Luận án Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng.Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc các chất phụ gia thực phẩm có giá trị [132]. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây (thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ

1. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU Y HỌC THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
Luận án Nghiêncứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)
và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của
chúng.Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là
nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực
vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm,
hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc các chất
phụ gia thực phẩm có giá trị [132]. Những sản phẩm này được biết như là các chất
trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây (thường nhỏ hơn
1% khối lượng khô) và chức năng trao đổichất chưa được biết đầy đủ. Chúng được
xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự
bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [177]. Những nghiên cứu về các
hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế
kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất thứ cấp khác nhau ở thực vật đã
đuợc công bố [19], [23].
MÃ TÀI LIỆU TONGHOP.00052
Giá : 50.000đ
Liên Hệ 0915.558.890
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo
dược làm thuốc đe chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe. Việc khai thác nguồn dược
liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu
và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra hiện
nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất nhanh chóng do
sự biến đổicủa khí hậu toàn cầu cũng như sự khai thác bừa bãi của con người. Như
vậy, sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng con đường canh tác truyền thống
và tổng hợp hóa học sẽ có nhiều hạn chế, khó có thể đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu
ngày càng tăng trong tương lai [188]. Điều này buộc các nhà khoa học cần phải
tính đến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật như một conđường tiềm năng để cung
cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm [106].
Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm 1950. Nhiều
nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức có hiệu quả
trong sản xuất các hợp chất có hoạt chất sinh học hoặc các chất
chuyển hóa của chúng [132]. Ưu điếm của nuôi cấy tế bào thực vật là có the cung
cấp liên tục nguồn nguyên liệu dồi dào đế tách chiết ở quy mô công nghiệp các
hoạt chất mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên [106]; có thế tạo ra các hợp
chất mới và chủ động nâng cao khả năng sản xuất chúng bằng cách thay đổicác
điều kiện nuôi cấy [128]; các hoạt chất thu được không bị nhiễm bẩn bởi thuốc trừ

2. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU Y HỌC THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
sâu, diệt cỏ, kháng côn trùng cũng như tránh được sự không đồng nhất về nguồn
nguyên liệu và những biến động hàm lượng của các sản phẩm thực vật ngoài tự
nhiên. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, hàm lượng các chất có hoạt
tính sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro tương đương hoặc cao
hơn nhiều lần so với cơ quan tích lũy của chúng trong cây ngoài tự nhiên [140],
[167]. Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất nhiều loại hợp chất có
giá trị theo phương thức này trên qui mô lớn như anthraquinone ở cây Rubia akane,
vincristine ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus), berberin ở cây Coscinium
fenustratum, diosgenin ở cây Dioscorea doryophora, taxol ở các loài thuộc chi
Taxus, ginsenoside ở các loài thuộc chi Panax… [163].
Nghệ đen còngọi là nga truật thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) có nguồn gốc từ
Đông Bắc Ản Độ, được trồng ở khắp khu vực Nam Á, Đông Nam Á, Trung Quốc,
Đài Loan, và Madagasca [9], [115]. Củ của cây nghệ đen có chứa các hoạt chất
sinh học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu. Ngoài ra nó còn có tinh bột,
chất dẻo và một số chất có vị đắng như tannin và flavonoid [82]. Các nghiên cứu
cho thấy, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u; một số dạng ung
thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng
trứng [55], [66], [152]; curcumin cũng có tác dụng chống đông máu và hạ huyết
áp; curcuminoid và sesquiterpene là những chất có khả năng ức chế sự hình thành
TNF-a của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng chống viêm nhiễm
[152]; curcumin cònlà một chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ tế bào. Nhiều
công trình nghiên cứu cũng cho thấy, tinh dầu nghệ đen có tác dụng kháng khuẩn
và kháng độtbiến rất cao [176]. Bên cạnh đó,polysaccharide của nghệ đen ức chế
hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt
(sarcoma 180) được cấy dưới da của chuột, ngăn cản đột biến nhiễm sắc the, có
hoạt tính kíchthích đại thực bào [75], [105], [169]. Trong tự nhiên, nghệ đen là
loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số nhân
kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện
đất đai, khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân công và vật tư sản xuất. Mặt
khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá [29]. Vì
vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồidào và ổn định để sản xuất lượng lớn các
hợp chất có hoạt tính sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược
phẩm.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiêncứu nuôi cấy tế
bào câynghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)và khảo sát khả năng tích lũy
một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng”
1. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để sản xuất

3. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU Y HỌC THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được khả năng tích lũy và hoạt tính sinh
học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù
trong hệ lên men 10 L.
2. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
2.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có tính hệ
thống về nuôi cấy in vitro tế bào cây nghệ đen và sự tích lũy một số hợp chất có
hoạt tính sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích trong
nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh học có giá
trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật.
2.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của luận án là cơ sở khoa học đe phát triển hệ thống nuôi cấy huyền phù tế
bào cây nghệ đen ở qui mô lớn nhằm sản xuất nhanh sinh khối, cung cấp nguồn
nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị cao dùng làm
thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
3. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
– Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro
thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống các
điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn định
của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bìnhtam giác 250 ml và trong hệ lên men 10 L.
– Đã khảo sát sự tích lũy các chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu, curcumin,
sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy. Nghiên cứu đã
xác định được hàm lượng và thời điểm tíchlũy cao nhất của các hợp chất này theo
đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển hóa sinh học các chất
như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ
đen.
– Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu chiết rút từ tế bào cây nghệ
đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức chế sinh
trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh ở mức tương đương hoặc cao hơn so với
tinh dầu chiết rút từ củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên.
MỤC LỤC Nghiên cứu nuôi cấytế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria
Roscoe)và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học
của chúng
LỜI CÁM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC
CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

4. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU Y HỌC THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT 5
1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật 5
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 6
11.2.1. Nuôi cấy callus 6
11.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 7
11.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào 10
11.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào 12
1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn 16
1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT
NUÔI CẤY IN VITRO 19
1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật 19
1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật 19
1.2.21. Nhóm terpene 20
1.2.2.2. Nhóm phenol 20
1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen 20
1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật 21
1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước 21
1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước 25
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN 28
1.3.2. Thành phần hóa học 28
1.3.3. Công dụng 30
1.3.3.1. Công dụng cổ truyền 30
1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học 30
1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen 35
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.37
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 37
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.3.1. Nuôi cấy callus 39
2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 39
2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác 39
2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men 40
2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào 40
2.3.4. Định lượng tinh dầu 41

5. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU Y HỌC THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
2.3.5. Định lượng curcumin 41
2.3.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước 42
2.3.7. Xác định sesquiterpene 42
2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 43
2.3.9. Xử lý thống kê 43
Chương 3: KÉT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44
3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN 44
3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TÉ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC 47
3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy 47
3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 49
3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST 51
3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA 51
3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D 52
3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA 52
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon 54
3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose54
3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose 56
3.3. NUÔI CẤY TÉ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN 59
3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào 59
3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 61
3.3.2.1. Cỡ mẫu 61
3.3.2.2. Tốc độ khuấy 62
3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí 63
3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TRONG TÉ BÀO NGHỆ ĐEN 65
3.4.1. Hàm lượng tinh dầu 65
3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số 67
3.4.3. Hàm lượng curcumin 68
3.4.4. Xác định sesquiterpene 73
3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TÉ BÀO NGHỆ ĐEN
…77
KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 80
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ_LIÊN QUAN ĐÉN LUẬN ÁN
82
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC