Clostridia dan Basil. Bukti filogenetik, terutama didasarkan pada analisis RNA dari
subunit kecil ribosom (16S rDNA) menunjukkan bahwa spesies Bacillus menunjukkan
kekerabatan dengan beberapa bakteri non-pembentuk spora seperti Enterococcus, Lactobacillus,
Listeria dan Staphylococcus. Dengan munculnya analisis ssRNA, genus Bacillus, dibagi menjadi
beberapa keluarga endospora pembentuk saat ini ditugaskan untuk empat genera di Famili
Bacillaceae. Dalam Famili ini, genus Bacillus, yang membedakan dengan ketat anaerobik
Clostridium spp karena kemampuannya untuk tumbuh di paparan udara. Banyak spesies Bacillus
dapat dialokasikan ke salah satu dari enam taksa yang memiliki perbedaan fisiologi. Hal ini
umumnya konsisten dengan Devisi dari genus berdasarkan morfologi spora. Keenam kelompok
tersebut adalah:
B. polymyxa kelompok (I),
B. subtilis kelompok (II),
B. brevis kelompok (III),
B. sphaericus kelompok (IV), dan
Thermophiles (V dan VI).
Kelompok I mencakup spesies yang anaerob fakultatif dan dapat tumbuh kuat dalam ketiadaan
oksigen. Berbagai gula difermentasi untuk menghasilkan asam, dan endospora yang ellipsoidal.
Spesies dimiliki oleh kelompok B. subtilis, yang filogenetis dan phenotypically-nya konsisten.
Semua bakteri ini menghasilkan asam dari berbagai gula dan beberapa strain, seperti B. cereus dan
B. licheniformis, adalah anaerob fakultatif. B. licheniformis dapat menggunakan glukosa hanya
dalam kondisi anaerobik tetapi tumbuh buruk anaerob. Meskipun B. subtilis umumnya dianggap
sebagai aerob, dapat tumbuh dan bersporulasi perlahan juga dalam kondisi anaerobik. Ketika
glukosa, dengan nitrit adalah akseptor elektron terminal, tumbuh sangat anaerob. Bakteri ini
karena itu merupakan tahap peralihan antara anaerob fakultatif sejati saya strain kelompok dan
aerob ketat dalam kelompok III dan IV. Hal ini tercermin dalam produksi asam dari beberapa
gula (Leuschner, Bacillus-. Laboratorium Ilmu Tengah, York, UK 2008). Para endospora oval
yang dihasilkan oleh bakteri ini tidak membengkak sel induk dan umumnya terletak terpusat atau
subterminally.
Kelompok III merupakan aerob ketat yang umumnya tidak memproduksi asam dari gula. Mereka
menghasilkan spora ellipsoidal yang membengkak sel induk.
Pada kelompok IV semua spesies menghasilkan spora bulat yang dapat membengkak sel induk
dan mengandung l-lisin atau ornithine dalam dinding sel. Semua spesies secara ketat aerobik,
tetapi beberapa memiliki kemampuan terbatas untuk memproduksi asam dari gula. Spesies
termofilik dari Grup V yang heterogen fisiologis dan morfologis, dan tumbuh optimal pada> 50 °
C. Sebagian besar menghasilkan spora oval yang membengkak sel induk. Pada kelompok VI
adalah spesies termofilik dan acidophilic yang membran dicirikan oleh adanya asam lemak omega-
alisiklik.

2. Sifat umum basil
2.1 Struktur Permukaan Bacillus
Seperti banyak bakteri gram positif, sifat-sifat adhesi, ketahanan dan tanggapan taktis, membuat
permukaan spesies Bacillus agak rumit.
Fig.1 Bacillus surface. C=capsule, S=S-layer, P=peptidoglycan (from Kenneth Todar PhD.2009 University
of Wisconsin-Madison).
Permukaan sel vegetatif adalah struktur laminasi yang terdiri dari kapsul, sebuah protein S-layer,
beberapa lembaga-lapisan peptidoglikan, dan protein yang terletak pada permukaan luar dari
membran plasma.
2.1.1 lapisan-S
Lapisan-S termasuk dalam lapisan permukaan kristal protein atau glikoprotein subunit. Mereka
dapat ditemukan di Bacillus, seperti pada bakteri lain tetapi fungsi mereka tidak sepenuhnya
dipahami. Karena menutupi permukaan seluruh sel, ada kemungkinan bahwa ia dapat bertindak
sebagai saringan molekuler, mencegah molekul besar dari memasuki atau meninggalkan sel. Peran
lain yang telah dianggap berasal dari bakteri lapisan-S termasuk perlindungan dari sel dari predasi
dan penyediaan situs pelekatan exoenzymes. Baru-baru ini menunjukkan bahwa dalam beberapa
bakteri Gram-positif lapisan-S dapat menutupi muatan negatif dari lembar peptidoglikan dan
mencegah proses aglutinasi.
2.1.2 Kapsul
Spesies Bacillus dapat menghasilkan berbagai jenis kapsul: termasuk diantaranya B. anthracis, B.
subtilis, B. megaterium, dan B. licheniformis, mengandung poli-D-atau asam L-glutamat. B.
circulans, B. megaterium, B. mycoides dan B. pumilus, menghasilkan kapsul karbohidrat, atau
dengan polisakarida yang lebih kompleks. Beberapa polisakarida yang dihasilkan oleh Bacillus
dapat bereaksi dengan antisera genera lain dari bakteri, termasuk patogen manusia: adalah kasus
B. mycoides dengan Streptococcus pneumoniae atau B. pumilus dengan Neisseria meningitides.
Kapsul ini sangat penting untuk menentukan virulensi di B. anthrax: karena tidak diproduksi oleh
B. cereus dan B. thuringiensis terdekat, yang dapat digunakan sebagai kriteria untuk membedakan
antara spesies ini.

2.1.3 Dinding Sel
Genus Bacillus tidak hadir banyak variasi dalam struktur dinding sel yang terjadi dalam banyak
bakteri Gram-positif. Dinding semua spesies Bacillus terdiri dari peptidoglikan dari asam
mesodiaminopilmelic (DAP) (Weiss et al.1981). Jenis polimer adalah tipe yang sama seperti yang
universal ditemukan pada bakteri gram negatif. DAP dapat langsung cross-linked untuk D-alanin,
seperti pada Enterobacteriaceae, dalam kasus lain, seperti di sebagian besar bakteri Gram-positif,
dua rantai samping tetrapeptide peptidoglikan menghubungkan DAP dan D-alanin, jembatan yang
interpeptide. Kehadiran asam teichoic dibatasi untuk residu asam muramic telah dilaporkan dalam
jumlah besar untuk semua spesies. Namun, jenis asam teichoic bervariasi antara spesies Bacillus.
Seperti di banyak bakteri Gram-positif spesies Bacillus hadir asam lipoteikoat terkait dengan
membran sel, yang tampaknya terlibat dalam sintesis asam teichoic dalam dinding sel.
Fig.2 Schematic representation of muropeptide subunit of Bacillus peptidoglycan, without intrapeptide
bridge for DPA and D-alanyne connection
2.1.4 Flagella
Sebagian besar bakteri aerobik membentuk spora, yang mobile dan memiliki flagela peritrichous
yang menggunakan sel untuk bergerak dalam lingkungan sebagai respon terhadap rangsangan

eksternal melalui mekanisme kemotaksis, komposisi spesies Bacillus alkaliphile seperti B. firmus,
menyajikan konten rendah di dasar asam amino, pikir untuk membuat sel yang lebih stabil pada
nilai pH hingga 11. Sistem flagellar dan kemotaksis telah dipelajari secara ekstensif di B. subtilis.
Fig.3 Flagellar strains: B. cereus (A) B. brevis (B) (from Kenneth Todar PhD.2009 University of Wisconsin-
Madison).
2.2 Kondisi Pertumbuhan dan Persyaratan Gizi
Bakteri pembentuk spora umumnya chemoheterotrophs mampu menerapkan proses respirasi
menggunakan berbagai senyawa organik sederhana seperti gula asam amino dan asam organik.
Dalam beberapa kasus mereka dapat memfermentasi karbohidrat dengan reaksi yang
menghasilkan gliserol dan butanediol. Spesies seperti B. megaterium perlu ada faktor organik
untuk pertumbuhan, sementara yang lainnya memerlukan asam amino atau vitamin. Kebanyakan
mesofilik dengan optimal pertumbuhan suhu antara 30 dan 45 derajat. Beberapa spesies termofilik
dengan pertumbuhan yang optimal sekitar 65°C. Psychrophiles spesies sedikit tetapi mampu
mengembangkan dan sporify bahkan pada 0°C. Bacillus spesies dapat tumbuh dalam berbagai pH
antara 2 dan 11. Dalam lingkungan laboratorium, dan kondisi pertumbuhan yang optimal, mereka
hadir waktu regenerasi sekitar 25 menit.
2.3 Bacillus endospora
2.3.1 Sporulasi
Bakteri Gram positif milik genus Bacillus dapat menjalani proses perkembangan diferensiasi sel
yang kompleks yang memungkinkan mereka untuk beradaptasi dengan perubahan kondisi
lingkungan dan kurangnya nutrisi dengan memproduksi spora yang sangat tahan. Proses ini,
disebut sporulasi, melibatkan kemajuan melalui tahapan yang berbeda termasuk inisiasi, segregasi
kromosom, khusus sporulasi pembelahan sel (asimetris pada bakteri berbentuk batang), ekspresi
gen diferensial dan mekanisme transduksi sinyal tertentu. Kembalinya jalur, menyebabkan
pertumbuhan sel vegetatif, spora melibatkan diikuti dengan perkembangan dari spora
berkecambah. Semua aspek dari sporulasi telah dipelajari selama bertahun-tahun dengan sangat

rinci dan memiliki baik dampak besar pada pemahaman kita tentang banyak proses sel dasar
lainnya dan sudah mulai untuk bahan bakar penelitian terapan spora dengan ide-ide baru.
Secara umum, faktor-faktor yang dapat mempengaruhi sporulasi kemampuan untuk bersporulasi
adalah pH, oksigen, dan suhu. Sporulasi tampaknya disukai oleh kondisi yang mengakibatkan
tingkat pertumbuhan menurun dengan adanya energi yang memadai dan cadangan sumber
karbon. Ketika nutrisi yang cukup yang hadir, sel vegetatif membagi cepat dengan pembelahan sel,
tapi pemicu lingkungan seperti penipisan gizi dan / atau kepadatan penduduk melakukan memulai
proses sporulasi, akhirnya menghasilkan spora bakteri (Barak dan Wilkinson, 2005; Eichenberger
et al, 2004 , Errington 2003; Piggot en Hilbert, 2004; Wang et al, 2006). Pengembangan Spore
melibatkan pembelahan sel yang tidak sama, sel kecil (forespore) yang ditelan oleh satu lebih besar
sehingga endospora berkembang dalam sel induk. Pada banyak spesies, sel buncit dengan spora.
Pembentukan spora, yang memakan waktu beberapa jam, disertai dengan morfologi, perubahan
fisiologis, dan biokimia, dan spora refractile dihasilkan secara struktural sangat berbeda dari sel
vegetatif. Pembentukan spora merupakan proses yang mahal dan kompleks untuk sel bakteri.
Spora hanya dibuat dalam kondisi dimana kelangsungan hidup sel terancam seperti kelaparan
untuk nutrisi atau akumulasi limbah beracun tertentu. Peraturan sporulasi ketat dan beberapa
langkah pertama yang reversibel. Hal ini membantu sel menghemat energi dan hanya bersporulasi
bila diperlukan. Inisiasi pembentukan spora dikendalikan oleh Spo0A, faktor transkripsi yang
memodulasi ekspresi gen selama transisi dari eksponensial pada fase diam. Spo0A adalah
regulator respon dari dua komponen, sinyal sistem pengaturan transduksi, dan dalam
menumbuhkan sel ada terutama dibagian dephosphorylated. Dalam kondisi di mana sporulasi
terbentuk, ia difosforilasi oleh phosphorelay melibatkan sejumlah kinase dan dengan cara
mengaktifkan atau menekan ekspresi gen dengan cara berikatan spesifik pada target DNA ("kotak
0A") ditemukan hulu gen diatur. Selanjutnya, perubahan dalam ekspresi gen dikendalikan oleh
sintesis kondisi lingkungan dan kurangnya nutrisi dengan memproduksi spora yang sangat tahan.
dan aktivasi alternatif σ faktor yang berhubungan dengan RNA polimerase dan mengubah
spesifisitas promotor enzim. Lima faktor σ diketahui diproduksi pada berbagai tahap.
Sporulasi adalah proses langkah tujuh di mana sel akan secara dramatis direorganisasi. Tahap
pertama sporulasi terlibat dalam membentuk kompartemen terpisah untuk spora dalam sel induk.
Aktivasi Spo0A dan σH dalam sel predivisional mengarah ke pembagian asimetris. Setelah ini
terjadi, sporulasi ireversibel. Tahap berikutnya melibatkan meletakkan berbagai lapisan spora.
Baik spora dan sel induk berperan dalam proses ini. Dalam dua kompartemen, pengembangan
spora yang didalangi oleh RNA polimerase σE ekspresi gen diatur dalam sel induk dan σF
ekspresi gen diatur dalam forespore tersebut. Pada tahap akhir, diatur oleh σK dalam sel induk,
dan σG di forespore (Wang et al, 2006), spora dehidrasi sitoplasma sementara pada tahap ini
mothercells lisis sebagai konsekuensi dari kematian sel terprogram (Lewis, 2000) , melepaskan
spora di lingkungan. The sporulasi jalur digambarkan dalam Gambar 4.

Fig. 4 The morphological stages of sporulation. Patrick Stragier. Annual Review of Genetics, 1996
2.3.2 Struktur Spora Bakteri
Struktur kompleks spora melindungi kompartemen selular dari tantangan lingkungan memberikan
perlawanan tangguh terhadap kondisi yang keras (Tabel 1). Properti lain yang khas spora, penting
untuk umur panjang adalah dormansi spora. Penampang dari spora dalam gambar 5,
mengungkapkan semua kompartemen spora termasuk inti, membran dalam, korteks, membran
luar dan lapisan mantel diikuti oleh exosporium tersebut.

