Ảnh hưởng của elicitor lên khả năng tích lũy ở tế bào solasodine

1
Theo số liệu thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 -
50 tấn các loại dược liệu khác nhau để sử dụng trong y học cổ truyền, làm nguyên
liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong đó, trên 2/3 khối lượng này được
khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên và trồng trọt trong nước. Khối lượng
dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa
vào thương mại có tính phổ biến hiện nay. Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu
khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa có những con
số thống kê cụ thể [10].
Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) còn gọi là cà quạnh, cà gai dây,
cà quýnh, cà vạnh, chẻ nan (Tày), b’rongoon (Ba Na), có tên khoa học khác là
Solanum procumben Lour., thuộc họ Cà (Solanaceae) [18]. Trong thành phần hóa
học của cà gai leo, solasodine là hợp chất ch nh, đ y là một steroid alkaloid được
t m thấy ở khoảng 250 loài c y khác nhau thuộc họ Cà, đ c biệt là chi Solanum,
ch ng thư ng tồn tại ở dạng glycoside. Các nghiên c u trước đ y cho thấy
solasodine có hoạt t nh kháng viêm và bảo vệ gan, chống lại tế bào ung thư (đ c
biệt là ngăn ngừa ung thư da). Solasodine còn là tiền chất để sản xuất các loại
corticosteroid, testosteroid và thuốc tránh thai. Ngoài ra, ch ng còn có tác dụng
chống oxy hóa, ngăn ngừa xơ gan [14]. Gần đ y, nghiên c u cho thấy solasodine
còn có tác dụng bất hoạt các virus gây bệnh mụn giộp ở ngư i như Herpes simplex,
H. zoster và H. genitalis (Chating và cs), bảo vệ chuột chống lại sự xâm nhiễm của
vi khuẩn Salmonella typhimurium, giảm lượng cholesterol trong máu… [64].
Tuy nhiên, từ trước đến nay cà gai leo được khai thác chủ yếu từ nguồn
hoang dại, ch ng thư ng phân tán manh múm và chất lượng không đồng đều, trữ
lượng có giới hạn và hiện đang cạn kiệt do bị thu hái bừa bãi. Vì thế, nguồn nguyên
liệu này không đủ để đáp ng cho việc nghiên c u và điều trị.
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những lĩnh vực ng dụng đạt
nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật. Phương pháp này với
những ưu điểm vượt trội đã mở ra tiềm năng lớn để tăng thu sinh khối trong th i

2
gian ngắn, hàm lượng hợp chất th cấp (HCTC) cao, chủ động dễ điều khiển quy
trình sản xuất tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết các hoạt chất sinh học
trên quy mô công nghiệp, góp phần giải quyết những khó khăn nói trên [63].
Elicitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ
vào hệ thống tế bào sống thì khởi động ho c cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC
trong tế bào đó [65]. Elicitor thực vật báo hiệu việc hình thành các HCTC, bổ sung
elicitor vào môi trư ng nuôi cấy là phương th c để thu được các sản phẩm HCTC
có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi
sinh học để kích thích hình thành các HCTC trong nuôi cấy tế bào vừa có thể rút
ngắn th i gian lại đạt năng suất cao [42]. Nghiên c u nuôi cấy tế bào huyền phù có
bổ sung elicitor đã được thực hiện thành công ở một số đối tượng như c y nh n s m
(Panax ginseng) [60], [99], rau má (Centella asiatica) [57], giây dác (Cayratia
trifolia) [87], sen tuyết (Saussurea medusa) [106], [112], Pueraria tuberosa [80].…
Các elicitor thư ng được sử dụng trong các nghiên c u là methyl jasmonate
(MeJA), salicylic acid (SA), dịch chiết nấm men (YE), jasmonic acid (JA), ethrel,
chitosan... [57], [62], [65].
Hiện nay đã có một số nghiên c u sản xuất glycoalkaloid toàn phần nói
chung và solasodine nói riêng từ cây cà gai leo, tuy nhiên hiệu suất chưa cao.
Nghiên c u khả năng t ch lũy glycoalkaloid toàn phần trong callus cà gai leo cho
thấy hàm lượng đạt cao nhất 128,17 mg/g khối lượng khô sau 7 tuần nuôi cấy [56].
Các tác giả cũng đã khảo sát khả năng t ch lũy solasodine trong tế bào cà gai leo và
kết quả cho thấy hàm lượng cao nhất thu được là 121,01 mg/g khối lượng khô sau 4
tuần nuôi cấy [59]. Những nghiên c u này đều thu được kết quả là hàm lượng
glycoalkaloid toàn phần hay solasodine trong callus và tế bào đều cao hơn so với
cây tự nhiên, tuy nhiên hiệu suất vẫn chưa cao. Sử dụng các elicitor thực vật có thể
cải thiện được vấn đề này.
Xuất phát từ đó, ch ng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ả ưởng c a một
số elicitor lên khả ă g lũy sol sod e ở t bào in vitro c a cây cà gai leo
(Solanum hainanense Hance). p dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù
tạo nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết solasodine, cung cấp nguồn dược chất tự

3
nhiên cho các nghiên c u trong lĩnh vực y học. Các kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở
cho việc xây dựng qui trình sản xuất solasodine từ sinh khối tế bào để ng dụng
trong lĩnh vực dược phẩm sau này.
Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi cấy in vitro tế
bào của cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance).
g o
Kết quả nghiên c u của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá
trị về khả năng t ch lũy solasodine trong tế bào cà gai leo khi nuôi cấy có bổ sung
các elicitor. Đồng th i luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích cho nghiên c u và
giảng dạy về lĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học bằng con đư ng nuôi cấy tế
bào thực vật.
Đề tài là hướng nghiên c u có tiềm năng ng dụng trong lĩnh vực sản xuất
hoạt chất sinh học dùng làm dược liệu bằng nuôi cấy tế bào thực vật, góp phần vào
việc bảo vệ và chăm sóc s c khỏe cộng đồng.
g g g l
Đ y là một trong những công tr nh đầu tiên tại Việt Nam nghiên c u ảnh
hưởng của một số elicitor lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong nuôi cấy tế
bào cà gai leo. Kết quả của luận án là đáng tin cậy và có thể sử dụng để tiếp tục
nghiên c u phát triển sản xuất solasodine ở quy mô lớn hơn.
g ứ
Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện in vitro tại Phòng thí
nghiệm Hợp chất th cấp, Viện Tài nguyên, Môi trư ng và Công nghệ sinh học,
Đại học Huế từ tháng 11 năm 2011 đến tháng 11 năm 2014.

4
C ươ g 1.
1.1. C C C C Ừ C
C
Phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật là quá tr nh điều khiển sự phát sinh
hình thái của tế bào thực vật khi nuôi cấy tách r i trong điều kiện in vitro có định
hướng thành những cấu trúc biệt hóa hay chưa biệt hóa của tế bào trên cơ sở tính
toàn năng của tế bào thực vật [42].
Nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng lớn trong việc cải thiện khả năng tổng
hợp các HCTC có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không
thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật ho c tổng hợp bằng phương pháp hóa
học. Sự phát triển của các HCTC quan trọng trong thương mại là kết quả được
mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên c u này. Ưu điểm của kỹ thuật nuôi cấy tế bào
thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn
lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy [64].
Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các HCTC
từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều HCTC được sản xuất trong suốt
quá trình phân hóa tế bào, vì thế ch ng được tìm thấy trong các mô có khả năng
ph n hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không
xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất th cấp có khuynh hướng ngưng tạo
thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi
cấy huyền phù thư ng tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có
sự tiếp xúc với môi trư ng khác các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện
ở một m c độ nào đó trong khối để tạo thành các HCTC [7].
Nuôi cấy tế bào thực vật sinh trưởng chậm hơn so với vi khuẩn, th i gian
nh n đôi trong khoảng 24-72 gi . Sự khác nhau này dẫn đến việc phải sử dụng các
điều kiện vô trùng tuyệt đối cho nuôi cấy tế bào thực vật. Thông thư ng, tế bào nuôi
cấy không quang hợp, vì vậy phải bổ sung đư ng làm nguồn carbon. Đ y là nguồn
năng lượng hiệu quả nhất để sản xuất HCTC. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào nhanh

