1. Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(3A): 1­7, 2009
BIỂU HIỆN LTB (ESCHERICHIA COLI HEAT­LABILE ENTEROTOXIN B SUBUNIT)
TRONG CÂY RAU MÁ (CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN)
1
1
1
1
Nguyễn Hoàng Lộc , Phan Thị Á Kim , Nguyễn Hoàng Bách , Trương Thị Bích Phượng , Tae­Geum
2
2
2
Kim , Tae­Jin Kang , Moon­Sik Yang
1
Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế
Khoa Sinh học và Trung tâm Nghiên cứu hoạt chất sinh học, Đại học Quốc gia Chonbuk, Hàn Quốc
2
TÓM TẮT
Bệnh tiêu chảy do độc tố đường ruột của Escherichia coli (ETEC) gây ra là một vấn đề y tế toàn cầu. Tuy
nhiên, nó có thể được ngăn chận nhờ một loại vaccine mới được thực vật sản xuất. Chúng tôi đã biểu hiện tiểu
đơn vị B của độc tố đường ruột không bền nhiệt của E. coli (LTB) trong cây rau má (Centella asiatica) chuyển
gen. Gen mã hóa LTB thích hợp với thực vật được dung hợp với trình tự SEKDEL và tạo dòng trong vector
biểu hiện bên cạnh promoter CaMV 35S. Gen LTB sau đó được biến nạp vào cây rau má thông qua
Agrobacterium tumefaciens. Kết quả khuếch đại PCR cho thấy gen LTB được đã hiện diện trong DNA genome
của lá rau má chuyển gen. Sự tổng hợp và lắp ráp của protein LTB thành cấu trúc pentamer (khối lượng phân
tử khoảng 60 kDa) đã quan sát được trong dịch chiết cây chuyển gen nhờ kỹ thuật điện di SDS (SDS­PAGE)
và phân tích Western blot. Lượng protein LTB được phát hiện trong lá rau má chuyển gen bằng kỹ thuật
ELISA là 1,98% protein tổng số. Phân tích GM1­ELISA cho thấy protein LTB đã liên kết với ganglioside­
GM1, gợi ý rằng các tiểu đơn vị LTB đã tạo ra dạng pentamer có hoạt tính sinh học và nó có thể ngăn cản được
bệnh tiêu chảy.
Từ khóa: biểu hiện gen, Escherichia coli heat­labile enterotoxin B subunit (LTB), rau má, vaccine dựa vào
thực vật, cây chuyển gen
MỞ ĐẦU
LTB là tiểu đơn vị liên kết của độc tố đường
ruột không bền nhiệt (heat­labile enterotoxin, LT)
của Escherichia coli, một loại vi khuẩn gây bệnh tiêu
chảy ở nhiều quốc gia đang phát triển do hệ thống y
tế cộng đồng còn thô sơ, điều kiện vệ sinh kém,
nguồn nước uống chưa đảm bảo. Cấu trúc của LT
bao gồm 1 tiểu đơn vị A (LTA) và 5 tiểu đơn vị B
(LTB) tạo thành một pentamer dạng vòng. LTB liên
kết với các thụ thể trên các tế bào niêm mạc ruột gây
hấp thu LTA vào trong tế bào, LTA sau đó sẽ kích
thích sự bài tiết dẫn đến mất nước. LTB là một chất
sinh miễn dịch ở niêm mạc ruột, một số nghiên cứu
trên động vật mô hình và một thử nghiệm trên người
cho thấy LTB tái tổ hợp có thể kích thích các đáp
ứng miễn dịch niêm mạc để chống lại LT. Vì thế,
LTB là một ứng viên kháng nguyên đầy hứa hẹn
trong sản xuất vaccine phòng bệnh tiêu chảy (Tacket
et al., 2004). Ngoài ra, LTB còn đề kháng tốt với sự
thủy phân protein ở dạ dày và duy trì được một cấu
trúc bậc 4 pentamer của nó trong môi trường pH thấp
bằng 2.0. Đây là bằng chứng bổ sung cho LTB như
là một ứng viên kháng nguyên được dùng để sản
xuất vaccine nhờ thực vật (Kang et al., 2004).