Lapisan terluar adalah exosporium, yang merupakan penutup tipis yang terbuat dari protein.
Exosporium adalah sisi utama dari kontak dengan lingkungan, termasuk pertahanan host, itu tidak
ada pada spora B. subtilis, tetapi tampaknya dilestarikan antara patogen basil pada anggota
kelompok B. cereus. longgar-mengepas, seperti balon struktur terdiri dari paracrystalline lapisan
basal dan rambut seperti tidur siang eksternal (Gerhardt, P., 1967). Filamen dari rambut sejenak
tampak seperti dibentuk oleh glikoprotein kolagen seperti tunggal, sedangkan lapisan basal terdiri
dari sejumlah protein yang berbeda dalam asosiasi ketat dan longgar. Exosporium adalah bagian
paling sedikit dipahami dari struktur spora, tapi exosporium hadiran pada Basil patogen dan,
menunjukkan kemungkinan peran dalam interaksi dengan organisme inang (host). Berikut
terdapat mantel spora yang terdiri dari tinggi akan keratin cross-linked dan lapisan spora tertentu
protein. Peran dari kebanyakan protein mantel individu masih belum jelas. Membran luar terletak
antara korteks dan lapisan mantel dalam. Fungsinya masih belum juga dijelaskan, Meskipun
demikian struktur penting selama pembentukan spora (Piggot, 2004). Korteks terdiri dari
peptidoglikan cross-linked longgar. Hal ini penting untuk menjaga dormansi spora dan tahan
panas, dan diperkirakan untuk berkontribusi pada keadaan dehidrasi inti (Nicholson et al, 2000
dan referensi di dalamnya). Komposisi korteks mirip antara banyak bakteri pembentuk spora,
termasuk clostridia (Atrih dan Foster, 2001). Selama perkecambahan spora, korteks harus
terdegradasi dengan cepat untuk memungkinkan inti spora berkembang. Selama dormansi spora,
spora korteks litik enzim yang hadir dalam spora dorman meskipun dalam keadaan tidak aktif.
Dua penting korteks enzim litik di B. subtilis spora berkecambah adalah CwlJ dan SleB. CwlJ
disintesis dalam sel induk selama sporulasi, dan terletak di lapisan luar spora, sedangkan SleB,
disintesis di forespore tersebut, ditargetkan untuk kedua membran dalam spora dan lapisan spora
luar (Bagyan dan Setlow, 2002; Chirakkal et al., 2002). Kita tahu bahwa protein SleB B. subtilis
adalah muramidase tapi kita belum tahu bagaimana diaktifkan selama perkecambahan. Tidak
semua Sporeformers memiliki SleB, pasangan CwlJ enzim perkecambahan khusus litik Korteks
membran dalam, mengelilingi inti spora sebagai penghalang permeabilitas selektif. Reseptor
perkecambahan dan produk gen dari SpoVA operon, bagian penting dari aparat perkecambahan,
(Vepachedu dan Setlow, 2005) tampaknya sebagian tergabung dalam membran ini. Hal ini
menunjukkan bahwa membran dalam memainkan peran penting dalam tahap pertama
perkecambahan. Apalagi, setelah aktivasi reseptor perkecambahan, membran dalam memberikan
kontribusi dalam sinyal transduksi langsung ke bagian lain dari spora sebagai sinyal
perkecambahan. Inti mengandung komponen sel bakteri vegetatif (dinding sel, membran
sitoplasma, sitoplasma, nucleoid, DNA, ribosom, dll) serta jumlah yang signifikan asam dipicolinic
dan ion Ca2 +. Kadar air endospora hanya sekitar 10-30% dari kadar air sel vegetatif, sehingga
endospora mampu bertahan pada tingkat dehidrasi yang akan membunuh sel vegetatif. Kadar air
rendah juga menyediakan endospora dengan ketahanan kimia (bahan kimia seperti hidrogen
peroksida) dan hal itu menyebabkan enzim yang tersisa dari sel spora menjadi tidak aktif.
Satu senyawa kimia yang diproduksi oleh endospora yang diperkirakan untuk memberikan
pinjaman kepada resistensi yang tinggi mereka adalah asam dipicolinic. Bahan kimia ini telah
ditemukan dalam sel spora semua endospora diperiksa. Asam dipicolinic berinteraksi dengan ion

kalsium untuk membentuk kalsium dipicolinate (DPA), yang merupakan zat utama diyakini
meminjamkan endospora perlawanan mereka dan mewakili sekitar 10% dari berat kering dari
endospora. Spora juga mengandung protein spora asam larut kecil (SASPs). Fungsi ini untuk
melindungi DNA dari radiasi UV, pengeringan dan panas kering, dan mereka juga berfungsi
sebagai sumber karbon dan energi selama proses menjadi kecambah (konversi kembali ke sel
vegetatif).
Gbr.5 representasi skematis dari struktur spora, (dari Departemen Mikrobiologi, Cornell
University. 2007)
2.3.3 Proses perbenihan
Selain bunga intrinsiknya, perkecambahan spora telah menarik minat diterapkan, karena melalui
perkecambahan spora yang pada akhirnya menyebabkan pembusukan makanan dan keracunan
(Setlow et al., 2003). Dalam rangka untuk memulai perkecambahan dan memulihkan
pertumbuhan vegetatif ketika kondisi menjadi baik, spora bakteri harus mampu memonitor
lingkungan eksternal mereka. Perkecambahan spora, seperti yang didefinisikan sebagai kejadian-
kejadian yang menyebabkan hilangnya sifat spora tertentu, merupakan proses dasarnya biofisik dan
degradatif (Moir dan Smith, 1990). Batin meningkat membran spora dalam fluiditas (. Stewart et
al, 1979) dan fluks ion melanjutkan, kation monovalen, kalium dan natrium, bergerak melintasi
membran spora, dan kalsium ion dan dipicolinate diekskresikan. Peptidoglikan dari korteks spora
terdegradasi, dan lapisan mantel yang sebagian terdegradasi (Atrih et al, 1998;.. Atrih et al, 1999).
ATP sintesis dan metabolisme oksidatif melanjutkan (Otani et al., 1986), kerusakan DNA
diperbaiki (Nicholson et al., 1997) dan DNA-kompleks kecil protein asam-larut (SASPs)
terdegradasi oleh protease spesifik (Nessi dkk ., 1998), menyediakan sumber asam amino untuk
perkembangan. Hal ini terjadi tanpa memerlukan sintesis makromolekul baru, sehingga badan
yang diperlukan sudah ada dalam spora dorman yang matang. Perkecambahan dalam merespon
nutrisi kimia yang spesifik membutuhkan protein reseptor spesifik, terletak di membran dalam
spora. Setelah menembus lapisan luar mantel spora dan korteks, germinant berinteraksi dengan
reseptor: salah satu konsekuensi awal mengikat ini adalah gerakan kation monovalen dari inti
spora, diikuti oleh Ca2 + dan asam dipicolinic (DPA). Molekul Germinant dapat mengaktifkan

reseptor ini, mungkin oleh interaksi alosterik (Wolgamott dan Durham, 1971). Ini memulai
kaskade proses yang secara bertahap menurunkan struktur pelindung spora dan melanjutkan
proses seluler dan metabolisme, akhirnya menyebabkan sel vegetatif (Hornstra, 2007). Pada
beberapa spesies, sebuah protein transpor ion juga diperlukan untuk tahap awal ini. Peristiwa awal
termasuk kehilangan tahan panas, gerakan ion dan rehidrasi parsial inti spora, dapat terjadi tanpa
korteks hidrolisis, meskipun yang terakhir diperlukan untuk rehidrasi inti lengkap dan
pembentukan koloni dari spora. Dalam B. subtilis dua krusial korteks litik enzim telah
diidentifikasi: satu adalah CwlJ, yang DPA-responsif dan terletak di persimpangan korteks-coat.
Yang kedua, SleB, hadir baik di lapisan luar dan pada membran spora dalam, dan lebih tahan
terhadap panas basah daripada CwlJ. Cortex hidrolisis menyebabkan rehidrasi lengkap inti spora,
dan kemudian aktivitas enzim dalam protoplas spora resume. Kami belum tahu apa yang
mengaktifkan kegiatan SleB di spore, dan kita juga tidak memiliki informasi sama sekali pada
bagaimana mantel spora yang terdegradasi (Moir, 2005).
Fig. 6 Bacillus spore germination. Kort et al. 2005
2.3.4 Reseptor Basilus
Spora Bacillus dilengkapi dengan satu set spesifik reseptor perkecambahan yang memantau
lingkungan untuk kondisi hasil yang tepat. Sebagai molekul sinyal disini fungsi perkecambahan,
seringnya asam amino atau ribosides, yang mampu memulai perkecambahan ketika hadir dalam
konsentrasi yang tepat dan campuran di dekat spora (Foerster dan Foster, 1966; Gould, 1969).
Proses perkecambahan melibatkan interaksi perkecambahan kimia dengan reseptor spesifik
diduga dalam spora, dan transduksi sinyal ini dalam beberapa cara. Tidak ada bukti transportasi
massal atau metabolisme germinant (Scott dan Ellar, 1978). Rincian molekul penuh proses
transduksi sinyal dalam perkecambahan spora belum jelas, namun hipotesis wajar dapat dibangun
dengan informasi yang tersedia, yang sebagian besar berasal dari studi dengan B. subtilis. Salah satu
hipotesis untuk menjelaskan perubahan perkecambahan terkait adalah bahwa peristiwa awal dalam

perkecambahan akan melibatkan perubahan membran yang mengubah sifat permeabilitas,
mengarah ke redistribusi ion dan air dalam spora, dan dengan demikian mengaktifkan enzim litik
(Keynan, 1978); bukti penghambatan perkecambahan spora oleh saluran ion blocker mendukung
ini (Mitchell, 1986), seperti halnya asosiasi membran kemungkinan produk gen Gera (Moir dan
Smith, 1990). Kecambah harus terlebih dahulu menembus lapisan luar dan lapisan korteks spora
sebelum datang di kontak dengan reseptor kecambah.
Operon GerA dalam genom B. subtilis, pengkodean untuk perkecambahan (Ger) reseptor Gera,
adalah perkecambahan operon pertama kali dijelaskan (Zuberi et al, 1987), dan terbukti terlibat
dalam L-alanin dimulai. perkecambahan. Kemudian, Gerb dan gerK digambarkan, keduanya
terlibat dalam respon perkecambahan pada campuran L-asparagin, D-glukosa, D-fruktosa dan K +
(respon AGFK) (Corfe et al, 1994).
Genom hampir semua Sporeformers mengandung setidaknya satu, dan biasanya beberapa dari
operon reseptor, yang mengarah pada kesimpulan bahwa Sporeformers menanggapi berbagai jenis
germinant melalui beberapa reseptor, dikodekan dalam kelompok gen yang telah menyimpang
dari beberapa nenek moyang (s). Kadang-kadang lebih dari satu reseptor yang terlibat dalam
penanggulangan Kecambah satu atau beberapa (McCann et al, 1996;. Barlass et al, 2002;. Irlandia
dan Hanna, 2002). The Gera operon, seperti kebanyakan homolog nya, mengkodekan tiga
protein, GerAA, GerAB dan GerAC. Ini semua memiliki hubungan potensial dengan membran -
GerAA dan AB adalah protein membran terpisahkan - GerAA memiliki diprediksi domain
membran yang akan span membran setidaknya lima kali, sedangkan GerAB diperkirakan
memiliki 10 rentang membran, dan diklasifikasikan dalam istilah evolusi sebagai subfamili tunggal
komponen membran transporter (Jack et al., 2000) (itu adalah satu-satunya dari tiga protein yang
memiliki homologi protein lain yang dikenal di luar bakteri pembentuk spora). The GerAC
protein merupakan lipoprotein diprediksi. Semua disajikan dalam kompartemen spora
berkembang, dan karena itu akan ditargetkan ke membran dalam spora. Percobaan menggunakan
antibodi terhadap GerAA dan protein GerAC menunjukkan bahwa mereka yang hadir dalam
membran dalam, daripada lapisan luar spora (Hudson et al., 2001) dan percobaan pada Gerba
menunjukkan bahwa ini juga hadir dalam membran dalam (Paidhungat dan Setlow, 2001). Bukti
bahwa protein reseptor langsung mengikat germinant hanya datang, sejauh ini, dari analisis
fenotipe mutan. Germinant A dapat mengikat tanpa mediasi transportasi, tetapi menyebabkan
perubahan alosterik dalam protein membran (s). Oleh karena itu, kita perlu pemahaman yang
lebih baik dari protein reseptor, yang telah terhalang oleh kegagalan upaya sejauh ini untuk
overexpress dan mengkarakterisasi komponen membran terkait.
3. Terjadinya Bacillus spp. dalam lingkungan
Anggota genus Bacillus memiliki distribusi lingkungan di mana-mana. The endospora produksi
dasar untuk dispersi Bacillus spp .. Gudang bakteri ini adalah tanah. Strain telah diisolasi dari
ekstrem gurun dan sampel Antartika. Kapasitas resistensi spora ekstrim telah kagum banyak
ilmuwan dan telah dipelajari, mencoba untuk mengungkapkan mekanisme di balik perlawanan
spora (Nicholson et al, 2000 dan referensi di dalamnya, Setlow, 2005). Mereka telah terbukti
menjadi jenis yang paling tahan lama dari sel yang ditemukan di alam: berkat keadaan tidak aktif,

mereka dapat bertahan untuk jangka waktu yang sangat lama, bahkan jutaan tahun. Karena
perlawanan yang luar biasa ini, keberadaan spora dapat menyebabkan beberapa masalah
dimanapun higienis dan kondisi steril adalah prasyarat, seperti dalam industri makanan dan
lingkungan medis. Spora dapat menahan sebagian besar teknik pelestarian saat ini diterapkan dan
sebagai konsekuensinya bertanggung jawab untuk infeksi, penyakit yang bertalian dengan makanan
yang serius dan sejumlah besar pembusukan makanan (Brul et al, 2006). Industri telah
mengembangkan metode pengawetan untuk mengurangi kontaminasi mikroba pada produk
makanan. Sebagai hasil dari upaya ini makanan kita dapat dianggap aman. Sayangnya, metode yang
digunakan saat ini tidak sepenuhnya efektif terhadap spora sebagai konsekuensi dari kapasitas
ketahanan mereka yang luar biasa (Oomes dan Brul, 2004). Kehadiran spora Bacillus di
lingkungan pasti menghasilkan keberadaan spora dalam produk pertanian dan susu. Dalam
beberapa tahun terakhir, konsumen telah bergeser pilihan mereka pada"segar seperti" makanan,
karena memiliki rasa yang lebih baik dan karakteristik tekstur, produk ini diharapkan juga lebih
sehat. Namun, penggunaan kondisi pengolahan makanan ringan, basal untuk mengakomodasi
pilihan ini, memfasilitasi keberadaan spora dalam produk makanan, karena sering tidak selesai
inaktivasi spora. Selain itu, kurangnya kompetisi mikroba setelah perawatan, memfasilitasi cepat
memfasilitasi pelepasan cepat sel-sel vegetatif dari berkecambah spora.
3.1 Kelompok Bacillus cereus
Kelompok Bacillus cereus terdiri subdivisi yang sangat homogen genus Bacillus yang menunjukkan
sifat yang sangat patogen berbeda. termasuk B. cereus, bersama dengan B. anthracis, B.
thuringiensis, B. weihenstephanensis, B. mycoides dan B. pseudomycoides, ke grup ini
mikroorganisme terkait erat. Gudang bakteri ini adalah tanah, tetapi mereka tersebar luas di
lingkungan, atau menghambat kehidupan dari usus serangga. Kadang-kadang spesies ini dapat
menyebabkan keracunan makanan dan infeksi jaringan lunak, terutama mata. B. cereus
merupakan patogen manusia oportunistik yang paling sering dikaitkan dengan keracunan makanan
(Drobniewski et al. 1993). Anggota lain dari grup ini, saat ini diklasifikasikan sebagai B.
thuringiensis, terutama patogen serangga banyak digunakan sebagai biopestisida (Schnepf et al
1998). Sebuah fenotipe patogen ketiga dipamerkan oleh B. anthracis: itu adalah agen penyebab
anthrax, penyakit zoonosis yang dapat mematikan bagi manusia. B. mycoides, B. pseudomycoides
dan psychrotolerant B. weihenstephanensis kurang baik ditandai. Meskipun yang terakhir, mampu
tumbuh secara efisien pada suhu 4°C, dapat membentuk bahaya dalam produk makanan disimpan
pada suhu rendah (Hornstra 2007). Analisis genom B. weihenstephanensis, mengungkapkan
adanya gen toksin (Stenfors et al, 2002), namun belum menunjukkan tanggung jawabnya dalam
penyakit yang ditularkan melalui makanan.
Meskipun studi pertama pada B. cereus kelompok mulai abad in 19 tahun, hubungan antara
beberapa organisme ini belum diatasi secara tuntas. Hubungan genetik yang sangat tinggi antara B.
cereus, B. anthracis dan B. thuringiensis, membuat genom diferensiasi berbasis rumit atau bahkan
tidak mungkin (Helgason et al, 2000; Ivanova et al, 2003). Penanda konvensional keragaman
kromosom, seperti 16S dan 23S rRNA gen, pada dasarnya identik (Ash et al. 1991, 1992).
Beberapa penelitian menggunakan teknik yang berbeda seperti elektroforesis berdenyut-bidang gel

DNA kromosom (Carlson ea al. 1994), pemetaan genom (Carlson et al.1996), multilocus enzim
elektroforesis (Helgason et al, 1998, 2000.), BOX-PCR fingerprinting (Kim et al.2001), multilocus
urutan mengetik (MLST) (Helgason et al 2004) dan diperkuat fragmen polimorfisme panjang
(AFLP) analisis (Ticknor et al. 2001) , juga telah menyarankan bahwa spesies ini sangat erat
kaitannya bahwa mereka harus dianggap sebagai satu spesies.
Di sisi lain, beberapa perbedaan dalam hal fenotipe dalam spesies ini, memungkinkan identifikasi
mudah menggunakan metode klasik; B. cereus dan B. thuringiensis aktivitas hemolitik ini, yang
motil, resisten terhadap penisilin, dan mampu menurunkan tirosin dan menghasilkan phosphatise,
sementara B. anthracis tidak menunjukkan karakteristik tersebut. B. thuringiensis menghasilkan
kristal beracun parasporal, yang dikenal sebagai δ-endotoksin, yang memungkinkan untuk
membedakan itu dari B. cereus (Schoeni dan Wong, 2005 dan referensi di dalamnya). Selain itu,
pola patogenisitas spesies ini sangat berbeda. Sebagian besar gen yang bertanggung jawab untuk
virulensi bakteri ini plasmid berada. Dalam beberapa kasus, hilangnya berkorespondensi plasmid
hilangnya virulensi, membuat mustahil untuk membedakan antara bakteri yang termasuk
kelompok ini. Hubungan evolusi antara semua anggota kelompok harus menjadi penting, tidak
hanya untuk memahami evolusi virulensi pada kelompok B. cereus, tetapi juga untuk meningkat
pesat kepentingan ilmiah dan politik yang organisme ini telah diperoleh dalam beberapa tahun
terakhir dari.
3.2 B. cereus sebagai organisme patogen
B. cereus merupakan patogen manusia oportunistik yang dapat menyebabkan dua jenis infeksi
yang ditularkan melalui makanan. Sindrom muntah disebabkan oleh produksi toksin dalam
produk makanan sebelum dikonsumsi, sedangkan sindrom diare adalah hasil dari tertelan B.
cereus spora yang berkecambah dalam usus manusia dan menghasilkan enterotoksin dalam
saluran usus (Granum, 2001; Schoeni dan Wong, 2005).
3.2.1 Sindrom Emetik
Sindrom muntah adalah contoh khas dari keracunan makanan yang disebabkan oleh racun yang
disebut cereulide, yang menyebabkan mual dan muntah 1-6 jam setelah konsumsi makanan yang
terkontaminasi (Kramer en Gilbert, 1989; Ehling-Schulz et al, 2004). Gejala yang sama disebabkan
oleh Staphylococcus aureus enterotoksin (Granum dan Lund, 1997). Cereulide adalah panas dan
pH yang stabil melingkar dodecadepsipeptide (Gambar 7) yang terdiri dari tiga unit berulang dari
empat asam amino, masing-masing terdiri dari DO-leusin, D-alanin, LO-valin dan L-valin (Agata et
al 1994;. Agata et al. 1995b). Struktur menyerupai kalium yang dikenal ionofor valinomisin (lihat
Gambar 7). Memang cereulide telah terbukti menjadi racun bagi mitokondria dengan bertindak
sebagai ionofor kalium. Gejala umumnya ringan, dan pasien sembuh dalam 24 jam, tetapi kasus-
kasus kalanya merenggut nyawa akibat sindrom muntah telah dilaporkan (Mahler et al, 1997).

Gbr.7 Perbandingan komposisi asam amino dari cereulide [D-Ala - DO-Leu - L-Val - LO-Val] 3
(kiri) dan valinomisin [D-Val - LO-Ala - L-Val - DO- val] 3 (kanan) (Teplova et al. 2006)
Pada tahun 2004 dua kelompok penelitian telah menunjukkan bahwa produksi cereulide di
B.cereus adalah hasil dari mekanisme yang rumit dioperasikan oleh ribosom peptida sintetase non
(NRPS) kompleks (Toh et al 2004;.. Horwood et al 2004).
3.2.2 Sindrom diare
Sindrom diare ini disebabkan oleh produksi enterotoksin dalam usus kecil setelah konsumsi
makanan yang terkontaminasi oleh sel vegetatif B.cereus. Ini khas toxico-infeksi ditandai dengan
sakit perut, kram dan diare, terjadi 8 sampai 16h setelah konsumsi (Granum dan Lund, 1997).
The enterotoksin menyebabkan terganggunya air (transportasi zat terlarut) yang mempengaruhi
lapisan epitel dari usus kecil. Gejala penyakit ini sangat mirip dengan yang disebabkan oleh
penyakit yang bertalian dengan makanan dari Clostridium perfringens, tetapi mekanisme patogen
tampaknya berbeda: C. perfringens enterotoksin dilepaskan selama sporulasi di usus kecil,
sedangkan enterotoksin B. cereus diproduksi selama pertumbuhan di usus kecil (McClane, 1997;
Granum, 2007).
Selama tahun 1980-an dan 1990-an, dengan penemuan dan identifikasi enterotoksin, banyak
kemajuan dalam penelitian sindrom diare mungkin terjadi. Baru teknik biologi molekuler
diizinkan untuk aquire pengetahuan pada produksi dan regulasi enterotoksin. Berdasarkan data
epidemiologi diperkirakan bahwa 103-108 sel per gram makanan yang cukup untuk manifestasi
gejala penyakit (Granum dan Lund, 1997). Beberapa faktor virulensi yang dihasilkan oleh B.
cereus telah dijelaskan, yang enterotoksin tiga komponen hemolisin BL dan NHE non-hemolitik
ditandai dengan baik (Beecher dan Wong, 1997; Lindback et al, 2004). Lain toksin komponen
tunggal, enterotoksin T telah dijelaskan (Agata et al, 1995) dikodekan oleh gen bceT, tetapi peran
enterotoksin ini dalam B. cereus dimulai keracunan makanan masih harus dijelaskan. Umumnya
gejala yang berhubungan dengan sindrom diare agak ringan, tetapi strain B. cereus memproduksi
CytK toksin, yang bertanggung jawab untuk enteritis nekrotik, menyebabkan kematian tiga orang di
Perancis (Lund et al, 2000).
Haemolysin BL (HBL)

Pertama enterotoksin dijelaskan dalam B. cereus adalah hemolitik toksin BL (HBL). Karena efek
yang diamati in vivo dan in vitro (Kramer dan Gilbert, 1989), itu awalnya didefinisikan faktor
diarrhoeagenic, faktor akumulasi cairan dan vaskular permeabilitas faktor (Shinagawa et al. 1991a,
1991b Shinagawa dkk, Sutherland. Dan Limond, 1993 ). HBL adalah protein toksin komponen
tiga, dikodekan oleh gen 3 diselenggarakan pada 1 operon hblA, hblC dan gen hblD menyandikan
B, L1, L2 dan komponen, masing-masing. Sebuah gen keempat telah ditemukan dalam operon
ini, hblB, namun fungsinya belum didefinisikan. Berat molekul dari B-komponen 38 kDa1, 40
kDa untuk L1-komponen, dan 45 kDa L2-komponen.
Non enterotoksin hemolitik (NHE)
Pada tahun 1996 penyelidikan lebih dari 300 strain dari berbagai sumber, termasuk strain dari
sejumlah wabah, mengungkapkan bahwa satu kompleks enterotoxigenic diketahui, dengan efek
sitotoksik, bisa menjadi agen penyebab di beberapa B.cereus terkait penyakit yang bertalian
dengan makanan ( Granum et al. 1996). Ini tiga enterotoksin komponen, bernama NHE,
ditemukan setelah wabah di Norwegia (Lund dan Granum, 1996). Meskipun NHE berisi beberapa
kemiripan struktural untuk HBL kompleks, dan menyebabkan gejala yang mirip dengan yang
disebabkan oleh HBL, ia tidak memiliki aktivitas hemolitik dan potensi sitotoksik dari tiga
komponen dua berbeda (Lund dan Granum, 1997).
Cytotoxin K
Cytotoxin K (CYTK) juga mungkin terlibat masuk B. cereus keracunan makanan. Racun ini
menyebabkan diare berat termasuk enteritis nekrotik. Ini terdiri dalam protein toksin tunggal
dengan berat molekul 34 kDa Sekitar. CYTK Milik keluarga β-barrel saluran pembentuk racun
(termasuk leucocidins Staphylococcus aureus dan b-toxin Clostridium perfringens). Hal ini
nekrotik dan hemolitik (Lund et al., 2000), dan sitotoksik Juga untuk epitel usus (Hardy et al.,
2001). Ini pertama kali Ditandai di B. 91-98 cereus regangan: strain diisolasi dari kasus penyakit
yang bertalian dengan makanan di Prancis Itu bertanggung jawab atas kematian tiga orang (Lund et
al, 2000.). Tak satu pun dari, gen enterotoksin lainnya, dijelaskan sebelumnya (hbl dan NHE)
terdeteksi pada galur ini, lanjut melibatkan CYTK sebagai faktor virulensi utama. Namun cytotoxin
K Ditemukan pada wabah ini, Muncul menjadi bentuk terkuat Ditemukan sejauh ini. Kemudian
penelitian mendeteksi kurang kuat varian K cytotoxin, Juga bernama cytotoxin atau CYTK seperti
K-2, dengan Sekitar 89% asam amino homolog dengan aslinya cytotoxin K (CYTK-1) tetapi 20%
kurang beracun pada usus manusia Caco-2 sel dan Vero-sel. Namun, beberapa B. CYTK cereus
isolat memiliki gen, (Guinebretiere et al., 2002) Meskipun hanya kehadiran gen mungkin terlibat
masuk virulensi tidak cukup untuk memberikan patogenisitas, tingkat transkripsi gen mungkin
penting untuk virulensi (Brillard dan Lereclus, 2004).
Enterotoksin T (Bc-D-THT)
Lain toksin komponen tunggal, enterotoksin T (bc-D-THT) Telah dijelaskan dalam B. cereus
(Agata et al, 1995). The bc-D-THT enterotoksin, dikodekan oleh gen BCET, mampu
menyebabkan akumulasi cairan di diligasi kelinci ileum loop (Punyashthiti & Finkelstein, 1971),

menunjukkan sitotoksisitas terhadap sel Vero (Konowalchuk et al., 1977). Berbeda Disebutkan
untuk pertama tiga enterotoksin (HBL, Nhe dan CYTK), belum ditampilkan Berkunjung bc-D-
THT terlibat masuk keracunan makanan. Peran enterotoksin ini di keracunan makanan oleh B.
cereus masih harus dijelaskan.
3.2.3 Cara kerja dari enterotoksin
Dua tiga komponen enterotoksin HBL dan NHE menyajikan modus serupa tindakan (Lund dan
Granum, 1997). Menurut VERO-sel percobaan sitotoksisitas dengan ketiga komponen HBL-
kompleks yang Diperlukan untuk kegiatan enterotoxic maksimal (Powell, 1987; Rousset dan
Dubreuil, 2000;. Belaiche, 2000, Black et al 2005). Itu rasio optimal setiap kegiatan komponen
1:1:1 untuk HBL (Beecher et al. 1995). Model terbaru untuk tindakan HBL dipelajari oleh
Beecher dan Lee Wong (1997), disarankan Itu Semua tiga komponen mengikat ke sel target yang
mengarah ke lisis mereka. Bahkan untuk kegiatan dari ketiga komponen toksin NHE adalah
permintaan yang kompleks, Meskipun dalam hal ini rasio optimal 10:10:01 (NHE-A: NHE-B:
NHE-C) (. Lindback et al 2004).
Modus aksi cytotoxin K berbeda dari itu dijelaskan untuk kedua HBL dan NHE. Urutan asam
amino dari cytotoxin K Itu menunjukkan CYTK milik β-barrel saluran pembentuk protein
keluarga: seperti β-toksin dari Clostridium perfringens dan α - dan γ - haemolysin Staphylococcus
aureus (Hardy et al, 2001.). Gejalanya meliputi lesi epitel parah dan diare berdarah.
3.2.4 Peraturan ekspresi enterotoksin
Lebih dari satu sistem regulator telah diidentifikasi menjadi penting dalam B. cereus peraturan
virulensi. Regulator transkripsi PlcR (Phospholipase C Regulator) mengambil bagian dalam
menguasai sebagian besar faktor virulensi dikenal di B. cereus: enterotoksin, haemolysins,
phospholipases dan protease (Michel dkk 2008). Juga mengatur ekspresi fosfolipase C, kemudian
disebut fosfolipase C regulator (PlcR). Transkripsi PlcR yang autoinduced (Lereclus et al 1996)
dan ditekan oleh faktor sporulasi yang Spo0A (Lereclus et al 2000). Untuk menjadi aktif PlcR Dad
membutuhkan peptida. papR disajikan sebagai propeptide bawah kendali PlcR, diekspor keluar
dari sel, diproses untuk membentuk peptida aktif selama baik ekspor maupun dalam medium
ekstraseluler, dan ditangkap kembali oleh sel melalui permease oligopeptide sistem OppABCDF
(Slamti et al., 2002, Gominet dkk, 2001, Declerck dkk 2007). Dengan demikian, tiga mitra PlcR,
OppABCDF Ayah dan berfungsi sebagai sistem quorum-sensing. PlcR Mengintegrasikan
setidaknya dua kelas sinyal: pertumbuhan sel dan Spo0A diri telah melalui kerapatan sel melalui
PAPR (Michel dkk 2008).
Namun, Ini Sepertinya Itu sistem lain dapat berinteraksi dengan PlcR, dengan asumsi peran dalam
mengatur pola ekspresi B. faktor virulensi cereus. Variabilitas dan kemampuan beradaptasi, adalah
karakteristik penting dari semua organisme Itu memiliki kemampuan untuk bertahan dan
berkembang dalam berbagai kondisi lingkungan; Seringkali faktor virulensi memungkinkan
mereka untuk menaklukkan relung yang berbeda Sepanjang infeksi. Pengakuan sinyal khusus dan
konversi informasi ini ke respon transkripsi yang spesifik, yang basal untuk mengatasi berbagai
situasi lingkungan. Di banyak kasus, sinyal melalui satu hasil sistem dua komponen dalam