5
hơn so với nuôi cấy callus hay mô, cơ quan; thao tác dễ dàng và có khả năng tương
thích với các thiết bị nuôi cấy tế bào sử dụng cho vi sinh vật [79].
1.1.1. C ươ g y o c v t
1.1.1.1. Nuôi cấy mẻ
Nuôi cấy mẻ là phương pháp nuôi cấy mà trong suốt th i gian nuôi cấy
không thêm vào chất dinh dưỡng cũng như không loại bỏ sinh khối hay sản phẩm
cuối cùng của quá tr nh trao đổi chất. Do vậy, các điều kiện môi trư ng thay đổi
theo th i gian, mật độ tế bào tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống. Nuôi cấy
mẻ được xem là một hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng và phát triển theo
một số pha nhất định với những điều kiện đ c trưng [8].
Trước khi nuôi cấy mẻ, cần thiết phải tiến hành cấy chuyển. Quá trình nuôi
cấy đầu tiên trong b nh tam giác, sau đó tế bào nuôi cấy được đưa vào hệ lên men
nhỏ, rồi cấy chuyển vào hệ lên men lớn hơn. C tiếp tục như vậy cho đến khi đạt
được thể tích thích hợp. Điều kiện bên trong hệ lên men sẽ thay đổi trong một chu
kỳ nuôi cấy mẻ, với sản phẩm và nồng độ tế bào tăng trong khi chất dinh dưỡng cạn
kiệt dần. Nhưng không có thành phần nào được bổ sung vào trong chu kỳ nuôi cấy.
Tất cả mẻ nuôi cấy sẽ được thu hồi khi sản phẩm th cấp đạt giá trị cực đại [8].
Các bình ch a mẫu được đ t trên máy lắc với tốc độ 50-200 vòng/phút ho c
có thể nuôi cấy trong hệ lên men có cánh khuấy và sục khí tạo thuận lợi cho sự trao
đổi khí, sự lưu thông của môi trư ng dinh dưỡng trong b nh nuôi cũng như gia tăng
sự tiếp xúc giữa tế bào nuôi cấy với môi trư ng. Trong đó, nuôi cấy dịch huyền phù
ch a các tế bào và các khối tế bào sinh trưởng ph n tán trong môi trư ng lỏng.
Thư ng khởi đầu bằng cách đ t các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trư ng lỏng
chuyển động (lắc ho c khuấy) [8].
Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những
chuyển động xoáy của môi trư ng. Sau một th i gian ngắn nuôi cấy, trong dịch
huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào với k ch thước khác nhau, các
mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền
phù hoàn hảo, ch a tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. M c độ

6
tách r i của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đ c tính của các khối tế bào xốp và
có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trư ng [63].
1.1.1.2. Nuôi cấy mẻ đ ạn
Phương pháp nuôi cấy mẻ hai giai đoạn được áp dụng đối với nhiều loại tế
bào thực vật, và thành công đầu tiên là sản xuất hợp chất shikonin. Trong phương
pháp này, hai môi trư ng được sử dụng. Trong hệ lên men đầu tiên, điều kiện nuôi
cấy được tối ưu hóa cho sản xuất sinh khối tế bào. Sau đó, các tế bào được tập trung
và đưa vào hệ lên men th hai ch a môi trư ng kích thích sự tổng hợp các sản
phẩm th cấp [8].
1.1.1.3. Nuôi cấy mẻ có cung cấp d dưỡng
Đ y là một hình th c khác của hệ thống nuôi cấy mẻ. Sau khi tế bào nuôi cấy
sinh trưởng cực đại, các chất dinh dưỡng sẽ dần cạn kiệt, lúc này các chất dinh
dưỡng mới sẽ được cung cấp thêm vào hệ lên men mà không loại bỏ dịch nuôi cũ.
Trong hệ lên men này, có hệ thống điều khiển hàm lượng các chất dinh dưỡng được
thêm vào giúp hạn chế hay tăng cư ng tốc độ sinh trưởng ho c sự t ch lũy HCTC.
Tuy nhiên, trong trư ng hợp này thể tích dịch nuôi sẽ tăng lên, môi trư ng dinh
dưỡng dưới dạng đậm đ c sẽ được sử dụng để hạn chế vấn đề này. Đ y vẫn được
gọi là nuôi cấy mẻ vì toàn bộ thể tích của hệ lên men cuối cùng vẫn được thu hồi
theo từng mẻ [8].
1.1.1.4. Nuôi cấy liên tục
Nhược điểm của nuôi cấy mẻ là tốn th i gian khử trùng và cấy chuyển. Nuôi
cấy liên tục là phương pháp kinh tế hơn vì giúp kéo dài th i gian nuôi cấy hay kéo
dài pha log ít nhất vài tháng. Ở hệ thống này, dòng đi vào (môi trư ng mới) bằng
với dòng đi ra (môi trư ng + tế bào và hợp chất trao đổi) để giữ thể tích luôn không
đổi, và điều kiện của hệ thống luôn duy trì ổn định [79].
Do vậy, trong phương pháp nuôi cấy liên tục không những k ch thước trung
bình, trạng thái sinh lý của tế bào mà cả môi trư ng nuôi cấy đều không đổi và
không phụ thuộc vào th i gian, điều này một m t tạo điều kiện nghiên c u sinh
trưởng và sinh lý của tế bào, m t khác cải thiện quá trình sản xuất tế bào ở qui mô
công nghiệp [8].

7
Bản chất của quá trình nuôi cấy liên tục ở trạng thái ổn định cũng có thuận
lợi do dễ dàng điều chỉnh hơn hệ lên men mẻ. Trong suốt th i gian nuôi cấy mẻ,
nhiệt lượng, sự sản xuất kiềm ho c acid, và sự tiêu hao oxygen sẽ biến thiên từ các
tốc độ rất thấp ở lúc bắt đầu tới tốc độ rất cao trong suốt pha log muộn. Vì vậy, điều
chỉnh môi trư ng của một hệ thống như thế khó hơn nhiều so với quá trình liên tục
ở trạng thái ổn định các tốc độ sản xuất và tiêu thụ là hằng số [79].
Về lý thuyết, nuôi cấy liên tục là phương pháp nuôi cấy đầy triển vọng để thu
được các sản phẩm với nồng độ cao; Seki và cs (1997), Phisalaphong và Linden
(1999) đã nghiên c u tăng hiệu suất paclitaxel bằng nuôi cấy liên tục tế bào Taxus
cuspidata và sử dụng nuôi cấy bán liên tục tế bào T. canadensis [94].
Tuy nhiên, vẫn còn nhiều hạn chế trong nuôi cấy liên tục. Các tế bào luôn ở
trạng thái sinh lý không đổi, nhưng sự t ch lũy các HCTC thư ng diễn ra trong các
tế bào có tốc độ sinh trưởng thấp. Vì vậy, kỹ thuật này chỉ nên áp dụng cho những
sản phẩm trao đổi nào được sản xuất trong quá tr nh sinh trưởng. Nhược điểm th
hai của nuôi cấy liên tục là th i gian nuôi cấy dài làm tăng khả năng dễ bị nhiễm bởi
vi sinh vật (Ramawat và Merillon, 2004).
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện và sản xuất
các hoạt chất sinh học có giá trị. Khả năng ng dụng của phương pháp này thể hiện
qua việc có rất nhiều công trình nghiên c u mới được công bố. Những năm gần đ y,
sự phát triển của các HCTC quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi
nhất trong lĩnh vực nghiên c u này, đ c biệt là khả năng có thể thay đổi nguồn lợi
các hoạt chất sinh học từ thực vật bằng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào. Ưu thế về
m t nguyên lý của công nghệ này là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để
tách chiết một tỷ lệ lớn lượng dược chất từ tế bào thực vật nuôi cấy [64].
1.1. . ả ứ
1. p ấ ấp
Hiện tượng trao đổi chất th cấp đã được công nhận từ giai đoạn sớm của thí
nghiệm thực vật hiện đại. Trong công trình xuất bản năm 1873, Julius Sachs, một
ngư i tiên phong trong sinh lý thực vật, đã mô tả như sau: "Ch ng ta có thể chỉ rõ

8
các sản phẩm phụ của quá tr nh trao đổi chất như là các hợp chất được tạo ra bởi
trao đổi chất, nhưng ch ng không chỉ được sử dụng cho việc hình thành các tế bào
mới. Vai trò quan trọng khác của những hợp chất này đối với việc kiểm soát bên
trong thực vật vẫn chưa được biết đến". Sachs không đề cập đến những ch c năng
của các sản phẩm phụ mà ngày nay được biết đến là các HCTC (dẫn theo
Neumannn, 2009) [66].
Các sản phẩm trao đổi th cấp thư ng chiếm một lượng nhỏ (nhỏ hơn 1%
trọng lượng khô) và độc lập cao trong th i kỳ sinh lý và phát triển của thực vật.
M c dù vai trò của HCTC dư ng như không được thừa nhận trong việc duy trì quá
trình sống cơ bản của thực vật - nơi mà ch ng được tổng hợp, chúng lại có vai trò
quan trọng trong sự tương tác giữa thực vật với môi trư ng. Nghiên c u chất trao
đổi th cấp thực chất là lĩnh vực hấp dẫn của sinh lý học thực vật nói riêng hay thực
vật học nói chung [66].
Các HCTC có tác dụng dược lý ho c độc t nh đến con ngư i và động vật
được gọi là các hoạt chất sinh học ở thực vật. Hoạt chất sinh học điển hình ở thực
vật cũng được h nh thành như các HCTC [27].
1.1.2.2. Vai trò củ p ấ ấp
HCTC được sản xuất trong cơ thể thực vật bên cạnh con đư ng sinh tổng
hợp và chuyển hóa sơ cấp của các hợp chất đ ch trong quá tr nh sinh trưởng và phát
triển (như carbohydrate, amino acid, protein và lipid). Ch ng có thể được xem như
là những sản phẩm hóa sinh "dự trữ" trong tế bào thực vật và không cần thiết cho
các ch c năng hàng ngày của cây. Trong hệ thống phát sinh loài, hoạt chất sinh học
th cấp ở thực vật được tổng hợp một cách ngẫu nhiên nhưng ch ng có những vai
trò nhất định. Một số trong chúng có khả năng nắm giữ các vai trò quan trọng trong
đ i sống thực vật. Ví dụ, flavonoid có thể bảo vệ chống lại các gốc tự do được sinh
ra trong quá trình quang hợp; terpenoid có thể thu hút côn trùng thụ phấn, phát tán
hạt, ho c c chế cạnh tranh giữa các loài thực vật; alkaloid giúp tránh sự tấn công
của động vật ăn cỏ ho c các loại côn trùng (phytoalexin). HCTC còn có tác dụng
phát tín hiệu phân tử tế bào ho c mang những ch c năng khác trong cơ thể thực vật.
Việc sản xuất các HCTC ở thực vật thư ng tuân theo quy luật. Do đó, hầu hết các

9
loài thực vật, ngay cả những loài c y lương thực phổ biến cũng có khả năng sản
xuất những loại hợp chất này. Tuy nhiên, các loài thực vật có độc tính ho c dược
t nh điển hình ch a những hoạt chất sinh học mạnh với nồng độ cao hơn so với các
loại c y lương thực [27].
Tế bào thực vật đã được sử dụng thành công như là một nhà máy sản xuất
lượng lớn HCTC dưới các điều kiện cụ thể [66]. Sản xuất HCTC bằng nuôi cấy tế
bào thực vật giúp khắc phục những khó khăn của phương pháp truyền thống như r t
ngắn th i gian, giảm chi phí nhân công, vấn đề m t bằng và nhất là có thể thu được
một lượng lớn sản phẩm như mong muốn. Ngày nay, phương pháp này đã được ng
dụng rộng rãi trên quy mô lớn và ngày càng có nhiều nghiên c u chuyên sâu nhằm
điều khiển để tăng hàm lượng các HCTC t ch lũy trong tế bào thực vật được nuôi
cấy.
Các nghiên c u cho thấy rằng nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản xuất
các sản phẩm th cấp với hàm lượng lớn hơn so với các chất đó được chiết từ cây
ngoài tự nhiên (Bảng 1.1) [63].
Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng
tin cậy dựa trên cơ sở:
- Tổng hợp các HCTC có giá trị được thực hiện dưới sự điểu khiển các yếu
tố môi trư ng nuôi cấy, độc lập với khí hậu và thổ nhưỡng.
- Loại bỏ các ảnh hưởng sinh học đến sản xuất HCTC trong tự nhiên.
- Chọn giống cây trồng cho nhiều loại HCTC với sản lượng cao hơn.
- Với việc tự động hóa, điều khiển sinh trưởng và điều hòa quá trình chuyển
hóa của tế bào, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên.
- Kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm.
- Một số sản phẩm trao đổi chất từ dịch nuôi cấy huyền phù có chất lượng
cao hơn c y hoàn chỉnh [64].

10
Bảng 1.1. Sản phẩm thứ c p từ nuôi c y t bào th c v t so sánh v i cây t nhiên [63]
HCTC Loài th c v t
Hiệu su t (% dw)
Nuôi c y
t bào
Cây t nhiên
Shikonin
Ginsenoside
Anthraquinones
Ajmalicine
Rosmarinic acid
Ubiquinone-10
Diosgenin
Berberine
Berberine
Anthraquinone
Anthraquinone
Nicotine
Bisoclaurine
Tripdiolide
Lithospermum erythrorhizon
Panax ginseng
Morinda citrifolia
Catharanthus roseus
Coleus blumeii
Nicotiana tabacum
Dioscorea deltoides
Thalictrurn minor
Coptis japonica
Galium verum
G. aparbze
N. tabacum
Stephania cepharantha
Tripterygium wilfordii
20,00 (s)
27,00 (c)
18,00 (s)
1,00 (s)
15,00 (s)
0,036 (s)
2,00 (s)
10,00 (s)
10,00 (s)
5,40 (s)
3,80 (s)
3,40 (c)
2,30 (s)
0,05 (s)
1,50
4,50
2,20
0,30
3,00
0,0003
2,00
0,01
2,00-4,00
1,20
0,20
2,00
0,80
0,001
* Chú thích: (c): nuôi cấy callus; (s): nuôi cấy huyền phù.
1.1. . C g ứ sả ứ g y o
1. ư
Để sản xuất các sản phẩm th cấp từ thực vật, mô thực vật ngoại sinh từ cây
hoàn chỉnh được nuôi cấy huyền phù trong điều kiện vô trùng. Nhiều sản phẩm trao
đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn
trong cây hoàn chỉnh [42]. Các HCTC không chỉ là gia vị, chất tạo màu, tạo mùi mà
hầu hết là dược liệu.
Ở nước ta, một số dược liệu cũng được nghiên c u tách chiết từ tế bào thực
vật. Chẳng hạn, vincristin, vinblastin từ tế bào dừa cạn, solasodine từ tế bào cà gai
leo, curcumin từ tế bào nghệ đen, asiaticoside từ tế bào rau má …
Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) là một trong những loài c y dược liệu