Chuyển gen vào cây trồng với mục đích tạo ra
protein kháng nguyên để sản xuất vaccine phòng
bệnh cho người và động vật đang thu hút sự quan
tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Nhiều
protein kháng nguyên đã được biểu hiện thành công
ở thực vật như kháng nguyên bề mặt virus viêm gan
B (Mason et al., 1998, Kapusta et al., 1999, Kong et
al., 2001), protein G của virus dại (McGarvey et al.,
1995, Rojas­Anaya et al., 2009), protein LTB của E.
coli (Mason et al., 1998, Chikwamba et al., 2002,
Kang et al., 2003, Kim et al., 2007); protein CTB
của Vibrio cholerae (Arakawa et al., 1997, Daniell et
al., 2001, Kang et al., 2004, Kim et al., 2006, Oszvald
et al., 2008). Sản xuất protein kháng nguyên trong
cây trồng thực phẩm về căn bản là rẻ hơn sản xuất
bằng cách nuôi cấy vi khuẩn, nấm, tế bào côn trùng
hoặc tế bào động vật có vú. Vì vậy, việc sản xuất
vaccine dựa vào thực vật là một phương pháp đầy
hứa hẹn, an toàn, thuận lợi, giá thành thấp và dễ sử
dụng (Streatfield et al., 2001).
Bài báo này trình bày một số kết quả nghiên cứu
bước đầu về biểu hiện gen LTB trong cây rau má
làm cơ sở cho việc phát triển mô hình vaccine dựa
vào thực vật sau này.
1

2. Nguyễn Hoàng Lộc et al.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
Nguyên liệu thực vật
Sử dụng cuống lá (1 cm) của cây rau má
(Centella asiatica) in vitro (Phan Thị Á Kim, 2008)
làm nguyên liệu để chuyển gen LTB thông qua
Agrobacterium tumefaciens. Các thí nghiệm nuôi cấy
o
được tiến hành ở nhiệt độ 25±2 C, cường độ chiếu
sáng 2000­3000 lux, thời gian chiếu sáng 12
giờ/ngày.
Cấu trúc của vector biểu hiện thực vật
Gen LTB của E. coli được tối ưu trình tự bằng
cách thay các bộ ba mã hóa amino acid đặc trưng của
thực vật cho các bộ ba tương ứng của vi khuẩn nhờ
phương pháp PCR mở rộng các đoạn chồng lên
nhau. Vector biểu hiện thực vật pMYO51 mang gen
LTB đã tối ưu, đoạn peptide tín hiệu, trình tự
SEKDEL, và promoter CaMV 35S (Kang et al.,
2004) (Hình 1).
Hình 1. Cấu trúc của vector pMYO51. LB và RB bờ trái và bờ phải. Gen LTB dung hợp với trình tự SEKDEL và được điều
hòa bởi promoter CaMV 35S. Một cassette biểu hiện NPTII được dùng để chọn lọc kháng sinh cho cây chuyển gen.
Promoter pNOS và terminator t­NOS có nguồn gốc từ gen tổng hợp nopaline của A. tumefaciens.
Biến nạp gen LTB
Tiền nuôi cấy cuống lá trên môi trường cơ bản
MS (Murashige and Skoog, 1962) có chứa 2 mg/l
BAP và 1 mg/l NAA trong 2 ngày. Mẫu vật sau đó
được gây nhiễm A. tumefaciens LBA 4404 mang
vector pMYO51 trên cùng môi trường có bổ sung
0,2 mM acetosyringone. Sau 2 ngày nuôi cấy, mẫu
vật được chuyển lên môi trường như trên nhưng có
thêm 100 µg/ml kanamycin và 200 μg/ml
cefotaxime. Sau 4 tuần đầu, các tế bào được biến nạp
gen LTB tạo callus, và sau 3 tuần tiếp theo các chồi
tái sinh từ callus được chuyển lên môi trường có
chứa 0,5 mg/ml NAA để tạo rễ và phát triển thành
cây hoàn chỉnh.