perubahan terkoordinasi dalam ekspresi beberapa gen siapa produk berperan dalam adaptasi
terhadap lingkungan yang khusus. Beberapa penelitian difokuskan pada Pentingnya dua
komponen sistem transduksi sinyal dalam mengendalikan kedua metabolisme dan faktor virulensi
di B. cereus (Duport et al. 2006). Salah satu faktor pengendali utama ekspresi gen di B. Selama
subtilis fermentasi (Nakano et al, 1997, Cruz Ramos et al, 2000) microaerobic dan aerobik
pertumbuhan (Hartig et al 2004) adalah ResDE sistem dua komponen, Selain itu mengatur
virulensi Staphylococcus aureus dalam kondisi rendah oksigen (Yarwood et al, 2001) .
Homolognya dari B. ResDE ditemukan pada B. subtilis cereus. Itu Menunjukkan Bahwa ResDE,
memainkan peran penting dalam regulasi ekspresi enterotoksin di B. cereus. Sistem regulasi dua
komponen Terdiri dari histidin kinase sensor (yield), terikat pada membran sel, dan regulator
respon sitoplasma (RESD), (Gbr.2). Sinyal yang terkait dengan pembatasan oksigen dibuat oleh
Perceived Itu mengalami autofosforilasi pada residu histidin dilestarikan. Fosforilasi tingkat RESD
ditentukan oleh keseimbangan antara kegiatan dari kedua hasil sebagai donor fosfat untuk RESD,
dan fosfatase dari RESD terfosforilasi. Di B. membuat cereus strain mutan, penghapusan produksi
enterotoksin yang Diamati pada semua kondisi Diperiksa (Duport et al 2006).
Gambar 8 organisasi Gene dari B. wilayah kromosom cereus mengandung resDE. (Duport et al
2006.)
Penelitian selanjutnya dijelaskan regulator redoks lain Itu mungkin bertindak secara sinergis
dengan ResDE untuk mengontrol fermentasi dan ekspresi gen enterotoksin, menunjukkan itu,
meskipun penting, ResDE tidak penting bagi metabolisme fermentatif dan ekspresi enterotoksin.
Ini regulator transkripsi, yang dikenal sebagai CRP-FNR (fumarat dan regulator reduksi nitrat),
merupakan anggota dari siklik AMP protein reseptor, dan memainkan peran penting dalam
modulasi ekspresi banyak gen metabolisme di beberapa fakultatif atau bakteri anaerob ketat
(Korner dkk 2003). Juga fungsi mereka termasuk pengendalian faktor virulensi (Baltes et al 2005,
Bartolini et al, 2006, Schmiel et al 2000). Selain itu, satu komponen CRP-FNR regulator dikenal
untuk bertindak secara terkoordinasi dengan regulator dua komponen homolog dengan ResDE

sebagai respons terhadap dua sinyal lingkungan: ketersediaan oksigen dan adanya akseptor
elektron alternatif. Protein keluarga CRP-FNR, yang Ditandai dengan domain nukleotida-mengikat
Itu membentang dari ujung N lebih dari 170 residu ke motif struktural helix-turn-helix C-terminal
terletak. Urutan C-terminal pendek dengan empat residu sistein mengikuti domain ini DNA-
mengikat. Tiga residu Cys dari terminal C ini bersama-sama dengan satu residu Cys dari bagian
tengah dari protein untuk mengikat [4Fe-4S] 2 + pusat Itu berfungsi sebagai sensor redoks (Reents
et al 2006). Transkripsi hbl dan NHE secara dramatis (90%) turun-diatur setelah percobaan mutasi
CRP-FNR di B. cereus strain (Duport et al. 2007).
Produksi utama virulensi faktor hemolisin BL (HBL) dan enterotoksin nonhemolitik (Nhe) dalam
makanan-borne patogen B. cereus, Tampaknya diatur melalui mekanisme yang kompleks. Sebuah
penelitian terbaru yang dipimpin oleh Esbelin dan rekan (2009) menjelaskan beberapa aspek dari
B. cereus peraturan virulensi, Menyarankan interaksi ketat antara tiga sistem dijelaskan
sebelumnya. Regulator respon langsung RESD ditunjukkan untuk berinteraksi dengan daerah
promotor dari enterotoksin regulator gen resDE, FNR dan plcR dan gen struktural enterotoksin
NHE dan hbl, tetapi dengan afinitas yang berbeda. Selain itu, fosforilasi negara target hasil RESD
dalam pola ekspresi yang berbeda. Temuan ini menyebabkan kesimpulan Ungkapan enterotoksin
dan metabolisme fermentasi dapat dikontrol secara terkoordinasi pada tingkat transkripsi. Itu juga
jelas mendefinisikan peran ResDE dua komponen sistem, sebagai sentinel mampu merasakan
perubahan redoks, dan mengkoordinasikan tanggapan Itu memodulasi B. virulensi cereus.
3.3 Adanya racun dalam Bacillus spp lainnya.
Dalam beberapa kasus, produksi enterotoksin dari spesies non B. cereus telah dilaporkan. Isolat
B. circulans, B. lentus, B. licheniformis, B. mycoides, B. subtilis dan B. thuringiensis
menunjukkan hasil positif menggunakan assay RPLA komersial (Bacillus cereus enterotoksin
terbalik pasif lateks aglutinasi) untuk mendeteksi komponen L2 dari HBL-kompleks (Beattie &
Williams 1999). Produksi Toksin oleh dua strain lingkungan B. pumilus) dilaporkan oleh Hoult &
Tuxford (1991).
Produksi racun oleh Bacillus spp. lainnya sebagian besar telah dibatasi pada B. thuringiensis,
anggota dari Kelompok B. cereus.
Spesies B. thuringiensis, B. anthracis, B. cereus, berbeda dalam 16S rRNA urutan dengan hanya
sembilan nukleotida, menyebabkan banyak kesimpulan Bahwa ini bisa dianggap satu spesies (Ash
et al. 1991). Perbedaan Fenotipik Dalam kelompok ini sangat sedikit, tapi pola patogenisitas
berbeda secara signifikan. B. thuringiensis, yang ditandai oleh adanya kristal molekul endotoksin
besar yang membentuk selama sporulasi. Racun adalah serangga spasifik, dan beberapa kelas ini
molekul toksin, yang sasaran urutan tertentu serangga, diisolasi (Schnepf et al. 1998). Namun
transfer banyak plasmid conjugative antara Bacillus cereus dan B. thuringiensis ditunjukkan (Yuan
et al., 2007, Van der Auwera et al. 2007). B. cereus dan B. thuringiensis tidak dapat dibedakan
secara ketat atas dasar karakteristik biokimia (Carlson et al, 1994 Damgaard et al 1996 Yamada et
al... 1999). Metode standar untuk mendeteksi B. cereus, gagal membedakan kedua organisme.
Damgaard et al. (1996) terisolasi beberapa strain enterotoksin-memproduksi B. thuringiensis dari

pasta, roti, dan susu. Perani et al. (1998) menemukan 29% dari strain B. thuringiensis yang diisolasi
dari lingkungan yang dihasilkan B. cereus seperti enterotoksin. Dari laporan di atas yang muncul
disebutkan bahwa penyelidikan menyeluruh ke mana-mana gen enterotoksin di berbagai Bacillus
spp. belum sampai dilakukan. Sedikit perhatian telah dibayar, baik dalam sistem model atau
lingkungan makanan, untuk menilai kondisi itu dapat mendukung ekspresi racun isolat non-B.
cereus.
4. Bacillus thuringiensis
4.1 Karakteristik umum
Bacillus thuringiensis, seperti makanan-borne dan berkesempatan patogen Bacillus cereus,
termasuk Famili Bacillus cereus sensu latu. Pada tahun 1901 seorang ahli biologi Jepang, Ishiwata
Shigetane, Ditemukan bakteri yang sebelumnya tidak digambarkan sebagai agen penyebab
penyakit pada ulat sutera. B. thuringiensis awalnya Dianggap beresiko untuk pemeliharaan ulat
tetapi telah menjadi jantung pengendalian serangga mikroba. Hal ini dapat membentuk sebuah
Kristal parasporal selama fase stasioner pada siklus pertumbuhan dan pada awalnya ditandai
sebagai patogen serangga. Pada tahun 1956, T. Angus menunjukkan bahwa aktivitas insektisida
yang dikaitkan sebagian atau seluruhnya (Tergantung pada serangga) untuk inklusi protein kristal
terbentuk dalam proses sporulasi. Pengamatan ini menyebabkan pengembangan bioinsektisida
berdasarkan B. thuringiensis untuk mengendalikan spesies serangga tertentu, terutama di kalangan
perintah Lepidoptera, Diptera, dan Coleoptera. Produksi komersial awal Mulai di Perancis pada
tahun 1938 dengan nama Sporeine. Pada tahun 1982, Gonzalez dkk. mengungkapkan gen yang
mengkode kristal protein dipendam pada plasmid yang ditransmisikan. Schnepf dan Whiteley
(1981) merupakan orang pertama yang menandai dan mengkarakterisasi kode gen kristal protein
(cry) dari plasmid DNA dari B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, yang toksik untuk larva
tembakau. Bakteri ini dengan cepat menjadi kepentingan komersial sebagai alternatif yang
bermanfaat atau suplemen untuk pestisida kimia sintetis dalam kehutanan dan pertanian, dan
sekarang yang paling luas digunakan biologis yang dihasilkan agen pengendalian hama. Pada tahun
1995 bioinsektisida berbasis B. thuringiensis diwakili sekitar 2% dari total pasar insektisida global.
4.2 Ekologi dan serotipe
B thuringiensis tampaknya menjadi menghuni pada kebanyakan lingkungan (Chaufaux et al, 1997
Martin et al.. 1989). Strain telah diisolasi di seluruh dunia dari berbagai habitat, termasuk tanah
(Hastowo et al.1992, Martin et al., 1989), serangga (Carozzi et al 1991), debu produk yang
disimpan (Burges dkk 1977 Meadows. Et al. 1992) . Isolasi biasanya melibatkan pemilihan
perlakuan panas untuk spora. Studi pada spora B. thuringiensis secara terus menerus di
laboratorium, lapangan atau hutan lingkungan mengungkapkan bahwa, meskipun penurunan cepat
dalam populasi dan toksisitas telah tercatat, spora B. thuringiensis dapat bertahan hidup selama
bertahun-tahun setelah penggunaan semprot (Addison et al. 1993).
Untuk identifikasi dan klasifikasi strain H serotipe B. thuringiensis, berdasarkan reaksi imunologi
terhadap antigen flagellar bakteri, flagellin, telah ditetapkan sebagai metode mengetik (de Barjac et
al. 1962). Saat ini, bermacam-macam strain B. thuringiensis diklasifikasikan ke dalam 69 serotipe

H yang berbeda (Lecadet et al. 1999) dan 13 kelompok sub-antigenik, memberikan 82 serovars,
telah didefinisikan sebagai subspesies. Meskipun serotipe adalah metode yang paling umum
digunakan klasifikasi seluruh dunia, ia memiliki keterbatasan karena mencerminkan hanya satu
karakteristik dari spesies dan bukti diandalkan sebagai prediktor aktivitas insektisida. Produksi
kristal parasporal, yang mendefinisikan kualitas B. thuringiensis, masih terlalu sempit kriteria
untuk klasifikasi taksonomi (Lysenko et al. 1983). Keseringan isolasi dari strain serotipe yang sama,
beberapa strain baru, memiliki bawaan gen cry yang tidak diketahui sebelumnya, juga
menunjukkan bahwa serotype H mungkin tidak cukup untuk mewakili karakteristik molekul dari
spesies B. thuringiensis.
4.3 B. protein Cry thuringiensis
Toksin Cry masing-masing individu memiliki spektrum didefinisikan dari aktivitas insektisida,
biasanya terbatas pada beberapa spesies dalam satu urutan tertentu Lepidoptera (kupu-kupu dan
ngengat), Diptera (lalat dan nyamuk), Coleoptera (kumbang dan kumbang) dan nematoda.
Isolat alam B. thuringiensis dapat menghasilkan beberapa kristal protein yang berbeda, kombinasi
tertentu protein Cry telah ditunjukkan untuk menunjukkan efek sinergis. Di sisi lain spesifisitas
target yang berbeda bisa lebih mungkin tidak diinginkan, (Hofte et al, 1989, Lambert et al. 1992.).
Racun awalnya diklasifikasikan menjadi empat kelas menurut homologi urutan asam amino dan
kekhususan insektisida (Hofte et al. 1989). Racun CryI adalah racun bagi lepidopterans, CryIIs
beracun bagi lepidopterans dan Diptera, CryIIIs beracun bagi coleopterans, CryIVs beracun bagi
Diptera. CryV dan kelas CryVI, ditambahkan untuk racun aktif terhadap nematoda (Feitelson et
al. 1992). Setiap protoxin baru ditemukan, memperoleh nama terdiri dari Cry mnemonic dan
empat peringkat hirarkis (terdiri dari nomor) (misalnya, Cry25Aa1) Tergantung pada tempatnya
dalam pohon filogenetik (Crickmore et al. 1998).
Penemuan berkelanjutan gen toksin B.thuringiensis baru dan cepat terakumulasi informasi tentang
kegiatan insektisida mereka telah mendorong pembangunan data pada "khususnya Bt toksin":
"spesifik pada data racun Bacillus thuringiensis " Http://www.glfc.cfs.nrcan.gc.ca/Bacillus. Daftar
500 delta-endotoksin dengan nama jalur akses yang sesuai untuk urutan Database NCBI, tersedia
dalam situs ini, spesifisitas biologis adalah juga komponen nomenclatures asli.
4.4 Mode tindakan B. protein Cry thuringiensis
Selama proses sporulasi, sel B. thuringiensis memproduksi inklusi kristal parasporal yang
mengandung polipeptida (δ-endotoksin). Ini protoxins, plasmid dikodekan oleh gen cry, massa
molekul hadir berkisar 50-140 kDa dan beracun untuk varietas spesies serangga
(Angsuthanasombat et al. 1993). Setelah diminum oleh larva serangga rentan, ini inklusi solubilised
dalam lingkungan alkalin midgut dan proteolitik dicerna untuk melepaskan fragmen beracun
(Brown et al. 1990). Selama aktivasi proteolitik ini, δ-endotoksin mereka menjalani proteolisis yang
luas di kedua C dan N termini untuk menghasilkan matang Itu bagian beracun memiliki massa
molekul 60 kDa Sekitar. Sebuah proses multistage secara umum diterima untuk menggambarkan
cara kerja dari Cry toksin. Pertama, racun diaktifkan, kemudian melewati matriks peritrofik,
mengikat reseptor yang sangat spesifik yang terletak pada membran microvillus apikal sel epitel