11
ch a nhiều alkaloid. Từ dừa cạn ngư i ta chiết được các chất chữa ung thư như
vinblastin, vincristin và chữa cao huyết áp như ajmalicin, serpentin. Tuy nhiên, hàm
lượng của những chất này trong cây tự nhiên rất thấp. Bùi Văn Lệ và Nguyễn Ngọc
Hồng (2006) đã nghiên c u khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của một số chất kích thích
sinh trưởng lên quá trình tạo sinh khối tế bào và t ch lũy alkaloid toàn phần có trong
dịch nuôi cấy [5].
Solasodine là một hợp chất chính trong cây cà gai leo (S. hainanense) có
nhiều tác dụng dược lý đã được nghiên c u và công bố. Solasodine được tách chiết
từ cây tự nhiên nhưng hàm lượng chưa cao và nguồn nguyên liệu ngày càng khan
hiếm. Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2010) đã nghiên c u sản xuất solasodine từ callus
cây cà gai leo in vitro và thu được kết quả cho thấy, hàm lượng solasodine t ch lũy
trong callus cao hơn khoảng 8,5 lần so với tách chiết từ rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi
[56]. Nhóm tác giả này (2011) cũng tiếp tục nghiên c u nuôi cấy tế bào cà gai leo
trong chai tam giác để thu solasodine và nhận thấy, solasodine t ch lũy trong tế bào
cao hơn trong callus [59].
Asiaticoside là hoạt chất chính của rau má (Centella asiatica), có hoạt tính
chống oxy hóa, chữa lành vết bỏng, bảo vệ tế bào thần kinh và sinh tổng hợp
collagen [7]. M c dù có nhiều hoạt tính quan trọng nhưng hàm lượng asiaticoside
trong c y rau má không đáng kể. Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2008) đã nghiên c u
tạo callus và khảo sát khả năng t ch lũy asiaticoside trong callus c y rau má [6].
Thiết lập nuôi cấy tế bào huyền phù cây rau má và khảo sát sự t ch lũy asiaticoside
trong tế bào nuôi cấy cũng đã được Loc và An (2010) nghiên c u [55].
Quinone là một nhóm ch c nổi bật với tác dụng kháng lao, chống ung thư,
chữa phong, chống hen suyễn... được xác nhận có trong thành phần của Drosera
burmanni, là một loài thực vật bắt mồi nhỏ, thân thảo, mang nhiều giá trị ng dụng.
Quách Ngô Diễm Phương và cs (2010) đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền
phù tế bào cây D. burmanni cho mục tiêu thu nhận quinone. Kết quả ghi nhận hàm
lượng Plumbagin (một trong nhóm những hợp chất naphthoquinone) trong sinh khối
tế bào là 0,02% [11].
Dịch chiết các loài Drosera đã từng được ch ng minh về khả năng kháng

12
oxy hóa từ rất nhiều nghiên c u trên thế giới cũng như từ khả năng trị liệu trong
những bài thuốc dân gian. Quách Ngô Diễm Phương và cs (2011) đã sàng lọc và ly
trích thành công một hợp chất flavonoid từ ph n đoạn cao chiết có hoạt tính kháng
oxy hóa từ sinh khối cây D. indica nuôi cấy in vitro. Hợp chất được tinh sạch và xác
định cấu trúc là quercetin [13].
1. ư c
Một số dược chất có nguồn gốc thực vật như mao địa hoàng từ Digitalis
purpurea chữa trị rối loạn tim mạch, codeine từ cây anh túc (Papaver somniferum)
làm thuốc giảm đau, an thần, vinblastine và vincristine từ cây dừa cạn (C. roseus)
điều trị bệnh bạch cầu và quinine từ cây C. officinalis bệnh sốt rét. Routian và
Nickell nhận được bằng sáng chế đầu tiên về sản xuất một số hợp chất bằng nuôi
cấy tế bào thực vật vào năm 1956. Nhiều nhà nghiên c u đã sản xuất các hợp chất
có ích bằng nuôi cấy rễ tơ, callus và tế bào huyền phù. Sự đa dạng của các nguyên
liệu thực vật có thể thích ng với nuôi cấy rễ tơ và callus. Nuôi cấy tế bào huyền
phù Thalictrum minus sản xuất stomachic và berberine. Nuôi cấy callus Stizolobium
hassjo sản xuất thuốc chữa parkinson L-dopa. Nuôi cấy huyền phù Hyoscyamus
niger sản xuất một dẫn xuất của hyoscyamine chống tác động kiểu cholin [94].
Ngư i ta cũng đã thu được các chất như caffein từ nuôi cấy tế bào cây cà phê
(Coffea arabica), betalain trong callus củ cải đư ng, berberin từ tế bào cây Coptis
japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được hàm lượng đáng kể
berberin trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần bằng phương
pháp nuôi cấy tế bào). Những chất này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp
hương liệu và trong y học [92].
Rễ của cây nhân sâm (P. ginseng) là một loại dược phẩm quý giá, có tác
dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đư ng, suy nhược cơ thể... Trong rễ của
nó ch a nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau. Trong đó, ginsenoside-Rb có
hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích. Furuya và cs (Đại học Kitasato,
Nhật) đã nghiên c u nuôi cấy mô callus P. ginseng từ những năm 1970. Kaisha
(1990) đã nghiên c u quy trình sản xuất trên quy mô lớn, sử dụng nhiều kiểu hệ lên
men khác nhau. Năm 1990, Staba (Đại học Minnesota, Mỹ) cũng đã thu được các tế

13
bào nuôi cấy P. ginseng ch a ginsenoside. Choi (1993) đã nghiên c u nuôi cấy P.
ginseng trên quy mô công nghiệp, tác giả nhận thấy 2,4-D và KIN ảnh hưởng tới
hàm lượng saponin trong callus và các tế bào nuôi cấy huyền phù; 3,62% saponin
tổng số được tìm thấy trong callus nuôi cấy trên môi trư ng cơ bản MS bổ sung
5,00 mg/L 2,4-D và 1,00 mg/L KIN, nhưng lại thu được 8,78% khi nuôi cấy trên
môi trư ng có 10,00 mg/L 2,4-D và 1,00 mg/L KIN (dẫn theo Misawa, 1994) [63].
Callus Taxus mairei được tạo ra từ mảnh lá và th n trên môi trư ng B5 bổ
sung 2 mg/L 2,4-D ho c NAA. Dòng tế bào được tạo ra từ callus có nguồn gốc từ
th n và lá. Một trong những dòng tế bào này sau khi bổ sung các tiền chất và nuôi
trong 6 tuần th c một l t dịch huyền phù tế bào sẽ sản xuất khoảng 200 mg taxol
[64].
Chất tanshinone I và cryptotanshinone của c y Salvia miltiorrhiza có tác dụng
ngăn ngừa biến ch ng thiếu máu cục bộ ở cơ tim; tanshinone II A đã thử nghiệm thành
công trong điều trị l m sàng ch ng đau thắt ngực ở Trung Quốc. Vincristine và
vinblastine được sản xuất bằng nuôi cấy tế bào ở c y dừa cạn (Catharanthus roseus)
là các indole alkaloid đã trở thành thuốc có giá trị trong hóa trị liệu ung thư (theo
Vijaya, 2010) [103].
1. . ELICITOR C C
C C C C
1.2.1. Elicitor
1.2.1.1.
Elicitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ
vào hệ thống tế bào sống thì khởi động ho c cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC
trong tế bào. Sự kích kháng thực vật là quá trình cảm ng ho c tăng cư ng sinh
tổng hợp các chất chuyển hóa th cấp do sự bổ sung theo hàm lượng của elicitor
[65].
Elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc từ mầm bệnh và các chất được tiết ra
từ thực vật bằng phản ng của mầm bệnh (elicitor nội sinh). Trên cơ sở bản chất tự
nhiên, elicitor có thể được ph n thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor

14
sinh học.
- Elicitor p s là các chất có nguồn gốc không thuộc sinh vật học,
gồm các muối vô cơ, các kim loại n ng và các tác nh n vật lý như sóng siêu m, áp
suất, nhiệt độ, và pH.
- El s là các chất có nguồn gốc sinh vật học, bao gồm các
polysacharide có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật (pectin ho c cellulose), các vi
sinh vật (chitin ho c glucan) và các glycoprotein, G-protein hay các protein nội bào
có ch c năng là gắn với các receptor và tác động bằng cách hoạt hóa ho c bất hoạt
một số enzyme ho c các kênh ion.
Bảng 1.2. Phân lo i elicitor trong sản xu t các h p ch t thứ c p [65]
A. Theo bản ch t elicitor
Các elicitor sinh h c Các elicitor phi sinh h c
- Được giải phóng trực tiếp từ vi sinh vật và
được chấp nhận bởi tế bào thực vật (các
enzyme, các mảnh thành tế bào)
- Được tạo thành bởi hoạt động của vi sinh
vật trên tế bào thực vật (các đoạn pectin) ...
- Được tạo thành bởi hoạt động của enzyme
thực vật trên các thành tế bào vi khuẩn
(chitosan, glucan)
- Các hợp chất: nội sinh và tạo thành trong tự
nhiên; được hình thành ho c tiết ra bởi tế bào
thực vật khi đáp ng kích thích khác nhau.
- Tác dụng tự nhiên của các tác nhân vật lý ho c
hóa học theo đư ng nội sinh tạo thành các
elicitor sinh học
- Tia UV, Windfall
- Các protein biến tính (Rnase)
- Đông và rã đông
- Các thành phần không thiết yếu của môi trư ng
(agarose, thiếc ...)
- Các kim loại n ng
- Dùng các hóa chất:
+ Có ái lực cao với DNA
+ Có hoạt tính phá vỡ màng tế bào như thuốc
tẩy: các xenobiochemical;
+ Thuốc diệt nấm (maneb, butylamin, benomyl);
thuốc diệt cỏ (acifluorofen)
B. Theo nguồn gốc c a elicitor
Các elicitor ngo i sinh Các elicitor nội sinh
- Hình thành từ bên ngoài tế bào, bao gồm
phản ng trực tiếp ho c qua các chất nội sinh
trung gian
- Polysaccharide: glucomanose, glucan,
- Được tạo thành qua các phản ng th cấp, cảm
ng bằng một tín hiệu sinh học ho c phi sinh học
trong tế bào
- Dodeca-β-1,4-D-galacturonide