Phân tích PCR
DNA tổng số của rau má được tách chiết từ lá
theo phương pháp của Kang và Fawley (1997). Phân
tích PCR được thực hiện bằng cặp mồi đặc hiệu cho
gen LTB đã tối ưu như sau: mồi thuận 5’­
GGATCCGCCACCATGGTGAAGGTGAAG ­3’ và
mồi ngược 5’­ GGTACCTCATAGCTCATCTTTC ­
3’. Thành phần PCR (trong 50 ml) bao gồm: DNA
khuôn mẫu (100 ng DNA tổng số của rau má hoặc
15 ng DNA của pMYO51), 10 pmol mồi mỗi loại,
200 mM dNTP mỗi loại, đệm Taq polymerase và
1,25 unit Taq polymerase (BioRad). Điều kiện PCR
2
o
như sau: biến tính khuôn mẫu ở 95 C/10 phút; tiếp
o
o
o
theo 30 chu kỳ: 95 C/1 phút, 55 C/1 phút và 72 C/1
o
phút; sau cùng 72 C/10 phút. Sản phẩm PCR được
điện di trên 1% agarose gel và nhuộm bằng ethidium
bromide.
Phân tích điện di SDS và Western blot
Mẫu lá rau má (0,5 g) được nghiền trong
nitrogen lỏng và tái huyền phù trong 1 ml đệm chiết
(50 mM HEPES pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM
dithiothreitol, 2 mM phenylmethanesulfonyl
fluoride, 10 mM potassium acetate, 5 mM
magnesium acetate). Thu dịch nổi protein tổng số
o
bằng ly tâm 15.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 C.
Hàm lượng protein tổng số được xác định bằng
phương pháp Bradford (1976) với BSA được dùng
làm chất chuẩn.
Protein tổng số (10 µg) được điện di SDS trên
12% polyacrylamide gel ở 80 V. Gel sau đó được
nhuộm bằng 0,25% Coomassie brilliant blue R250
trong 15 phút và rửa bằng 10% acetic acid băng.
Thẩm tích protein tổng số sau khi điện di SDS
lên màng Hybond C bằng hệ thống Trans­blotÒ SD
Semi­dry transfer cell (BioRad) ở 15 V. Hạn chế
phản ứng không đặc hiệu bằng 3% BSA trong đệm
TBST (TBS+0,05% Tween 20) ở nhiệt độ phòng

3. Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(3A): 1­7, 2009
(RT) qua đêm. Ủ màng Hybond C với kháng thể
LTB (Immunology Consultants Lab Inc, OR) tỷ lệ
1:2000 trong đệm TBST chứa 1,5% BSA ở RT trong
2 giờ. Rửa màng 3 lần bằng đệm TBST. Tiếp theo, ủ
màng với kháng thể gắn alkaline phosphatase
(Promega S3731) trong đệm TBST tỷ lệ 1:5000 ở
RT trong 2 giờ. Rửa màng 3 lần bằng đệm TBST và
1 lần bằng đệm TMN (100 mM Tris pH 9.5, 5 mM
MgCl2 và 100 mM NaCl). Phát triển màu bằng
BCIP/NBT trong đệm TMN.
khi ở cây tự nhiên không thấy xuất hiện băng DNA
nào. Điều này chứng tỏ gen LTB đã có mặt trong hệ
gen của cây rau má (Hình 2).