midgut (Bravo et al. 1992 Hofmannet al. 1988). Setelah toksin mengikat reseptor, perubahan
dalam konformasi toksin itu, memungkinkan racun penyisipan ke membran. Mungkin, Menyusul
oligomerisasi, yang oligomer toksin menginduksi pembentukan pori litik dalam membran epitel
midgut Itu Itu menyebabkan lisis osmotik sel, penghentian makan, dan kematian larva (Sacks et al
1986 Lorence et al.. 1995 ). Mengikat reseptor merupakan faktor kunci dalam kekhususan Cry
diaktifkan racun mudah Racun yang aktif berikatan dengan reseptor spesifik di perbatasan sikat
apikal mikrovili midgut. Dua serangga yang berbeda Telah Diidentifikasi protein sebagai reseptor
untuk racun Cry: 120-kDa aminopeptidase N (APN), dari Juga disebut Cry1Ac protein toksin-
mengikat, dan 210-kDa cadherin seperti glikoprotein, disebut Cry1Ab protein toksin-mengikat,
masing-masing dimurnikan dari sikat vesikel perbatasan rentan. Glikolipid Serangga ini juga telah
disarankan sebagai reseptor pada nematoda (Griffitts et al. 2005). Data terakhir menunjukkan
Itulah berkorelasi toksisitas dengan mengikat ireversibel Itu bisa mencerminkan interaksi ketat
toksin dengan reseptor atau mungkin berkaitan dengan penyisipan racun ke dalam membran
(Liang et al. 1995).
Gbr.9 modus Usulan tindakan untuk Cry toksin
4.5 Mekanisme transkripsi dari gen cry
Ekspresi gen cry yang dianggap sporulasi sebagian besar tergantung. Perkembangan sporulasi,
dikontrol pada tingkat transkripsi oleh aktivasi selanjutnya σ-faktor, yang mengikat RNA
polimerase inti untuk memungkinkan transkripsi dari promotor sporulasi-spesifik. σA merupakan
faktor sigma utama sel vegetatif, lima faktor yang disebut σH, σF, σE, σG, dan σK, Muncul agar
secara temporal diatur Selama pengembangan B. thuringiensis siklus sel. Beberapa promotor gen
cry Telah Diidentifikasi, dan urutan mereka Telah ditentukan sebelumnya (Yoshisue et al 1993
Dervyn et al. 1995, Brizzard et al. Tahun 1991, Brown et al. 1993.). Urutan konsensus Diakui oleh
B thuringiensis polimerase RNA yang mengandung σE atau σK, ditemukan setelah penyelarasan
daerah promoter gen ini (Agaisse et al 1995 Baum et al. 1995.). Hasilnya Itu Kemungkinan akan
σE atau σK-dependen. Low-level menangis gen transkrip Telah terdeteksi Juga Selama fase transisi
B. thuringiensis siklus biologis, yang berlangsung sampai timbulnya sporulasi (Poncet et al, 1997

Yoshisue et al.. 1995). Diperkirakan Ungkapan ini mungkin dua sampai RNA polimerase σH, dan
disarankan Itu Spo0A merepresi ekspresi ini fase transisi lemah, Ketika sel memasuki fase
sporulasi (Poncet et al. 1997). Salah satu kasus gen cry Dinyatakan Selama pertumbuhan vegetatif
digambarkan (Malvar et al. 1994 Sekar et al. 1988). The cry3Aa ekspresi gen, terisolasi dari B.
coleopteran-aktif thuringiensis var. tenebrionis Sepertinya To diaktifkan dengan mekanisme non-
sporulasi-dependen. The cry3Aa gen promotor, promotor Menyerupai Diakui oleh sigma faktor
utama dari sel vegetatif, σA.
4.6 Pengembangan B. biopestisida thuringiensis
Insektisidal B. Pertama produk thuringiensis yang diperdagangkan di Perancis pada akhir 1930-an
(Lambert et al. 1992). Pada tahun 1995 Badan Perlindungan Lingkungan AS (EPA) terdaftar
produk Bt berbasis 182, tetapi pada tahun 1999 merupakan kurang dari dua persen dari total
penjualan semua insektisida (Carpenter et al., 2001, EPA et al, 2001). Seperti hama serangga telah
menjadi resisten terhadap insektisida kimia. Penggunaan Bt telah sangat meningkat. Seperti
dilansir Beegle dan Yamamoto (Beegle et al., 1992), formulasi Bt awal disajikan beberapa masalah.
Standardisasi didasarkan pada jumlah spora daripada potensi, produk yang terkandung Sering
subsp. thuringiensis potensi rendah.
Setelah verolyping dari Kurstaki HD-1 oleh Barjac dan Lemille, B. ini supsp thuringiensis.
Menjadi dasar bagi produk-produk kompetitif dengan insektisida kimia untuk kinerja dan biaya.
Selama bertahun-tahun, semua B. perusahaan hanya menghasilkan subsp thuringiensis. kurstaki.
Namun, varietas lain,: seperti Coleoptera-aktif Bt subsp. Tenebrionis (Krieg et al., 1983) dan subsp
Diptera-aktif. israelensis (Goldberg et al., 1977), telah datang untuk digunakan di seluruh dunia
untuk mengontrol larva hama. Hari B. thuringiensis subsp. aplikasi israelensis terdiri dari hingga
50% dari semua aplikasi insektisida. Karya-karya yang relevan skrining dan isolasi baru B. strain
thuringiensis dilakukan Selama bertahun-tahun, akhirnya mengakibatkan produksi produk
komersial serangga tertentu. Beberapa yang paling sering digunakan tercantum dalam tabel 2.

DISTRIBUSI DAN EKSPRESI GEN PROFIL KODE UNTUK Bacillus cereus DI enterotoksin
Bacillus thuringiensis Strain KEPENTINGAN UMUM
Bab 2
1. Pengantar
Bacillus thuringiensis adalah gram-positif, membentuk spora bakteri di mana-mana dikenal untuk
menunjukkan aktivitas insektisida spesifik terhadap serangga tertentu, terutama dalam perintah
Lepidoptera, Diptera, dan Coleoptera, membentuk kristal parasporal Selama fase stasioner siklus
pertumbuhannya: Ini racun, yang disebut protein kristal (protein Cry) atau δ-endotoksin, yang
dikode oleh plasmid yang berbeda gen cry-jenis. Banyak gen yang berbeda pengkodean B.
endotoksin thuringiensis Telah diisolasi dan Ditandai. Kekhasan tinggi dari protein Cry terhadap
serangga adalah Terutama dua dengan reseptor spesifik dalam usus serangga, yang tidak hadir
dalam usus mamalia: Oleh karena Dianggap Racun ini tidak berbahaya bagi manusia. Karena
aktivitas spesifik terhadap serangga dan dampak lingkungan yang minimal, Bacillus thuringiensis
digunakan secara luas di seluruh dunia sebagai pestisida di bidang kehutanan dan pertanian sebagai
alternatif yang bermanfaat atau suplemen untuk pestisida kimia sintetis (Schnepf et al 1998.): Oleh
karena itu dari besar komersial bunga.
Bacillus thuringiensis, seperti bawaan makanan dan manusia oportunistik patogen B. cereus,
Bacillus cereus sensu Milik keluarga Latu.

Hal ini dikenal Itu B. cereus dikaitkan dengan dua bentuk keracunan makanan manusia, muntah
dan sindrom diare, mekanisme patogenik dari sindrom muntah adalah contoh khas keracunan
makanan: B. cereus dapat tumbuh dalam konsumsi pangan sebelum memproduksi toksin emetik
(cereulide), terhadap panas dan pH yang stabil dodecadepsipeptide melingkar Itu mengganggu
produksi energi oleh mitokondria, melewati membran mitokondria dan mendorong vakuolisasi sel
(Mikkola et al. 1999). Gejala utama adalah mual dan muntah, mirip dengan gejala Disebabkan
oleh Staphylococcus aureus enterotoksin (Granum dan Lund, 1997). The Diarrhoeal syndrome
adalah contoh khas dari toxicoinfection, Disebabkan oleh enterotoksin setelah menelan makanan
yang terkontaminasi dengan Bacillus cereus, para enterotoksin mempengaruhi lapisan epitel usus
kecil menyebabkan terganggunya transportasi zat terlarut air: hal ini dapat menyebabkan diare dan
kram perut Dalam 8-16 jam setelah konsumsi makanan yang terkontaminasi. Setidaknya empat
enterotoksin yang berbeda Telah Ditandai: tiga-komponen haemolysin BL (HBL), non-hemolitik
enterotoksin E (NHE), satu-komponen hemolitik racun CYTK dan bc-D-THT enterotoksin T
(Granum dan Lund 1997, Hansen et al., 2003).
The tripartit hemolitik panas labil enterotoksin HBL, adalah produk dari operon Itu termasuk
HBLA, hblD, dan gen hblC, masing-masing yang menyandikan subunit mengikat (B) dan L1 dan
L2 litik komponen (Phelps et al, 2002). Subunit dari B. cereus 41
Bab 2
NHE Juga mencakup dua komponen litik, NH1 dan NH2, dan produk gen ketiga That Remains
uncharacterized. Sebuah enterotoksin ketiga, yang disebut SM-D-THT Telah dijelaskan,
merupakan komponen protein enterotoksin tunggal dengan aktivitas terhadap permeabilitas
pembuluh darah, terdiri dari satu subunit 41-kDa: peran yang tepat dari racun ini masih belum
jelas dibandingkan dengan apa yang diketahui tentang enterotoksin HBL dan NHE. Sebuah
enterotoksin keempat, cytotoxin K (CYTK), adalah ons racun komponen tunggal dilaporkan
terlibat masuk ke rumah keracunan makanan parah Itu Disebabkan kematian tiga orang (Lund et
al. 2000).
Penelitian terbaru Menunjukkan Bahwa penentu yang paling genetik ini Telah sering ditemukan
tidak hanya di B. strain cereus, tetapi juga masuk B. strain thuringiensis (Gaviria Rivera et al. 2000
Hansen dan Hendriksen, 2001), sedangkan toksin emetik, siapa sintetase klaster gen terletak pada
virulensi pXO1 seperti plasmid, Telah ditemukan di kedua B. cereus dan B. strain
weihenstephanensis (Thorsen et al., 2006), tetapi tidak untuk saat ini di B. thuringiensis (Ehling-
Schulz et al., 2006). Metode biokimia dan morfologi klasik bakteri mengklasifikasikan telah gagal
untuk membedakan B. dari B. thuringiensis Yang cereus yang terkait erat dan tidak bisa dibedakan
kecuali phenotipically dan genetik Bahwa mantan pelabuhan insektisida plasmid (Schnepf et al,
1997, Logan et al., 1984, Imam dkk. 1988). Namun, transfer banyak plasmid conjugative antara
Bacillus cereus sensu Latu keluarga yang Menunjukkan (Yuan et al., 2007, Van der Auwera et al.
2007) khususnya antara B. cereus dan B. thuringiensis dalam tanah, larva serangga, media kultur
dan bahan makanan (Battisti et al.1985, Yuan et al., 2007, Van der Auwera et al. 2007). Meskipun
ini pengetahuan, Karena kegiatan yang kuat insektisida, produk perlindungan tanaman
berdasarkan strain terpilih B. thuringiensis yang digunakan di seluruh dunia dalam produksi buah-
buahan dan sayuran di rumah kaca dan di lapangan.