15
chitosan
- Peptide và chuỗi các ion dương:
monilicolin, poly-L-lysine, polyamine,
glycoprotein
- Enzyme: polygalacturonase, endo-
polygalacturonase acid lyase, cellulase
- Acid béo: acid arachidonic, acid
eicosapentanoic
- Hepta-β-glucoside
- Alginate oligomer
Ngoài ra, có thể ph n loại elicitor dựa trên nguồn gốc của ch ng. Có 2 loại
elicitor là elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh
- Elicitor ạ s là các chất có nguồn gốc bên ngoài tế bào như các
polysaccharide, polyamine và các acid béo.
- Elicitor ội sinh là các chất có nguồn gốc bên trong tế bào, được h nh thành
thông qua các phản ng th cấp, được cảm ng bằng t n hiệu sinh học hay phi sinh
học, chẳng hạn như galacturonide ho c hepta-β-glucoside v.v...[65].
1. dụ
Elicitor thực vật là các hóa chất có nguồn gốc khác nhau, có khả năng g y nên
các đáp ng về m t h nh thái, sinh lý và t ch lũy phytoalexin (chất được sinh ra ở
thực vật khi chịu tác động của các tác nh n g y bệnh). Ch ng có thể là các elicitor
phi sinh học như các ion kim loại, hợp chất vô cơ ho c elicitor sinh học có nguồn
gốc từ nấm, vi khuẩn ho c động vật ăn cỏ, mảnh vỡ thành tế bào thực vật cũng như
các hợp chất được giải phóng ra tại vị tr tổn thương của thực vật do mầm bệnh
ho c động vật tấn công. Việc thực vật bị xử lý bằng chất k ch kháng ho c bị tấn
công bằng mầm bệnh g y ra một loạt các phản ng phòng vệ, bao gồm sự t ch lũy
các HCTC bảo vệ ở cả trong c y tự nhiên cũng như trong nuôi cấy. M c dù đã có
những nghiên c u s u về cơ chế ảnh hưởng của elicitor lên sự sản xuất HCTC trong
các thực vật, tuy nhiên cơ chế của sự elicitor vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Có nhiều
giả thuyết đã được đưa ra như cơ chế truyền tin bởi Ca2+
, các yếu tố ảnh hưởng đến
sự nguyên vẹn của màng tế bào, các con đư ng c chế hay hoạt hóa nội bào ho c sự
thay đổi áp suất thẩm thấu [65].

16
Elicitor không chỉ cảm ng sự hình thành phytoalexin de novo mà còn hoạt
hóa sự sinh tổng hợp nhiều hợp chất chủ yếu trong tế bào nuôi cấy. Sự tổng hợp
sesquiterpene gossypol ở Gossypium arboretum tăng lên hơn 100 lần khi dùng
elicitor có nguồn gốc từ Verticillum dablia, hay sự tăng sinh tổng hợp của
benzopheanthridine alkaloid sanguinarine lên 26 lần khi sử dụng elicitor trong nuôi
cấy huyền phù tế bào Papaver somniferum. Sự cảm ng sinh tổng hợp isoflavonoid
ở huyền phù tế bào Pueraria lobata bằng elicitor sinh học (dịch chiết nấm men) hay
elicitor phi sinh học (CuCl2) đã được nghiên c u, đ c biệt ở m c độ phân tử.
Elicitor tạo điều kiện để nghiên c u ở m c phân tử của con đư ng truyền tín hiệu
thông qua những tín hiệu ngoại bào dẫn đến sự sinh tổng hợp HCTC, liên quan tới
chất truyền tín hiệu th hai như nhóm oxygen hoạt hóa, Ca2+
và phosphoinositide
[65].
Những nghiên c u chuyên s u đã góp phần h nh thành cơ chế cho quá trình
cảm ng bằng elicitor ở thực vật. Các nghiên c u chủ yếu tập trung về các elicitor
sinh học và carbohydrate thông thư ng, còn sự hiểu biết về tác động của các elicitor
phi sinh học trong việc gia tăng vượt m c các HCTC ở thực vật vẫn còn rất sơ sài,
quá trình cảm ng bằng elicitor được giả thuyết là bao gồm tín hiệu Ca2+
, các nhân
tố đảm bảo tính nguyên vẹn của tế bào, sự ngăn cản hay hoạt hóa các con đư ng nội
bào và thay đổi áp suất thẩm thấu hoạt động như một tác nhân gây stress.
Những nghiên c u bước đầu về sự tác động của các elicitor sinh học ở hệ
thống thực vật được nghiên c u dựa vào cơ chế cảm ng trên tế bào động vật. Ở tế
bào động vật, các thụ quan (receptor) định vị ở màng tế bào sẽ hoạt hóa kênh ion và
protein kinase. Tương tự như thế, các bằng ch ng ch ng minh sự hiện diện của các
thụ quan ở màng tế bào thực vật đã được ghi nhận. Cơ chế cảm ng này dựa trên sự
tương tác giữa elicitor-thụ quan. Khi tế bào thực vật được xử lý với elicitor thì một
loạt các phản ng sinh hóa xảy ra, bao gồm:
- Elicitor gắn vào thụ quan ở màng tế bào.
- Thay đổi dòng ion vào thông qua màng tế bào thực vật như kênh Cl-
, K+
,
…, ở thực vật, Ca2+
hoạt động như chất truyền tin th hai với các đáp ng khác
nhau từ tín hiệu của môi trư ng kể cả mầm bệnh. Ví dụ, ở tế bào c y ngò t y, ngư i

17
ta từng phát hiện ra kênh calci đáp ng cảm ng và một kênh vận chuyển vào của
calci được tìm thấy trong vòng vài phút sau khi thêm vào elicitor từ nấm.
- Gia tăng hoạt tính của phospholipase thực vật được tìm thấy ở một vài mô
thực vật và nuôi cấy tế bào thực vật sau khi xử lý với elicitor, tổng hợp các tín hiệu
th cấp như InsP3 và deacylglycerol (DAG), giải phóng tín hiệu nội bào trung gian
Ca2+
, nitric oxyde và con đư ng tín hiệu octadecanoid.
- Sự thay đổi nhanh trong việc phosphoryl hóa protein được quan sát dựa
trên việc bổ sung elicitor của các nuôi cấy tế bào khác nhau. Những nghiên c u gần
đ y ch ng minh rằng sự phosphoryl hóa đóng một vai trò quan trọng trong sự
chuyển tín hiệu thực vật chống lại mầm bệnh và stress, hoạt hóa protein kinase.
- Hoạt hóa protein G (là một phần trong việc đáp ng tín hiệu với elicitor).
- Hoạt hóa NADPH oxydase đáp ng AOS (active oxide specie), acid hóa
cytosol.
- Tái sắp xếp lại bộ xương tế bào.
- Tạo các oxy hoạt động.
- T ch lũy các protein có liên quan đến mầm bệnh như chitinase và
glucanase, endopolygalacturonase… các nh n tố ngăn cản protease.
- Sự chết tế bào ở vị trí bị xâm nhiễm.
- Sự thay đổi cấu trúc ở màng tế bào (lignin hóa màng tế bào, tích tụ mô sẹo).
- Hoạt hóa phiên mã các gen đáp ng kháng.
- Các phân tử đề kháng của thực vật như tanin, phytoalexin được phát hiện 2-
4 gi sau khi xử lý với elicitor.
- Tổng hợp jasmonic và acid salicylic như một thông tin th cấp.
- Đáp ng tập nhiễm SAR (systemic acquired resistance).
Không phải tất cả các elicitor đều diễn ra theo chuỗi sự kiện phía trên, những
nghiên c u về trật tự th i gian của những sự kiện này và sự kết nối bên trong giữa
chúng còn nhiều ph c tạp và vẫn đang được nghiên c u [25].
1.2.1.3. Các y u tố ả ưở đ n quá trình cảm ng
Tăng cư ng sản xuất HCTC từ nuôi cấy tế bào thực vật thông qua sự cảm
ng đã mở ra một hướng nghiên c u mới trong công nghiệp dược phẩm. Các thông