Phân tích ELISA
Bọc các giếng của microplate bằng protein tổng
o
số (100 ml/giếng) qua đêm ở 4 C. Rửa microplate 3
lần bằng đệm PBST, hạn chế phản ứng không đặc
hiệu bằng 1% BSA trong đệm PBS (300 ml/ giếng) ở
o
37 C trong 2 giờ. Rửa microplate 3 lần bằng đệm
PBST, ủ với kháng thể LTB (Immunology
Consultants Lab Inc, OR) tỷ lệ 1:5000 trong đệm
o
PBS chứa 0,5% BSA ở 37 C trong 2 giờ. Rửa
microplate 4 lần bằng đệm PBST, ủ với kháng thể
gắn horseradish peroxidase (Sigma, G­7641) tỷ lệ
o
1:10000 trong đệm PBS chứa 0,5% BSA ở 37 C trong
2 giờ. Rửa microplate 4 lần bằng đệm PBST, phát
triển màu bằng TMB (100 ml/giếng) (Pharmingen
2606KC và 2607KC). Đo OD (405 nm) bằng hệ thống
ELISA tự động (BioRad). Tính hàm lượng LTB biểu
hiện ở cây rau má chuyển gen dựa trên đường chuẩn
LTB của vi khuẩn.
Phân tích liên kết LTB­GM1
Bọc các giếng của microplate bằng
monosialoganglioside GM1 (Sigma) với 100 ml/giếng
(3 mg/ml) trong đệm bicarbonate (pH 9.6). Đối chứng
được bọc bằng BSA cũng một lượng tương tự như
o
trên, ủ ở 4 C qua đêm. Rửa microplate 3 lần bằng đệm
PBST, hạn chế phản ứng không đặc hiệu với 1% BSA
trong đệm PBS ở RT trong 2 giờ. Rửa microplate 3
o
lần đệm PBST, ủ với dịch chiết protein tổng số ở 37 C
trong 2 giờ. Xử lý mẫu với kháng thể thứ nhất và thứ
hai như phương pháp ELISA.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Xác định gen LTB
Sự hiện diện của gen LTB trong cây rau má
chuyển gen được xác định bằng PCR với cặp mồi
đặc hiệu. Kết quả điện di trên 1% agarose gel cho
thấy có xuất hiện băng DNA ở cây chuyển gen kích
thước bằng gen LTB trong vector pMYO51, trong
Hình 2. Điện di sản phẩm PCR. SM: Chuẩn kích thước
DNA (λ/Hind III), 1: cây rau má chuyển gen LTB, NC: cây
rau má tự nhiên, PC: vector pMYO51.
Phân tích biểu hiện của gen LTB
Kết quả điện di SDS trình bày ở hình 3 cho thấy
có xuất hiện một băng protein khoảng 60 kDa ở cây
chuyển gen mà không thấy có ở cây tự nhiên. Khối
lượng phân tử của băng protein này tương đương với
protein LTB ở dạng pentamer, trong đó mỗi
monomer khoảng 12 kDa (Kang et al., 2003). Như
vậy, protein LTB đã biểu hiện trong cây rau má
chuyển gen. Tuy nhiên, để nhận định này có độ tin
cậy cao hơn chúng tôi đã tiến hành Western blot.
Phân tích Western blot cũng cho kết quả tương
tự như điện di SDS. Ở cây chuyển gen xuất hiện tín
hiệu lai có khối lượng phân tử vào khoảng 60 kDa,
còn cây tự nhiên không thấy có tín hiệu lai nào (Hình
4). Kết quả này thêm một lần nữa khẳng định protein
LTB đã biểu hiện trong rau má chuyển gen. Tuy
nhiên, sự biểu hiện của gen ngoại lai ở các cây tái
sinh thường là không giống nhau do tác động của
hiệu ứng vị trí. Vì thế, chúng tôi đang tiếp tục phân
tích các dòng cây rau má chuyển gen còn lại để chọn
ra dòng có mức độ biểu hiện LTB cao nhất.