B. Memiliki strain thuringiensis Berkunjung terisolasi dari pasta, PAOK roti dan susu (Damgaard
et al., 1996), beberapa siap-untuk-makan makanan (Rosenquist et al., 2005), buah-buahan dan
sayuran (Frederiksen et al., 2006) segar, serta dari kubis untuk konsumsi manusia (Hendriksen dan
Hansen 2006), sejak Beberapa Tentu ini strain terisolasi tidak bisa dibedakan dari B. komersial
thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, ini menyarankan strain ini mungkin residual dari biopestisida
diterapkan dalam bidang (Frederiksen et al., 2006, Hendriksen dan Hansen, 2006). Kapasitas
bakteri ini membentuk partikel aktif sangat resisten, yang disebut spora, Memungkinkan mereka
untuk bertahan hidup dalam kondisi ekstrim, dan Sepanjang garis manufaktur. Dekade terakhir,
Ketika preferensi konsumen telah bergeser ke makanan ringan olahan, peluang baru muncul
untuk membentuk spora patogen dan pembusuk
42
Bab 2
organisme. Pelestarian pangan saat ini hanya cukup sukses melawan spora, aplikasi perawatan
ringan dalam pengolahan makanan mungkin tidak cukup untuk menghilangkan spora Itu dalam
kondisi yang menguntungkan, dapat berkecambah, tumbuh sel-sel vegetatif dan memproduksi
beberapa faktor virulensi. Dengan mempertimbangkan temuan ini dan sebelumnya ini
pertimbangan, maka bisa dipastikan Bahwa kehadiran B. thuringiensis dalam bahan makanan dan
dampaknya terhadap keamanan pangan masih waran penyelidikan lebih lanjut.
Tujuan dari bagian pertama dari penelitian ini adalah isolasi strain B.thuringiensis, Bioinsektisida
dari produk komersial, untuk menyelidiki distribusi gen penyandi B. cereus seperti enterotoksin,
enterotoksin untuk mengevaluasi profil ekspresi dan untuk menilai keberadaan protein Sesuai.
Kemudian model makanan, nabati, dikembangkan untuk mengevaluasi perilaku B. spora
thuringiensis artifisial ditambahkan ke matriks makanan, setelah simulasi pengobatan industri
pengolahan. SEM SEM dan teknik X-ray digunakan untuk mengikuti tren B. thuringiensis siklus
biologis, dari spora aktif ke sel vegetatif. Perubahan morfologi dalam struktur spora-diamati dan
dijelaskan secara rinci, pada waktu yang berbeda Selama proses perkecambahan. Dalam rangka
untuk Mencapai informasi lebih lanjut tentang struktur spora internal kami mencoba untuk teknik
pelapisan SEM karbon; analisis SEM X-ray digunakan untuk menguji pelepasan kalsium dari DPA
B. spora thuringiensis Yang merupakan salah satu peristiwa awal dari proses perkecambahan.
2. Bahan dan metode
2.1 strain bakteri isolasi
Strain Bacillus thuringiensis yang Diperiksa dalam penelitian ini diisolasi dari Berikut isecticidal
komersial bio-produk: Delfin, BAC, VectoBac DT, Lepinox, Rapax, Jack pot, B 40, Biolarkim 14,
Thuricide HPC PRO Dipel.
Setelah resuspending dalam air steril, pengenceran desimal bubuk insektisida komersial, BCA
berlapis di piring media selektif (Bacillus Cereus Basis Agar), dan diinkubasi pada suhu 30 ° C
hingga 72 jam, untuk strain bakteri isolasi.
Inklusi kristal yang diamati oleh mikroskop fase kontras dalam semua produk yang diuji. Untuk
semua analisis selanjutnya, B.thuringiensis strain terisolasi dikultur pada Otak Jantung Infusion
(BHI) broth pada 37 ° C, terus gemetar, atau di BHI pelat agar media pada 37 ° C.
43

Bab 2
2.2 ekstraksi DNA untuk PCR dan REP
Untuk persiapan DNA, bakteri terisolasi dikultur pada Otak Jantung Infusion (BHI, OXOID)
kaldu dan diinkubasi semalam pada suhu 37 ° C, pada gemetar terus menerus. DNA genom untuk
sidik jari dan analisis profil toksin, diekstraksi dari 1,0-ml aliquot budaya dengan menggunakan
FTA Starter Pack (Whatman) Sesuai dengan instruksi dari pabriknya.
2.3 Deteksi protein kristal
B. isolat thuringiensis berlapis pada BHI dan kemudian diperiksa untuk kehadiran kristal
intraseluler dengan mikroskop fase kontras, setelah pertumbuhan selama 2-3 hari pada suhu 30 °
C. PCR analisis yang yang dilakukan untuk mendeteksi gen toksin insektisida dari semua isolat
yaitu X62821 sepasang primer Fuping dilaporkan oleh Song et al. 2003
5'GCTGTCTACCATGATTCGCTTG3 ', 5'CAGTGCAGTAACCTTCTCTTGCA3' digunakan
untuk mengamplifikasi daerah lestari cry1I-jenis gen, yang Dipla
5'CAAGCCGCAAATCTTGTGGA3 'dan DiplB 5'ATGGCTTGTTTCGCTACATC3' primer
digunakan untuk cryIV September deteksi gen (Carozzi et al. 1991 ). Amplifikasi adalah dilakukan
dalam Mastercycler Ep Gradient S Eppendorf PCR untuk 32 siklus pada 94 ° C selama 1 menit,
52 ° C selama 1 menit, dan 72 ° C selama 5 menit. PCR reaksi campuran ini dielektroforesis pada
0,8% gel agarosa di TAE1X buffer dengan SYBR DNA gel Aman noda (Invitrogen) ®.
2,4 berulang extragenic palindromic urutan DNA (REP)
Berulang palindromic extragenic (REP) PCR menggunakan (GTG) 5 primer digunakan untuk
mengidentifikasi Bacillus thuringiensis isolat pada tingkat regangan.
Reaksi REP-PCR adalah dilakukan dalam total volume 25 l dengan 10ng DNA, 0.5μM primer dan
PCR Master mix (Promega). Amplifikasi dilakukan dalam Mastercycler Ep Gradient S
(Eppendorf) sebagai berikut: denaturasi awal pada 95 ° C selama 7 menit, Diikuti oleh 30 siklus
pada 90 ° C selama 30 detik, 40 ° C selama 1 menit dan 65 ° C selama 8 menit , dan perpanjangan
terakhir pada 65 ° C selama 16 menit. Profil hasil pengamatan Menganalisis pada 2% gel agarosa di
TAE1X dengan SYBR ® DNA gel Aman noda (Invitrogen) dan tangga 100 basis poin (Promega
korporasi) dimuat untuk standar berat molekul.
44
Bab 2
2.5 Deteksi gen yang mengkode enterotoksin
PCR digunakan untuk mengkarakterisasi profil toksin dari strain Bacillus thuringiensis yang
diisolasi dari bio-insektisida. Urutan primer yang dijelaskan sebelumnya dalam sebuah penelitian
yang dilakukan pada tahun 2001 oleh Hansen dan Hendriksen, digunakan untuk mendeteksi gen
penyandi produksi dari masing-masing enterotoksin HBL, NHE dan bc-D-THT. Primer dan
kondisi dijelaskan oleh Swiecicka dan Mahillon CYTK dipekerjakan untuk deteksi gen,
September primer tercantum dalam Tabel 2. Analisis PCR yang dilakukan dalam total volume
25μL Itu berisi 5NG DNA, 0.5μM primer masing-masing dan GoTaq Hijau Master Mix
(Promega). Reaksi dilakukan dalam Mastercycler Ep Gradient S (Eppendorf) dengan denaturasi
awal dari 5 menit pada 95 ° C, Diikuti oleh 30 siklus PCR setiap Terdiri 15 s pada 94 ° C, 45s pada
suhu anil (Dinyatakan dalam Tabel 2 untuk setiap pasangan primer ) dan 1 menit pada 72 ° C,

ekstensi akhir adalah 7 menit pada 72 ° C. PCR reaksi campuran ini dielektroforesis pada gel
agarosa 1% di TAE1X buffer dengan SYBR ® DNA gel Aman noda (Invitrogen), dan difoto.
Tabel 1. Primer ditetapkan untuk deteksi gen B.thuringiensis enterotoxic di strain terisolasi. Untuk
HBL dan NHE kompleks, analisis PCR diamplifikasi dilakukan untuk setidaknya dua gen di
kedua tiga komponen operon: gen hblC dan hblD untuk toksin hemolitik, dan nheB nheC gen
untuk toksin non-hemolitik.
Gen
Nama Primer
SEQ (5'-3 ')
Temperatur anil
Produk amplifikasi
Fw L2A
AATGGTCATCGGAACTCTAT-5'-3 '
hblC
L2B Rv
CTCGCTGTTCTGCTGTTAAT-5'-3 '
52
749pb
HBLD-N
AATCAAGAGCTGGTCACGAAT-5'-3 '
hblD
HBLD-C
CACCAATTGACCATGCTAAT-5'-3 '
51
429pb
nheB 1500 S Fw
CTATCAGCACTTATGGCAG-5'-3 '
nheB
nheB 2269 Rv A
ACTCCTAGCGGTGTTCC-5'-3 '
50
769pb
nheC 2820 S Fw
CGGTAGTGATTGCTGGG-5'-3 '
nheC
nheC 3401 Rv A
CAGCATTCGTACTTGCCAA-5'-3 '
50
581pb
BCET-N
TTACATTACCAGGACGTGCTT-5'-3 '

BCET
BCET-C
TGTTTGTGATTGTAATTCAGG-5'-3 '
53
428pb
cytKf
GATAATATGACAATGTCTTTAAA-5'-3 '
CYTK
cytKr
GGAGAGAAACCGCTATTTGT-5'-3 '
52
617pb
2,6 persiapan RNA
Untuk ekstraksi RNA, strain terisolasi ditumbuhkan semalam pada suhu 37 ° C Otak Jantung
Infusion (BHI) broth dalam kondisi anaerob, sampai sel mencapai fase stasioner pertumbuhan.
Setelah sentrifugasi 1.0-ml aliquot budaya, pelet diobati dengan 2,0 ml RNA Lindungi Bakteri
Reagen (Qiagen) solusi dan disimpan pada suhu -20 ° C. Total RNA diekstraksi menggunakan
RNeasy kit Mini (Qiagen) Menurut petunjuk produsen. Kuantifikasi RNA total dilakukan dengan
Ultrospec 2100 pro
45
Bab 2
Amersham Biosciences spektrofotometer setelah pengobatan enzimatik dengan DNase (Ambion)
selama 30 menit pada 37 ° C.
2.7 Analisis ekspresi racun dengan RT-PCR
Terbalik transkripsi (RT) dilakukan dengan menggunakan 1 ng RNA total dari Bacillus
thuringiensis sel strain komersial. Untuk menguji keberadaan mRNA coding untuk racun gen yang
sebelumnya terdeteksi oleh PCR (hblB - hblC, nheB - nheC, CYTK, BCET), VersoTM 1-
Langkah RT-PCR Reddy MixTMKit (Thermo Scientific) protokol yang digunakan.
2,8 uji enterotoksin
UC10070 Bacillus thuringiensis var. kurstaki, diuji untuk kemampuan untuk produk enterotoksin
diare HBL (hemolitik fraksi L2) dengan pasif uji aglutinasi lateks terbalik menggunakan BCET-
RPLA racun kit deteksi (Oxoid). Setelah 1% inokulum B. regangan thuringiensis di BHI broth,
dan inkubasi pada 37 ° C selama 18 jam pada gemetar (250 siklus / menit), budaya disentrifugasi,
supernatant adalah steril disaring dan disimpan pada suhu -20 ° C sampai tes dilakukan Mengikuti
instruksi produsen ' .
2.9 Produksi Spora
UC10070 Bacillus thuringiensis var. kurstaki, dipilih untuk menghasilkan spora untuk percobaan
Setelah dalam penelitian ini. Pertumbuhan dan kepadatan frekuensi sporulasi awalnya
Dibandingkan dengan menggunakan Berikut tiga media agar: BHI menengah (OXOID, UK),
Susu Peptonised (susu 1% peptonized, 1% dextrose, 0,2% ekstrak ragi, 1,216 mM MgSO4, FeSO4
0.072 Mm, 0139 mM ZnSO4, MnSO4 0.118mM). BP menengah (Bacillus Genetika Stock

Center, Ohio State University) 0,7% Bactopeptone (Difco), 0,68% KH2PO4, 0,012% MgSO4,
1,7% agar, 1,216 mM MgSO4, FeSO4 0.072 Mm, 0,139 mM ZnSO4, MnSO4 0.118mM,
Glukosa 0,3%.
PH Susu Peptonised dan BP menengah, disesuaikan dengan 7.0 dengan garam KOH
ditambahkan pada 55 ° C setelah sterilisasi dengan autoklaf.
Pelat dengan masing-masing media Dianggap tiga, diinokulasi dengan 500μl B. thuringiensis
UC10070 budaya semalam, dan diinkubasi selama 4 hari pada suhu 37 ° C. Spora dipanen dan
dimurnikan dengan pencucian dengan air MilliQ pada suhu 4 ° C.
Tanaman spora diperiksa dengan mikroskop fase kontras untuk kehadiran sel vegetatif, spora
berkecambah, dan puing-puing. Untuk memperkirakan jumlah spora
46
Bab 2
terbentuk, Volume 1-ml suspensi spora kemudian Ditempatkan dalam tabung 1,5 ml, dipanaskan
pada suhu 60 ° C selama 20 menit, diencerkan dan disebar pada BHI agar. Koloni-koloni dihitung
setelah 12 jam pertumbuhan pada suhu 37 ° C.
10.2 Model persiapan Makanan
Tiga krim UHT komersial berdasarkan lada sayuran, artichoke dan bayam, dan satu pasteurisasi
Pure, diperparah dari cukini, kentang dan susu, diuji dengan tujuan mengidentifikasi yang terbaik
untuk mendukung pertumbuhan mikroorganisme objek penelitian ini. The UHT krim sayuran
komersial (20 ml) yang dibagikan ke tabung steril dan disimpan pada - 20 ° C.
Cukini segar dan kentang, dicuci, dipotong, dikupas, dan ditambahkan ke susu UHT dengan
perbandingan 03:01:01, campuran Memperoleh, Dinamakan CPM, dipanaskan pada 100 ° C
selama 15 menit, dan dibagikan ke tabung steril dengan tingkat 20 ml sebelum membeku pada - 20
° C.
Sebelum Melanjutkan dengan percobaan, nilai pH dan aw pada empat campuran sayur tercatat.
Setelah inokulum dalam empat matriks sayuran dengan 107 cfu / ml B. sel thuringiensis,
kemampuan pertumbuhan B. thuringiensis akan dipantau oleh plat menghitung Otak Jantung
Infusion hingga satu minggu penyimpanan pada 4 ° C dan suhu kamar.
2.11 B. thuringiensis spora uji perkecambahan dalam model makanan
Dalam langkah ini pekerjaan, model CPM diuji untuk B. thuringiensis spora uji perkecambahan.
Resep dari model CPM telah diubah dengan menambahkan agar bakteriologi yang konsentrasi 15g
/ l campuran dicampur, dipanaskan pada 100 ° C selama 15 menit, dan kemudian dibagikan dalam
20 ml piring. Setelah penyebaran 100 l dari 107 cfu / ml B. spora thuringiensis, piring CPM
disimpan anaerob dengan Anaerocult ® A foil tas mini dan perlakuan panas selama 15 menit pada
70 ° C, untuk mengaktifkan spora. Proses perkecambahan dipantau oleh mikroskop fase kontras:
pengamatan yang dilakukan pada spora, tumbuh melampaui spora, vegetatif dan bersporulasi sel:
Khususnya pada 10 ', 40', 2 jam, 12 jam dan 24 jam setelah aktivasi panas.
47
Bab 2
2.12 Preparasi sampel untuk pemindaian mikroskop elektron (SEM)