18
số như thành phần và nồng độ elicitor, th i gian cảm ng, tuổi nuôi cấy, dòng tế
bào, chất điều hòa sinh trưởng, thành phần dinh dưỡng và đ c điểm thành tế bào
phù hợp có thể tăng khả năng t ch lũy các sản phẩm th cấp [65].
Nồng độ elicitor: Nồng độ elicitor đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình
cảm ng. Prakash và cs (2008) nhận thấy khi bổ sung các elicitor jasmonic acid, YE
và chitosan ở các nồng độ khác nhau đều tác động đến sự t ch lũy azadirachtin trong
tế bào Azadirachtin indica. Bổ sung jasmonic acid và YE ở nồng độ cao (100 mg/L)
cho hiệu quả t ch lũy azadirachtin tốt hơn ở nồng độ thấp (10-50 mg/L). Trong khi
đó, nồng độ chitosan thấp (50 mg/L) k ch th ch azadirachtin t ch lũy cao hơn và
giảm dần khi tăng lượng chitosan (100-500 mg/L) [77].
Thời gian tiếp xúc với elicitor: Nghiên c u của Namdeo và cs (2007) cho
thấy sản xuất ajmalicine tăng khoảng 3 lần bởi ở tế bào C. roseus được cảm ng với
dịch chiết của T. viride trong 48 gi , trong khi đó tăng 2 lần ở tế bào được cảm ng
bởi dịch chiết của A. niger và F. moniliforme. Tuy nhiên, th i gian tiếp x c cao hơn
96 gi làm giảm ajmalicine t ch lũy. Kết quả tương tự cũng được công bố bởi
Rijhwani và Shanks (1998), Moreno và cs (1993), Negeral và Javelle (1995) [65].
Thời kỳ nuôi cấy: Th i điểm cấy chuyển là một yếu tố quan trọng trong sản
xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học nh sự cảm ng. Kết quả sản xuất
ajmalicine từ tế bào C. roseus của Namdeo và cs (2007) cho thấy ajmalicine cao
nhất (166 µ/g, dw) được t ch lũy trong tế bào 20 ngày tuổi được xử lý với dịch chiết
của T. viride [65].
Thành phần dinh dưỡng: Thành phần môi trư ng cũng đóng một vai trò quan
trọng cho quá trình cảm ng. Theo Namdeo và cs (2007), sự t ch lũy ajmalicine
trong môi trư ng Zenk nhiều hơn so với môi trư ng MS [65].
Ngoài ra, ảnh hưởng của sự cảm ng cũng còn phụ thuộc vào đ c tính của
elicitor, dòng tế bào ho c các dòng vi sinh vật sử dụng elicitor, sự có m t của các
chất điều hòa sinh trưởng, thành phần dinh dưỡng của môi trư ng và các điều kiện
nuôi cấy [65].
1.2.2. Nghiên cứu ứ g d g elicitor o g y o
1.2.2.1. Nghiên c u ở ư

19
Tại Việt Nam, việc sử dụng elicitor trong các nghiên c u cải thiện khả năng
t ch lũy các HCTC khi nuôi cấy tế bào mới được quan tâm trong th i gian gần đ y.
Quách Ngô Diễm Phương và cs (2010) đã thử nghiệm tăng sinh hàm lượng
quinone trong cây D. burmanni in vitro bằng phương pháp sử dụng elicitor. Kết quả
cho thấy khả năng làm thay đổi hàm lượng hoạt chất trong cây in vitro của các tác
nhân cảm ng bao gồm: chất dẫn truyền tín hiệu (SA), tác nhân cảm ng cây phản
ng phòng vệ (vi khuẩn và nấm men) hay kỹ thuật g y stress điều kiện nuôi cấy
(stress dinh dưỡng). Trong đó, khi bổ sung dịch chiết nấm men, hàm lượng quinone
tăng từ 1,12-2,66 lần so với đối ch ng, salicylic acid làm tăng 1,2-2,0 lần, sinh khối
vi khuẩn làm tăng 1,22-2,46 lần và g y stress dinh dưỡng làm tăng 1,15-1,5 lần hàm
lượng quinone trong cây so với đối ch ng [12].
Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2012) nghiên c u ảnh hưởng của 2-hydroxy-
benzoic acid và dịch chiết nấm men đến việc tăng khả năng sinh tổng hợp
asiaticoside trong nuôi cấy tế bào cây rau má (Centella asiatica). Kết quả nhận thấy
khi bổ sung ở ngày th 10 của nuôi cấy lần lượt 100 µM 2-hydroxybenzoic acid và
4 g/L dịch chiết nấm men, hàm lượng asiaticoside t ch lũy trong tế bào rau má tăng
gấp 5 và 3,5 lần so với đối ch ng không cảm ng [57].
1.2.2.2. Nghiên c u ở trên th gi i
Trên thế giới cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên c u về ảnh
hưởng của elicitor lên sự sinh trưởng và khả năng t ch lũy HCTC từ nuôi cấy tế bào
thực vật. Hầu hết các nghiên c u cho thấy hàm lượng HCTC tăng lên khi bổ sung
elicitor. Cụ thể:
Pereira và cs (2007) sử dụng các elicitor sinh học (Candida albicans,
Fusarium oxyporum, Penicillium avelanium và Saccharomyces cerevisiae) để
nghiên c u tăng khả năng t ch lũy triterpene (oleanolic acid và ursolic acid) trong
nuôi cấy tế bào Tebernaemontana catharinensis. Kết quả cho thấy, S. cerevisiae có
khả năng làm tăng t ch lũy triterpene tốt nhất, đạt 5 và 7 mg/g khối lượng khô lần
lượt cho ursolic và oleanolic acid. Trong khi đó các elicitor còn lại ảnh hưởng kém
hơn đến khả năng t ch lũy triterpene trong nuôi cấy tế bào T. catharinensis [73].