Để định lượng protein LTB trong cây chuyển gen
chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật ELISA. Kết quả trình
bày ở hình 5 cho thấy hàm lượng protein LTB trong
rau má chuyển gen là 1,98% protein tổng số. Một số
nghiên cứu trước đây cũng có mức độ biểu hiện
protein LTB tương đối cao, chẳng hạn ở tế bào nấm
men 1,9% (Rezaee et al., 2005), ở thuốc lá 2,5%
(Kang et al., 2003), và ở rau diếp 2% (Kim et al.,
2007).
3

4. Nguyễn Hoàng Lộc et al.
Ái lực liên kết của protein LTB trong rau má
chuyển gen với thụ thể ganglioside­GM1 được xác
định bằng phân tích GM1­ELISA. Kết quả trình
bày ở hình 6 cho thấy protein LTB của cây chuyển
gen có ái lực khá mạnh đối với ganglioside­GM1
(0,29%). Khả năng liên kết của protein thực vật với
các thụ thể ganglioside phụ thuộc vào sự hình thành
cấu trúc pentamer từ các monomer (Rosales­
Mendoza et al., 2007). Sự lắp ráp các monomer
thành cấu trúc pentamer là cần thiết cho sự liên kết
và nhận biết của các tế bào niêm mạc ruột (Kim et
al., 2007). Hiệu lực liên kết khá mạnh của protein
LTB với ganglioside­GM1 chứng tỏ rằng, các tiểu
đơn vị LTB từ thực vật đã có tính cộng tác với GM1
(Merritt et al., 1994). Cả hai phân tích Western blot
và liên kết GM1­ELISA trên rau má chuyển gen đã
chứng minh protein LTB tự lắp ráp thành cấu trúc
pentamer có hoạt tính sinh học. Một số nghiên cứu
trước đây đã cho thấy protein LTB thực vật liên kết
mạnh với ganglioside­GM1 như thuốc lá (Kang et
al., 2003), cà rốt (Rosales­Mendoza et al., 2007),
rau diếp (Kim et al., 2007) và đậu tương (Moravec
et al., 2007).
Hình 3. Điện di SDS. WM: Chuẩn khối lượng phân tử
protein (97­14,4 kDa), W1 và W2: cây rau má tự nhiên, S1
và S2: cây rau má chuyển gen LTB.
Hình 4. Phân tích Western blot. WM: Chuẩn khối lượng
phân tử protein (97­14,4 kDa), W1 và W2: cây rau má tự
nhiên, S1 và S2: cây rau má chuyển gen LTB.
% protein tổng số
3
2
1.92
1.98
1
0.04
0
S1 S2 W
Hình 5. Phân tích ELISA. S1 và S2: cây rau má chuyển gen LTB. W: cây rau má tự nhiên.
4

5. Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(3A): 1­7, 2009
Mật độ quang (405 nm)
0.4
0.3
0.275
0.286
0.2
0.108
0.1
0.033
0.012
0.004
0
S1 S2 W S1 S2 W
GM1 BSA
Hình 6. Phân tích GM1­ELISA. S1 và S2: cây rau má chuyển gen LTB. W: cây rau má tự nhiên.
KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy
gen LTB đã biểu hiện trong cây rau má sau khi được
biến nạp thông qua Agrobacterium tumefaciens.
Protein LTB ở rau má chuyển gen chiếm 1,98%
lượng protein tổng số, và chúng có ái lực liên kết khá
mạnh với ganglioside­GM1.
Lời cảm ơn: Công trình nghiên cứu được sự hỗ trợ
của Dự án Giáo dục đại học Việt Nam giai đoạn 2
(2008­2011).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Phan Thị Á Kim (2008) Thăm dò điều kiện thích hợp để
chuyển gen LTB vào cây rau má (Centella asiatica (L.)
Urban). Luận văn Thạc sĩ. Trường Đại học Khoa học, Đại
học Huế.