Sampel untuk pemindaian mikroskop elektron (SEM) disusun sebagai berikut: bagian persegi
sekitar 1 cm setiap sisi model makanan setelah inokulum dengan suspensi spora, diambil dari
setiap piring di kali terdaftar sebelumnya Selama proses perkecambahan. Mereka kemudian
dehidrasi bertahap dalam etanol 50%, 75%, 95%, dan akhirnya 100%, masing-masing untuk
bermalam pada suhu kamar. Pengeringan titik kritis dilakukan dalam CPD030 pengering Baltec.
Ketika lapisan karbon digunakan, spesimen terpasang pada cakram SEM dan dilapisi dengan
karbon untuk konduktivitas listrik. Akhirnya, mereka-diamati dengan XL30 ESEM pemindaian
mikroskop elektron Philips. Sampel dilapisi emas dibuat seperti dijelaskan di atas dan kemudian
spesimen dilapisi dengan emas untuk konduktivitas listrik seperti yang dijelaskan oleh Palumbo et
al. (2004). Spesimen Dianalisis bawah kedua rendah dan tinggi vakum SEM kondisi: vakum tinggi
3 x 10-4 Pa, 7000 laju pencacahan sebesar 33% waktu mati, waktu tinggal 60 milidetik dan vakum
rendah 1,199 x 102 Pa (Bass et al 2008.).
2.13 X-ray Mikroanalisis
Perkecambahan spora dipelajari dalam sampel dengan cara X-ray Mikroanalisis menggunakan
teknik pelapisan karbon untuk persiapan sampel: spesimen terpasang pada cakram SEM dan
dilapisi dengan karbon untuk konduktivitas listrik. SEM gambar bidang spesimen tunggal (mulai
dari 1-5μm) diambil. X-ray Mikroanalisis kemudian dilakukan dengan menggunakan Philips XL30
ESEM. Unsur-unsur kalsium, fosfor dan belerang masing-masing dideteksi dengan menggunakan
penyebaran energi X-ray Mikroanalisis (EDAX Model Genesis 2000 XMS 60 SEM, Mahwah, NJ
07430, USA) dan detektor (CDU-UTW Shappire, software genesis SEM). Kondisi berperan
Berikut dipertahankan konstan Sepanjang analisis: vakum tinggi 3 x 10-4 Pa, 7000 laju pencacahan
sebesar 33% waktu mati, waktu tinggal 60 msec dan vakum rendah 1,199 x 102 Pa Elemen
Mikroanalisis digunakan untuk mendeteksi variasi dalam kandungan kalsium spora.
3. Hasil
3.1. Karakterisasi B. strain thuringiensis diisolasi
Setelah kultur dari produk bio-pestisida komersial Dianggap dalam penelitian ini, total 10 strain
Bacillus thuringiensis diisolasi (Tabel 3). Bacillus thuringiensis var.
48
Bab 2
kurstaki H3a 3b hadir di BAC, Delfin, Lepinox, Rapax, Jack Pot dan Thuricide HPC; B.
thuringiensis israelensis var H: 14 dan 14 diisolasi dari Biolarkim VectoBac DT, Bacillus
thuringiensis var. kurstaki ABTS-351 PRO dari Dipel DF, Bacillus thuringiensis var. aizawai hadir
dalam B40. Semua isolat dikonfirmasi B. thuringiensis, B. Milik Kelompok cereus, karena konten
mereka dari salah satu protein kristal, divisualisasikan oleh fase kontras mikroskop atau menangis
gen, yang dideteksi oleh PCR. Seperti yang diharapkan, dari 10 isolat, 8 strain positif untuk
menangis-1IA gen, yang hadir dalam komersial digunakan strain B. thuringiensis subsp. kurstaki
dan B. thuringiensis subsp. aizawai. Dalam Penambahan, 2 strain dari 10 B. isolat thuringiensis,
Milik serovar israelensis, positif untuk menangis-4 gen (Tabel 3).
Profil Diperoleh setelah amplifikasi sekuens DNA berulang palindromic extragenic (REP-PCR)
(Gambar 1) menegaskan isolasi tiga B. berbeda thuringiensis serovar dari produk dianalisis: B.
thuringiensis var. kurstaki, B. thuringiensis var. israelensis dan B. thuringiensis var. aizawai.

Tabel 2. Klasifikasi B. strain thuringiensis yang diisolasi dari produk bio-insektisida
Nama komersial bio-insektisida
Strain
Nama
Serotipe
Cry gen
Delfin
B.Thuringiensis var. kurstaki
UC10070
H3a 3b
menangis-1IA
BAC
B. thuringiensis var. kurstaki
UC10071
H3a 3b
menangis-1IA
VectoBac DT
B. thuringiensis israelensis var
UC10072
H14
cryIV
Lepinox
UC10073
H3a 3b
menangis-1IA
Rapax
UC10074
H3a 3b
menangis-1IA
Jack pot
UC10075
H3a 3b
menangis-1IA
B 40
B. thuringiensis var. aizawai
UC10076
-
menangis-1IA

Biolarkim 14
B. thuringiensis israelensis var
UC10077
H14
cryIV
Thuricide HPC
UC10078
-
menangis-1IA
Dipel DF DF PRO
UC10079
ABTS-351
menangis-1IA
.
49
Bab 2
1000500M1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mbp
Gambar 1. Agarose gel elektroforesis REP-PCR. Tampil adalah B.thuringiensis subsp. kurstaki
H3a 3b dari Delfin, Bac, Lepinox, Rapax, Jack pot, (jalur 1, 2, 3, 4, 9), B. thuringiensis subsp.
aizawai dari B40 (jalur 8), isolat dibedakan dari strain Dipel (jalur 10), dan B. thuringiensis
israelensis var dari VectoBac DT dan Biolarkim dan 14 (jalur 5, 6)
3.2. Deteksi dan ekspresi gen di B. enterotoxic strain thuringiensis diisolasi
Analisis PCR menunjukkan Itu Semua B. tersebut strain thuringiensis yang diisolasi dari produk
komersial diuji (Delfin, BAC, VectoBac DT, Lepinox, Rapax, Jack pot, B 40, Biolarkim 14,
Thuricide HPC DiPelPRO) memendam gen enterotoksin HBL dan NHE, serta gen yang
mengkode CYTK dan racun bc-D-THT (Tabel 4).
Untuk memperjelas apakah gen enterotoxic tidak hanya hadir tapi juga Dinyatakan dalam medium
laboratorium, RT-PCR dilakukan pada tiga B. strain thuringiensis setiap Milik serovar berbeda
Mereka terisolasi. Semua empat gen beracun mengakibatkan Diperiksa Dinyatakan pada kondisi
diuji (Tabel 5).
Tabel 3. Deteksi gen enterotoxic dengan analisis PCR pada B. thuringiensis isolat.
n °
Strain diuji
Serotipe
hblC hblD
nheB nheC
CYTK
BCET
5

B. T var. kurstaki
H3a 3b
+ +
+ +
+
+
2
B. t var. israelensis
H14
+ +
+ +
+
+
1
B. t var. aizauwai
-
+ +
+ +
+
+
1
B. t var. kurstaki
ABTS-351
+ +
+ +
+
+
1
B. T var. kurstaki
-
+ +
+ +
+
+
50
Bab 2
Tabel 4. Enterotoxic gen ekspresi B. thuringiensis isolat Dinilai dengan RT-PCR
Gen
Strain diuji
serotipe
hblC hblD nheB nheC CYTK BCET

B. t. var. kurstaki
H3a 3b
+ + + + + +
B. t. var. israelensis
H14
+ + + + + +
B. t var. aizauwai
-
+ + + + + +
3,3 produksi enterotoksin
Produksi komponen L2 enterotoksin HBL, yang terlibat di dalamnya sindrom diare, yang Dinilai
dalam supernatan B. thuringiensis UC10070 kaldu budaya. Kegiatan-diamati enterotoxic,
dilaporkan dalam Gambar 2. Deteksi komponen L2 dari hemolisin BL, memberikan hasil yang
positif di objek strain studi untuk kondisi pertumbuhan diuji.
123456 BCDEFG hLatex controlsensitizedlatex Lateks controlsensitizedlatex
EnterotoxincontrolB. thuringiensisUC10070 budaya
Gbr.2 enterotoksin-Terbalik Pasif reaksi aglutinasi lateks. Wells dari "a" sampai "g" Mengandung
pengenceran sampel, baik "h" adalah kontrol negatif. Baris pertama, menunjukkan reaksi aglutinasi
positif yang dihasilkan oleh enterotoksin kontrol, yang disediakan oleh kit (kontrol negatif Masing-
masing adalah di baris 2). Respon positif dari lateks peka ditambahkan ke B. Jelas budaya
thuringiensis ditampilkan di baris keempat.
3.4 Pemilihan media sporification dan spora produksi
Seperti yang digunakan di seluruh dunia untuk produksi skala besar bio-insektisida, Bacillus
thuringiensis var UC10070. kurstaki, dipilih untuk menghasilkan spora untuk analisis berikut.
Percobaan dilakukan untuk mengidentifikasi media terbaik untuk induksi sporification. Semua tiga
media diuji, spora menghasilkan jumlah tinggi (Tabel 5), sel vegetatif Namun masih terlihat utuh
dalam susu Peptonised dan media BHI. Di Bertentangan Meskipun jumlah yang lebih rendah
Dicapai pada BP agar, hanya sedikit sel vegetatif dan spora berkecambah (kurang dari 1%) yang
diamati dalam media ini, Ketika spora
51
Bab 2
tanaman diperiksa oleh fase kontras. Oleh karena itu, spora dari B. UC10070 thuringiensis
diproduksi dari sel dibudidayakan di BP dengan inkubasi selama 4 hari pada suhu 37 ° C,
Membiarkan Mendapatkan suspensi spora 1,5 x108 cfu / ml.
Tabel 5. Perbandingan efisiensi pertumbuhan B. strain thuringiensis
dalam tiga media. Standar deviasi adalah sebagai berikut: BHI / 7.08 E 08,
Susu / 1,41 Peptonized E 08, BP / 5,63 E +07.
N ° CFU / ml di:
Menyiksa
BHI
Susu Peptonized

BP
B.Thuringiensis UC10070
1,22 E 09
2,57 E +08
1,51 E +08
3.5 Pengembangan Model Makanan
Dalam studi ini empat jenis sayuran yang berbeda matriks diuji untuk kemampuan untuk
mendukung pengembangan komersial B. Setelah spora thuringiensis dan pertumbuhan sel-sel
vegetatif. Analisis kimia dari Faktor utama yang Mempengaruhi pertumbuhan mikroba, pH dan
ketersediaan air bebas (aw), memungkinkan pilihan pertama dari model terbaik untuk digunakan
untuk analisis. Nilai yang diamati tercantum dalam Tabel 6.
Tabel 6. pH dan aw Dinilai parameter dalam
empat sayuran matriks dipertimbangkan. Pepper4.63 0.97Artichoke5.63 0.94Spinach5.94
0.94CPM 5,95 0.97pH aw
Lada krim disajikan nilai optimum aw, sebagai model CMP, tetapi pH Tampak terlalu sempit
untuk mendukung pertumbuhan B. thuringiensis. Krim artichoke dan bayam Menunjukkan nilai
pH yang cocok untuk pengembangan bakteri, tetapi ketersediaan air yang rendah mungkin spora
terbatas perkecambahan dan pertumbuhan sel-sel vegetatif. CPM Menunjukkan nilai-nilai
optimum untuk kedua parameter dianalisis.
52
Bab 2
B. dinamika pertumbuhan thuringiensis pada sayuran yang berbeda Dianggap, dipantau selama
seminggu, kurva pertumbuhan diperoleh dilaporkan dalam angka 3.a dan 3.b.. Beberapa B. strain
thuringiensis dapat tumbuh hingga 55 ° C sementara yang lain dapat tumbuh serendah 4-5 ° C.
Percobaan dilakukan dalam dua kondisi yang berbeda: suhu permisif (suhu kamar) dan satu lagi
membatasi (8 ° C), hanya untuk menguji kemampuan B. UC10070 thuringiensis, tumbuh dalam
model makanan bahkan pada suhu lemari es. Jelas, perbedaan relevan yang ditemukan dalam
kinetika B. thuringiensis ditentukan dalam setiap kondisi.
Hasil menegaskan Itu bisa Berkontribusi suhu kamar dinamika pertumbuhan yang lebih tinggi dari
B. thuringiensis, suhu serendah 8 ° C menunda terjadinya pertumbuhan bakteri tetapi tidak
menangkap B. tersebut thuringiensis siklus biologi, karena dapat diamati oleh meratakan kurva
kinetika. Seperti yang diharapkan CPM menghasilkan yang terbaik untuk mendukung
pertumbuhan B. sel thuringiensis, pH rendah, Tampak parameter yang paling membatasi untuk
pengembangan mikroorganisme, seperti yang ditunjukkan oleh kurva kematian sel pada tanaman
cabai krim.
Pertumbuhan bt dalam model makanan di RT1, 00E +001,00 E E +011,00 +021,00 +031,00 E E
E +041,00 +051,00 +061,00 E E E +071,00 +081,00 E 09 T0T 24hT 48hT 72hT 7daysBt UFC /
mlartichokepepperspinachCPM
A
53
Bab 2