20
Ramawat và cs (2008) đã nghiên c u cải thiện khả năng t ch lũy
isofllavonoid trong tế bào loài Pueraria tuberosa bằng MeJA, SA và YE. Kết quả
cho thấy isoflavonoid đạt được cao nhất khi bổ sung 150 mg/L YE [80].
Keng và cs (2010) sử dụng 4 loại elicitor: chitosan, NaH2PO4, Na2CO3 và
polyvinylpyrrolidone (PVP) để khảo sát ảnh hưởng của ch ng đến khả năng t ch lũy
alkaloid trong tế bào Eurycoma longifolia nuôi cấy huyền phù. Hai alkaloid trong
nghiên c u này là 9-hydroxycanthin-6-one và 9-methoxycanthin-6-one. Kết quả sau 13
ngày nuôi cấy có xử lý elicitor cho thấy, bổ sung NaH2PO4 tăng khả năng t ch lũy 2
loại alkaloid cao hơn các loại elicitor còn lại. Cụ thể ở nồng độ 2 mg/L và 20 mg/L
NaH2PO4 lần lượt đạt được 0,94% 9-methoxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-
one là 0,75% so với đối ch ng 0,08% [50].
Rhee và cs (2010) nghiên c u tăng cư ng khả năng t ch lũy decursin và
decursinol trong nuôi cấy rễ và rễ tự nhiên của cây Angelica gigas Nakai bằng
elicitor. Các loại elicitor được sử dụng gồm YE, chitin, MeJA, SA và Cu2+
. Nuôi
cấy rễ A. gigas với sự bổ sung kết hợp 2 g/L YE và 0,5 mM Cu2+
tại pha cuối của
đư ng cong sinh trưởng đã tăng sự t ch lũy decursin và decursinol lên 6,86 mg/l,
cao gấp 3,22 lần so với đối ch ng [86].
Cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) được nuôi cấy in vitro trong hệ lên men
2,5 L sau 17 đến 22 tuần. Cousins và cs (2010) đã sử dụng nhiều elicitor khác nhau
để tăng khả năng tổng hợp các HCTC ở cây này. Ở thí nghiệm th nhất,
phenylalanine ho c MeJA được bổ sung vào môi trư ng nuôi cấy từ tuần th 12 đến
17. Thí nghiệm th 2, c y con được bổ sung các chất như proline, dịch chiết cá giàu
proline, MeJA ho c chitosan vào tuần th 20 (th i gian kéo dài 1,5 tuần). Sau 5
tuần xử lý ở thí nghiệm th nhất, sinh khối của cây giảm và sự t ch lũy các hợp chất
chống oxy hóa cũng giảm, sự suy giảm khả năng chống oxy hóa tương tự nhau khi
xử lý riêng lẽ phenylalanine, MeJA ho c xử lý kết hợp. Ở thí nghiệm th 2, khi xử
lý stress nitrogen ở nồng độ thấp, hàm lượng các hợp chất phenol tăng lên, chiếm
4,7% khối lượng khô, cao hơn đối ch ng chiếm 4,1% khối lượng khô [40].
Hiệu quả của các oligosaccharide (DP4, DP7 và DP10) tách chiết từ Fusarium
oxysporum Dzf17 lên khả năng sản xuất diosgenin ở c y Dioscorea zingiberensis đã

21
được Li và cs (2011) nghiên c u. Tế bào huyền phù được xử lý elicitor sau 26 ngày
nuôi (hỗn hợp oligosaccharide ở nồng độ 20 mg/L) và thu vào ngày th 32. Hàm
lượng diosgenin thu được cao nhất là (2,187 mg/L), gấp 5,65 lần so với đối ch ng
(0,387 mg/L). Xử lý elicitor riêng lẻ ở các nồng độ 2-10 mg/L, công th c xử lý DP7
6 mg/L cho hiệu quả cao nhất, hàm lượng diosgenin đạt 3,202 mg/L, gấp 8,27 lần
đối ch ng. Khi xử lý DP7 hai lần vào ngày 24 và 26 và thu vào ngày 30, hàm lượng
diosgenin tăng lên đáng kể (4,843 mg/L, gấp 12,38 lần so với đối ch ng) [53].
Veerashree và cs (2012) đã nghiên c u ảnh hưởng của elicitor lên sự tạo thành
gymnemic acid trong nuôi cấy huyền phù tế bào Gymnema sylvestre. Nuôi cấy dịch
huyền phù tế bào G. sylvestre được xử lý với 4 elicitor khác nhau: MeJA, YE,
chitin, và pectin. Kết quả cho thấy cả 4 loại elicitor được thử nghiệm đều cảm ng
sự tạo thành gymnenic acid trong nuôi cấy huyền phù. Hàm lượng gymnemic acid
đạt được cao nhất sau khi xử lý với YE (100,47 mg/L), tiếp đó MeJA (70,43 mg/L),
pectin (64,19 mg/L) và chitin (62,72 mg/L). Việc bổ sung elicitor đã có những tác
động quan trọng đến sự sinh trưởng tế bào so với mẫu đối ch ng tương ng. Hàm
lượng gymnemic acid đạt cao nhất sau khi xử lý với 0,5 g/L dịch YE trong 20 ngày
nuôi cấy, cao gấp 5,25 lần so với mẫu đối ch ng [102].
Bota và cs (2012) đã sử dụng 2 chủng Botrytis và Sclerotinia là tác nhân cảm
ng để sản xuất flavonoid ở c y Digitalis lanata. Các tác giả đã sử dụng 1-2 mL
dịch nấm/100 mL dịch huyền phù để cảm ng dòng tế bào số 11 và 13. Kết quả cho
thấy ở cả 2 dòng tế bào và 2 elicitor, sự t ch lũy flavonoid đều tăng theo th i gian và
nồng độ xử lý. Hàm lượng flavonoid thu được sau 96 gi cảm ng, tế bào dòng 11
đạt 1000 mg% với Botrytis và 999,81 mg% với Sclerotinia, dòng tế bào 13 đạt
1051,65 mg% với Botrytis và 1025,43 mg% với Sclerotinia [32].
Admeh và cs (2014) đã sử dụng dịch chiết A. niger, Penicillium notatum,
YE, và chitosan để cảm ng sản xuất psoralen trong quá tr nh nuôi cấy tế bào c y
Psoralea corylifolia. Xử lý elicitor bằng A. niger làm tăng quá tr nh sản xuất
psoralen lên 9 lần so với đối ch ng. Xử lý bằng Penicillium notatum, YE, và
chitosan làm tăng t ch lũy psoralen lên 4-7 lần. Công th c xử lý A. niger ở nồng độ
1% cho hiệu quả cao nhất, hàm lượng psoralen đạt 9,850 μg/g sinh khối khô [21].

22
Nghiên c u ảnh hưởng của MeJA đến khả năng t ch lũy astragaloside ở rễ tơ
cây Astragalus membranaceus 34 ngày tuổi, Jiao và cs (2014) nhận thấy hàm lượng
đạt cao nhất khi xử lý 157,4 µM MJ trong 18,4 gi . Astragaloside đạt 5,5 ± 0,13
mg/g khối lượng khô, cao hơn 2,1 lần so với mẫu đối ch ng (2,7 ± 0,05 mg/g khối
lượng khô) [49].
Các elicitor sinh học (dịch chiết Rhizopus oligosporus và A. niger) và phi
sinh học (MeJA và SA) đã được Vaddadi và cs (2015) sử dụng để tăng cư ng khả
năng tổng hợp các hoạt chất sinh học ở cây cà phê vối (Coffea canephora). Kết quả
nghiên c u cho thấy các elicitor đã làm tăng đáng kể các HCTC được tổng hợp,
caffeine tăng 42%, theobromine tăng 39%, trigonelline tăng 46%, cafestol và
kahweol tăng 32% [100].
1.3. CÂY C
1. .1. s
1. ố p ố
Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuộc họ Cà (Solanaceae), còn
có tên khoa học khác là Solanum procumbens. Ngoài ra, cà gai leo còn có nhiều tên
gọi địa phương khác như: cà quánh, cà quạnh, cà quýnh, cà bò, cà cạnh, cà hải nam,
cà gai dây [2].
Cà gai leo mọc rải rác ven rừng, lùm bụi, bãi hoang, ven đư ng, ở độ cao
dưới 300 m. Phân bố ở Bắc Giang (Yên Thế), Phú Thọ (Việt Trì), Hà Nội (Bưởi),
Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Khánh
Hoà, Gia Lai (An Khê, Kon Hà Nừng). Ngoài ra, còn có ở Trung Quốc (Hải Nam,
Quảng Đông, Quảng Tây) [9].
1. đ dư l ủ l
1.3.1.2.1. Đặc điểm hình thái và thành phần hóa học
Cà gai leo thuộc loại cây leo, thân dài 0,6-1,0 m hay dài hơn, rất nhiều gai dẹp,
cành xoè rộng, trên phủ lông hình sao. Lá hình tr ng hay thuôn, phần gốc lá hình
r u hay hơi tròn, mép nguyên hay lượn và khía thùy, hai m t nhất là m t dưới phủ
lông trắng nhạt, phiến dài 3-4 cm, rộng 12-20 mm, có gai, cuống dài 4-5 mm. Hoa