Arakawa T, Chong DKX, Merritt JL, Langridge WHR
(1997) Expression of cholera toxin B subunit oligomers in
transgenic potato plants. Transgenic Res 6: 403­413.
Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principles of protein­dye binding. Anal Biochem 72:
248­254.
Chikwamba R, McMurray J, Shou H, Frame B, Pegg SE,
Scott P, Mason H, Wang K (2002) Expression of a
synthetic E. coli heat­labile enterotoxin B subunit (ltb) in
maize. Mol Breed 10: 253­265.
Daniell H, Lee SB, Panchal T, Wiebe PO (2001) Expression
of the native cholera toxin B subunit gene and assembly as
functional oligomers in transgenic tobacco chloroplast. J
Mol Biol 311: 1001­1009.
Kang TJ, Fawley MW (1997) Variable (CA/GT)n simple
sequence repeat DNA in the alga Chlamydomonas. Plant
Mol Biol 35: 943­948.
Kang TJ, Loc NH, Jang MO, Jang YS, Kim YS, Seo JE,
Yang MS (2003) Expression of the B subunit of E. coli
heat­labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its
characterization. Transgenic Res 12: 683­691.
Kang TJ, Han SC, Jang MO, Kang KH, Jang YS, Yang
MS (2004) Enhanced expression of B subunit of
Escherichia coli heat­labile enterotoxin in tobacco by
optimization of coding sequence. Appl Biochem Biotechnol
117: 175­187.
Kapusta J, Modelska A, Figlerowicz M, Pniewski T,
Letellier M, Lisowa O, Yusibov V, Koprowski H,
Plucienniczak A, Legocki AB (1999) A plant­derived
edible vaccine against hepatitis B virus. FASEB J 13:
1796­1799.
Kim YS Kim BG, Kim TG, Kang TJ, Yang MS (2006)
Expression of a cholera toxin B subunit in transgenic
lettuce (Lactuca sativa L.) using Agrobacterium­mediated
transformation system. Plant Cell Tiss Organ Cult 87:
203­210.
Kim TG, Kim MY, Kim BG, Kang TJ, Kim YS, Jang YS
(2007) Synthesis and assembly of Escherichia coli heat­
labile enterotoxin B subunit in transgenic lettuce (Lactuca
sativa L.). Protein Expr Purif 51: 22­27.
5

6. Nguyễn Hoàng Lộc et al.
Kong Q, Richter L, Yang YF, Arntzen CJ, Mason HS,
Thanavala Y (2001) Oral immunization with hepatitis B
surface antigen expressed in transgenic plants. Proc Nat
Acad Sci USA 98: 11539­11544.
Mason HS, Haq TA, Clements JD, Arntzen CJ (1998)
Edible vaccine protects mice against Escherichia coli heat­
labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic
LT­B gene. Vaccine 16: 1336­1343.
McGarvey PB, Hammond J, Dienelt MM, Hooper DC, Fu
ZF, Dietzschold B, Koprowski H, Michaels FH (1995)
Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic
tomatoes. Bio/Technology 13: 1484­1487.
Merritt EA, Sixma TK, Kalk KH, Van Zanten BA, Hol
WG (1994). Galactose­binding site in Escherichia coli
heat­labile enterotoxin (LT) and cholera toxin (CT). Mol
Microbiol 13: 745­753.
Moravec T, Schmidt MA, Herman EM, Woodford­Thomas
T (2007) Production of Escherichia coli heat labile toxin
(LT) B subunit in soybean seed and analysis of its
immunogenicity as an oral vaccine. Vaccine 25: 1674­
1657.
Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid
growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol
Plant 15: 473­497.
toxin B subunit in transgenic rice endosperm. Mol
Biotechnol 40: 261­268.