Pertumbuhan bt dalam model makanan di 8 ° C1, 00E +001,00 +011,00 E E E +021,00 +031,00
+041,00 E E E +051,00 +061,00 +071,00 E E E +081,00 09 T0T 24hT 48hT 72hT 7daysBt UFC
/ mlartichokepepperspinachCPM
B
Gambar 3 Kinetika pertumbuhan B. thuringiensis Diamati dalam empat campuran sayuran yang
berbeda pada suhu kamar (A) dan suhu kulkas (B).
Mengingat temuan di atas, model CPM dipilih untuk menguji kemampuannya untuk mendukung,
tidak hanya pertumbuhan sel tetapi juga proses perkecambahan B. spora thuringiensis untuk
langkah-langkah berikutnya dari karya tersebut. Resep dari model CPM telah diubah dengan
menambahkan agar bakteriologi untuk mengeluarkan matriks di piring dan untuk memfasilitasi
penyebaran B. thuringiensis spora suspensi. Perlakuan termal selama 15 'pada 70 ° C, dan inkubasi
dalam kondisi anaerobik, yang digunakan untuk mereproduksi, dalam model makanan, bahan
makanan industri pengolahan yang adalah Dikirimkan, untuk bermain sebagai tren nyata
perkecambahan spora, perkembangan, dan pertumbuhan sel dalam makanan olahan.
3,6 SEM pengamatan proses perkecambahan
Untuk mengidentifikasi langkah-langkah penting dari B. thuringiensis perkecambahan, proses
tersebut dipantau melalui pemindaian mikroskop elektron (SEM) dan teknik SEM-Xray (Bass et
al. 2009) pemanenan sel pada berbagai titik waktu Selama pertumbuhan dalam model CPM
makanan.
3.6.1 hasil pelapisan emas
Pertama, pengamatan yang dilakukan menggunakan teknik pelapisan emas di bawah kondisi
vakum tinggi. Teknik ini memungkinkan kita untuk melihat perubahan morfologi terbatas pada
permukaan B. sel thuringiensis dan spora. Spora, Memperoleh seperti diuraikan dalam bagian 2.9,
54
Bab 2
yang Ditransfer ke piring CPM dan dipanaskan pada 70 ° C selama 15 menit. Aktivasi ini biasanya
Diikuti oleh kaskade reaksi Itu menghasilkan perubahan morfologi yang cepat dan signifikan
dalam struktur keseluruhan spora.
Pada Gbr.4 ABCD, diperlihatkan spora dorman, dan spora dilapisi oleh residu dinding sel
(exosporium), exosporium bukanlah bagian universal struktur spora tetapi Tampaknya dilestarikan
antara patogen basil dan itu hadir pada anggota B . Kelompok cereus. Spora mantel, menyediakan
spora dengan resistensi terhadap enzim litik eksogen, pelarut organik dan berbagai bahan kimia
oksidatif (Driks, 1999;.. Nicholson et al, 2000 Setlow et al, 2000).
Parasporal inklusi protein tubuh, yang mengandung protein Cry, yang-diamati (Gambar 5 ABCD).
Protein kristal diproduksi Selama sporulasi dan akumulasi baik sebagai inklusi dan sebagai bagian
dari mantel spora. Inklusi Parasporal diproduksi oleh hadir terisolasi morfologis jatuh ke dalam
tiga kelompok: bulat (Gambar 5 C), belah ketupat (Gambar 5 BD), dan tidak teratur berbentuk
(Gambar 5 D).
Sepuluh menit setelah kejutan panas di piring, spora serentak dimulai perkecambahan (Gambar
6). Analisis mikroskopis optik sampel Diperoleh pada titik waktu ini, Menunjukkan transisi

hampir lengkap dari fase-fase cerah untuk spora-sel gelap berkecambah, itu bertepatan dengan
masuknya air ke inti, yang terjadi di lingkungan inti sebagian dehidrasi.
Analisis mikroskopis SEM mengungkapkan Bahwa setelah 40 menit, lapisan luar spora Mulai
larut, untuk memecah spora Mulai lapisan eksternal mereka dan diasumsikan blackberry struktur
memanjang sehubungan dengan bentuk bulat spora dorman (Gambar 7).
Setelah dua jam dari aktivasi panas, sel meledak pasti keluar dari struktur yang tersisa pelindung
spora (mantel spora) dan memprakarsai segregasi kromosom, seperti Menunjukkan oleh
pembentukan septa dan putaran pertama pembelahan sel. Dalam Angka 8, diperlihatkan bentuk
sel berbentuk bulat. Ini mungkin berasal dari protoplas yang aktivitas litik sel tumbuh melampaui
baru, ditandai dengan dinding sel yang lemah.
Sel vegetatif matang, bisa-diamati 12 jam setelah aktivasi spora, kepadatan seluler yang tinggi
bersama-sama dengan awal autolisis yang diwakili dalam Gambar 9.
55
Bab 2
Gambar 4. Spora dorman B. UC10070 thuringiensis dalam model makanan
A
B
C
D
Gbr.5 protein kristal di B. thuringiensis UC10070
A
B
C
D
56
Bab 2
Gambar 6 B. spora thuringiensis UC10070 10 menit setelah aktivasi panas
57
Bab 2
3.6.2. Analisis SEM X-ray
Hall dan Gupta, 1982; Murr, 1982; Hobbs et al, 1986;. Hiom
(1) (1) (7) (7) (6) (6) 223 344 558 899
(10)
Sudah ap ofansen
Tidak menunjukkan kalsium di dalamnya, seperti Diwakili oleh ABCE dari tempat neon. Ini
striggered proses perkecambahan.
58
Bab 2
Kompleks HBL, dua menjadi
CYTK dan BCET sebagai gen tunggal, coding untuk cytotoxin K dan enterotoksin bc-D-THT
masing-masing; Pentingnya sering terjadinya BCET di B. organisme cereus belum sepenuhnya

dipahami, peran CYTK dalam makanan borne disease memerlukan penelitian lebih lanjut,
Meskipun baru-baru ini menunjukkan Berkunjung Itu CYTK gen sangat ditranskripsikan dalam
strain klinis yang bertanggung jawab atas kematian tiga orang (Lund et al, 2000). Uji transkripsi
balik, Menunjukkan Bahwa gen beracun terdeteksi oleh PCR, yang Dinyatakan dalam semua
strain terisolasi; Selain tes aglutinasi memberikan hasil positif untuk komponen L2 dari HBL
kompleks beracun di UC10070 B. regangan thuringiensis dianalisis. Seperti yang dinyatakan
sebelumnya para anggota B. Kelompok cereus, yang terkait erat. Studi pada B. cereus, B. anthracis
dan B. thuringie
tingkat tinggi secara kromosom identitas berurutan. Tidak dikonfirmasi makanan ditanggung kasus
penyakit yang disebabkan oleh B. thuringiensis Telah belum dijelaskan. Ini, Namun, mungkin juga
dua sampai kesulitan yang dihadapi dalam diskriminasi antara B. cereus dan B. thuringiens
th
metode yang dapat diandalkan untuk membedakan dua spesies masih deteksi nclusions parasporal
di B. thuringiensi
itu
p
pelabuhan dan expr
bc-D-THT dan CYTK, ada risiko Bahwa tingkat tinggi Organisme ini dapat menyebabkan
penyakit manusia. Studi terbaru menemukan jumlah tinggi B. organisme cereus-seperti di cucum
segar
tomat dan sayuran segar lainnya, jumlah dilakukan pada makanan segar untuk dijual di toko-toko
ritel Denmark, terungkap Itu lebih 104 CFU / g B. strain thuringiensis,
59
Bab 2
dibedakan dari strain komersial dari biopestisida, hadir, blackberry Mungkin tidak dua sampai
pertumbuhan organisme, tetapi sebagai kontaminan alam atau residu B. insektisida thuringiensis
(Rosenquist et al. 2005). Jumlah tinggi signifikan dari B. Juga organisme cereus seperti semakin
terkait dengan produk dipanaskan, di mana pendinginan tidak setelah memasak dapat
menyebabkan pertumbuhan organisme ini setelah perkecambahan spora. Model CPM diusulkan
dalam pekerjaan ini adalah cho
pertumbuhan B. sel thuringiensis, Selain itu, model itu ditemukan tidak hanya substrat yang sangat
baik untuk pertumbuhan sel tetapi juga untuk B. thuringiensis spora berkecambah. Dengan
menggunakan CPM adalah mungkin untuk mereproduksi tren nyata spora Germin
perkembangan, dan pertumbuhan sel, melalui simulasi dari suatu bahan makanan industri
pengolahan yang adalah Dikirimkan, setelah pengobatan pasteurisasi dan kemasan anaerobik, B.
spora thuringiensis yang diaktifkan dari yang melakukan
Yang mengarah ke metabolisme Realise sel vegetatif baru dan duplikasi mereka. Temuan ini,
bersama dengan profil patogen dijelaskan di atas, memberikan bukti Bahwa popularitas
Peningkatan makanan dingin dimasak dapat menyebabkan masalah dengan bakteri pembentuk
spora: seperti B. cereus dan B. thuringiensis. Untuk lebih menyelidiki pada perubahan morfologi
Selama perkecambahan, kami menggunakan teknik SEM, dikombinasikan dengan X-ray

Mikroanalisis. Metode SEM dapat digunakan untuk mengamati morfologi permukaan spora, X-
ray Mikroanalisis mengizinkan kita untuk membedakan mana yang berkecambah spora dengan
Menentukan komposisi kimia mereka (yaitu pelepasan kalsium DPA). Selain itu, morfologi dan
kimia bisa dipelajari secara simultan, memungkinkan kita untuk mengamati struktur spora ketika
mereka memulai proses perkecambahan. Studi kami Menyediakan metode yang cocok untuk
memperoleh pengetahuan baru pada siklus biologis patogen oportunistik Itu dapat terjadi dalam
makanan olahan. B. thuringiensis menunjukkan berbagai kekhususan insektisida terhadap
beberapa spesies serangga, yang tergantung pada kekhususan gen delta-endotoksin dikodekan oleh
teriakan, Oleh karena itu, racun Cry Sepertinya yang paling menonjol dari sejumlah faktor
virulensi Membiarkan perkembangan bakteri dalam larva serangga: blackberry terbaru penokohan
Itu telah menunjukkan protease dan chitinases, dapat berkontribusi untuk virulensi. Karena faktor-
faktor ini adalah virulensi
untuk mengendalikan hama pertanian biologis, Namun, penelitian kami menunjukkan Pentingnya
mempertimbangkan kemampuan bakteri ini untuk menghasilkan Juga berbagai racun lainnya dan
faktor virulensi Itu dapat mempengaruhi manusia.
60
Bab 2
61
Penyelidikan tambahan diperlukan untuk memperjelas apakah gen tersebut Dinyatakan dalam
makanan setelah kontaminasi bakteri atau spora, namun potensi ini enterotoxigenic
mempertimbangkan, serta reputasi B. tidak dapat dipisahkan dari B. thuringiensis cereus pada
tingkat kromosom, produsen sayuran dan makanan Otoritas bertanggung jawab untuk keamanan
pangan, Harus Pertimbangkan jumlah B. thuringiensis residu insektisida tersisa pada produk
setelah panen. Data yang diperoleh dalam penelitian ini, menyarankan otorisasi Itu yang
memungkinkan pelepasan sejumlah besar B. thuringiensis dalam bioinsektisida Harus Revisi,
melalui prosedur yang memadai untuk mengevaluasi keselamatan, dan termasuk penggunaan
strain enterotoksigenik. The European Food Safety Authority telah merekomendasikan prosesor
Itu Harus Pastikan Itu B. cereus tingkat bakteri antara 103 dan 105 / g yang tidak tercapai pada
hari konsumsi (Eur Food Authority Saf., 2005). Ini akan menjadi penting untuk Pertimbangkan
Pernyataan ini harus juga berlaku untuk residu komersial-encoding enterotoksin B. strain
thuringiensis.
BAB 3
GENOME WIDE ANALISIS transkriptom
DARI Bacillus thuringiensis
Hasil perkecambahan spora DAN RACUN DALAM PRODUKSI PANGAN MODEL
Bab 3
1. Pengantar
Bacillus cereus kelompok sensu lato, membentuk subdivisi yang sangat homogen genus Bacillus
dan Terdiri enam Gram-positif, membentuk spora spesies: B. anthracis, B. thuringiensis, B.
weihenstephanensis, B mycoides, B. pseudomycoides dan B. cereus. Notorious adalah B.

anthracis, penyebab penyakit anthrax Sering-mematikan, dan pada tahun 1877 itu adalah bakteri
pertama kali ditunjukkan bertanggung jawab dari penyakit. Makanan patogen B. cereus,
merupakan penghuni normal tanah, tetapi dapat teratur diisolasi dari makanan: seperti biji-bijian
dan rempah-rempah: bertanggung jawab dari dua jenis penyakit bawaan makanan yang
menyebabkan muntah atau sindrom diare. Serangga patogen B. thuringiensis, adalah Pentingnya
ekonomi yang besar, yang digunakan di seluruh dunia sebagai insektisida.
Kapasitas bakteri ini membentuk partikel aktif sangat resisten, yang disebut spora, Memungkinkan
mereka untuk bertahan hidup dalam kondisi ekstrim dan menempati siklus hidup penuh dan
lengkap dalam beberapa relung lingkungan yang berbeda (tanah, membusuk bahan organik,
permukaan tanaman, serangga dan mamalia nyali ). Dalam kondisi menguntungkan, spora dapat
berkecambah, kehilangan kapasitas ketahanan mereka, dan tumbuh sel-sel vegetatif.
Kemahahadiran spora Bacillus di lingkungan Tak pelak mengakibatkan keberadaan spora dalam
produk pertanian dan susu. Karena spora yang Mampu menahan sebagian besar teknik pelestarian
saat ini diterapkan, mereka bertanggung jawab untuk infeksi, penyakit yang bertalian dengan
makanan yang serius dan sejumlah besar pembusukan makanan (Brul et al, 2006). Spora Bacillus
dilengkapi dengan satu set spesifik reseptor perkecambahan Itu terus memantau lingkungan untuk
kondisi perkembangan yang tepat: mungkin pertimbangan latar belakang ekologi telah
mengakibatkan berbeda dikembangkan set reseptor perkecambahan, tetapi sedikit yang masih
diketahui tentang siklus hidup bakteri ini . Ketersediaan informasi dengan kemajuan dalam
sekuensing genom bakteri, alat bantu untuk blackberry diselidiki fitur Bacillus.
Perbandingan B. anthracis, B. cereus dan B. genom thuringiensis (Ivanova et al., 2003, Han et al
2006), telah memungkinkan genom skala perbandingan urutan yang berkaitan dengan fisiologi,
sporulasi dan virulensi bakteri ini, hubungan genetik yang sangat tinggi yang ditemukan, membuat
genom diferensiasi berbasis rumit atau bahkan tidak mungkin dan menyebabkan kesimpulan
Bahwa tiga taksa Harus Dipertimbangkan spesies bakteri tunggal. Meskipun argumen biologis lagi
tersedia untuk unifikasi, status spesies terpisah untuk Bakteri ini Telah dipertahankan Karena fitur
patogen khas mereka, pola patogenisitas mereka berbeda secara signifikan: faktor virulensi utama
B. anthracis dikodekan oleh dua gen yang terletak di plasmid pXO1 dan pXO2 (Okinaka et al
1999). Demikian pula, 65 kristal
Bab 3
gen protein yang bertanggung jawab untuk fitur utama toksisitas serangga B. isolat thuringiensis
hampir selalu plasmid encoded (Schnepf et al 1998). Gen-gen virulensi B. cereus, adalah
kromosom (Guttmann et al, 2000 Ivanova et al 2003). Hubungan evolusi antara semua anggota
kelompok belum secara definitif ditetapkan, ini penting, tidak hanya untuk memahami evolusi
virulensi di B. Kelompok cereus, tapi Juga untuk cepat dan akurat Karakterisasi Organisme ini,
yang telah menjadi perhatian ilmiah dan politik Pentingnya Peningkatan dalam beberapa tahun
terakhir.
B. thuringiensis adalah bakteri Gram-positif umum lingkungan. Seperti anggota lain dari B.
keluarga cereus, dapat eksis dalam dua morfologi: sel vegetatif dan spora dorman. Yang paling
khas milik B. thuringiensis, adalah patogenisitas dan produksi insektisida protein toksin Cry itu
terakumulasi dalam sel induk sebagai inklusi kristal Selama sporulasi bakteri. Karena aktivitas

Genus Bacillus

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Genus Bacillus

Similar to Genus Bacillus (20)

More from Yuningsih Yuningsih

More from Yuningsih Yuningsih (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Genus Bacillus