Rezaee MA, Rezaee A, Moazzeni SM, Salmanian AH,
Yasuda Y, Tochikubo K, Pirayeh SN, Arzanlou M (2005)
Expression of Escherichia coli heat­labile enterotoxin B
subunit (ltb) in Saccharomyces cerevisiae. J Microbiol 4:
354­360.
Rojas­Anaya E, Loza­Rubio E, Olivera­Flores MT,
Gomez­Lim M (2009) Expression of rabies virus G protein
in carrots (Daucus carota). Transgenic Res. doi
10.1007/s11248­009­9278­8, Online: May 29, 2009.
Rosales­Mendoza S, Soria­Guerra RE, Olivera­Flores
MTD, Lopez­Revilla R, Argullo­Astorga GR, Jimenez­
Bremont JF (2007) Expression of Escherichia coli heat­
labile enterotoxin B subunit (ltb) in carrot (Daucus carota
L.). Plant Cell Reports 26: 969­976.
Streatfield SJ, Jilka JM, Hood EE, Turner DD, Bailey MR,
Mayor JM, Woodard SL, Beifuss KK, Horn ME, Delaney
DE, Tizard IR, Howard JA (2001) Plant­based vaccines:
unique advantages. Vaccine 19: 2742­2748.
Tacket CO, Pasetti MF, Edelman R, Howard JA,
Streatfield (2004) Immunogenicity of recombinant LT­B
delivered orally to humans in transgenic corn. Vaccine. 22:
4385­4389.
Oszvald M, Kang TJ, Tomoskozi S, Jenes B, Kim TG, Cha
YS, Tamas L, Yang MS (2008) Expression of cholera
EXPRESSION OF LTB (ESCHERICHIA COLI HEAT­LABILE ENTEROTOXIN B
SUBUNIT) IN CENTELLA (CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN)
1, *
1
1
1
Nguyen Hoang Loc , Phan Thi A Kim , Nguyen Hoang Bach , Truong Thi Bich Phuong , Tae­Geum
2
2
2
Kim , Tae­Jin Kang , Moon­Sik Yang
1
Institute of Resources, Environment and Biotechnology, Hue University
Division of Biological Sciences and the Research Center of Bioactive Materials, Chonbuk National
University, Korea
2
SUMMARY
Diarrheal disease caused by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is world­wide health problem that
might be prevented with vaccine based on edible plants expressing the E. coli heat­labile toxin. We expressed
the B subunit of enterotoxigenic E. coli heat­labile enterotoxin (LTB) in centella (Centella asiatica). Gene
encoding the LTB adapted to the coding sequence of plants was fused to the endoplasmic reticulum retention
signal (SEKDEL) to enhance its level of expression in plants and was cloned into a plant expression vector
adjacent to the CaMV 35S promoter. The LTB gene was then introduced into centella plant by Agrobacterium
tumefaciens­mediated transformation method. The results showed that the LTB gene was found in the genomic
DNA of transgenic centella leaf cells by PCR amplification. Synthesis and assembly of the LTB protein into
oligomeric structures of pentameric size (approximately 60 kDa) was observed in transgenic plant extracts
*
Author for correspondence: Tel: 84­54­6505051; Fax: 84­54­3830208; E­mail: nhloc@hueuni.edu.vn
6

7. Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(3A): 1­7, 2009
using sodium dodecyl sulfate­polyacrylamide gel electrophoresis (SDS­PAGE) and Western blot analysis. The
amount of LTB protein was determined in transgenic centella leaves by enzyme­linked immunosorbent assay
(ELISA) to be about 1.98% of the total soluble protein. GM1­ganglioside binding assay indicated that centella
LTB protein bound specifically to GM1­ganglioside. This suggested that the LTB subunits (monomers) formed
biologically active pentamers and they can be functional in prevention of diarrhea.
Keywords: Centella asiatica, Escherichia coli heat­labile enterotoxin B subunit (LTB), expression, plant­based
vaccine, transgenic plant
7