23
tím nhạt, nhị vàng họp thành xim gồm 2-4 hoa. Quả hình cầu, khi chín có màu vàng
bóng, nhẵn, đư ng kính 5-7 mm. Hạt màu vàng, hình thận, có mang dài 4 mm, rộng
2 mm [19].
Thành phần hoá học: toàn c y và đ c biệt ở rễ có ch a alkaloid, thành phần
chính là solasodine, solasodinine. Ngoài ra, còn ch a tinh bột, saponoside,
flavonoside và diosgenine [2].
1.3.1.2.2. Giá trị dược lý
Cà gai leo là một cây thuốc quý, rễ được dân gian dùng làm thuốc chữa thấp
khớp, ho, dị ng, đau nh c xương, đau răng, trị rắn cắn, đau lưng, cảm cúm…
Thấp khớp là một bệnh khá phổ biến do nhiều tác nhân gây ra. Trong y học
cổ truyền, có nhiều bài thuốc chữa thấp khớp kết hợp nhiều loại dược liệu trong đó
có cà gai leo. Cà gai leo có tác dụng trừ phong thấp, tiêu độc, trừ ho, cầm máu, giảm
đau. Đoàn Thị Nhu và cs (1998) đã ch ng minh cà gai leo có tác dụng chống viêm
cấp trên mô hình gây phù thực nghiệm bằng cao hư, chống viêm mãn trên mô hình
gây u hạt thực nghiệm bằng amian trên chuột cống trắng, đồng th i gây teo tuyến c
trên chuột cống non. Ngoài ra, còn có những công trình nghiên c u khác ch ng
minh cà gai leo có tác dụng kháng viêm, giảm đau, giảm sự phát triển của quá trình
xơ trong xơ gan thực nghiệm trên chuột [3].
Phạm Kim Mãn và cs (1999) đã nghiên c u tác dụng chống ung thư của cà
gai leo và kết luận rằng, chế phẩm dịch chiết từ cây cà gai leo nồng độ 5 mg/100
mL có tác dụng hủy diệt tế bào ung thư 180 Sarcoma với tỷ lệ tế bào chết là 52,8%
[9].
Việc nghiên c u thăm dò khả năng ngăn ch n tiến triển xơ của cà gai leo trên
mô h nh g y xơ gan thực nghiệm của Maros (1966) cho thấy sau 3 tháng g y xơ gan
trên chuột cống trắng, xơ gan hình thành rõ rệt, thể hiện trên các chỉ tiêu hóa sinh và
tổ ch c học. Ở th i điểm 5 tuần, quá trình bệnh lý mới tiến triển tới giai đoạn thoái
hóa mô gan, chưa có sự gia tăng rõ rệt của collagen. Nhưng khi xơ đã ở giai đoạn
hoàn chỉnh, song song với các biến đổi về tổ ch c học, hàm lượng collagen ở gan
xơ cũng tăng cao gấp 2,5 lần so với b nh thư ng. Dịch chiết cà gai leo với liều cho
uống hàng ngày 6 g/kg thể trọng chuột, tuy không ngăn ch n hoàn toàn được quá

24
tr nh xơ hóa, nhưng có tác dụng làm chậm quá trình tiến triển của xơ. Hàm lượng
collagen trong gan ở lô chuột dùng dịch chiết cà gai leo chỉ bằng 71% so với lô
chuột đối ch ng g y xơ không dùng thuốc. Về m t tổ ch c học, thí nghiệm cho thấy
toàn bộ chuột ở lô đối ch ng g y xơ đều bị xơ n ng ho c vừa, còn ở lô dùng cà gai
leo hầu hết chỉ xơ nhẹ ho c không xơ [18].
Gần đ y, nhiều tác dụng khác của cà gai leo được phát hiện như: kháng
viêm, c chế xơ gan giai đoạn kịch phát, giảm nhẹ khối u. Viện Dược liệu (2001) đã
bào chế thành công thuốc "Haina" từ cà gai leo, đạt tiêu chuẩn cơ sở có hàm lượng
glycoalkaloid toàn phần trong mỗi viên từ 2,125 mg đến 2,875 mg tính theo
solasodine. Sau đó, tiến hành thử tác dụng lâm sàng trên bệnh nhân viêm gan B mạn
hoạt động. Kết quả cho thấy Haina có tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm, c chế xơ
gan, đồng th i có tác dụng tốt trên các chỉ thị virus viêm gan B [3].
Trong những năm gần đ y, vấn đề gốc tự do và các ch ng bệnh gây ra do
quá tr nh peroxide hóa lipid gia tăng như lão hóa, viêm hoại tử tế bào, ung thư...
được các nhà khoa học đ c biệt quan tâm. Nguyễn Thị Bích Thu và cs (2001) đã
khảo sát tác dụng chống oxy hóa của cà gai leo. Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy
dịch chiết glycoalkaloid toàn phần có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Những kết quả
thu được góp phần giải th ch cơ chế tác dụng kháng viêm, bảo vệ gan của chế phẩm
Haina [14].
Cà gai leo có tác dụng bảo vệ gan chống lại những tổn thương g y ra bởi
Trinitrotoluene (TNT), tác dụng này là do sự tương tác giữa các chất chuyển hóa
của TNT với thành phần của cà gai leo và giữa cà gai leo với tế bào gan. TNT xâm
nhập vào cơ thể sẽ được chuyển hóa trong tế bào gan và làm gia tăng sự hình thành
của superoxide và hydrogen peroxide. Chúng tấn công vào cấu trúc lipoprotein của
màng tế bào gan bằng chuỗi phản ng lipoperoxide gây ra sự phá hủy tế bào gan.
Flavonoid là tác nhân kháng oxy hóa của cà gai leo có thể hạn chế chuỗi phản ng
lipoperoxide gây ra bởi tác nhân oxy hóa. Cà gai leo còn ch a saponin steroid làm
tăng s c chống chịu của màng tế bào gan dưới sự tấn công của TNT và các tác nhân
oxy hóa [98].

25
1. . . C g ứ solasodine
1. s l s d
1.3.2.1.1. ấ o con đường ch ển h
- Công th c tổng quát: C27H43NO2
Hình 1.1. C u trúc hóa h c c a solasodine
- Con đư ng chuyển hóa:
Sinh tổng hợp solasodine nói riêng hay spirosolane alkaloids nói chung có
liên quan mật thiết với sinh tổng hợp spirostane steroids có cùng cấu trúc vòng [61].
Nhóm spirosolane chỉ khác nhóm spirostane ở nguyên tử oxygen của vòng F
được thay bằng -NH. Một điểm cần chú ý là ở đ y có isomer ở C-22 (khác với
nhóm spirostan). Ví dụ solasonin có trong cây cà Úc S. laciniatum có cấu trúc (25R)
22 còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25S) 22.
Việc thêm nitrogen vào alkaloid xảy ra muộn trong con đư ng phát sinh sinh vật.
Điều này phổ biến khi tìm thấy trong cả solasodine và diosgenine hay chlorogenine
cùng nhau trong các loài thực vật. Tỷ lệ giữa diosgenine và solasodine trong lá của
S. laciniatum giới hạn trong khoảng 1:7 và 1:16 [61].
Con đư ng thông thư ng được chấp nhận của sinh tổng hợp steroid trong
thực vật được trình bày trong hình 1.2. Khởi đầu từ acetyl-CoA biến đổi thành
cholesterol thông qua con đư ng mevalonic acid. Những phản ng giả thiết trong
hình 1.6 cho thấy xuyên suốt quá trình nghiên c u những hợp chất này là một chất
trung gian teinemine. Teinemine có thể là một phần trong con đư ng sản xuất hai
stereoisomer là solasodine và tomatidenol, ho c là solanidine [61].

26
Hình 1.2. Co ường khả thi tổng h p steroid trong th c v t
cải ti n từ c a Kaneko và cs (1976) [61]

27
Thí nghiệm ch ng minh cho con đư ng giả thuyết này ở chỗ hầu hết toàn bộ
các tiền chất đã biết trong thí nghiệm này có thể dự đoán được sản phẩm chuyển
hóa cuối cùng. Vòng carbon của cấu trúc steroid solasodine chắc hẳn xuất phát từ
nhóm methyl hay carboxyl carbon của acetic acid. Điều này được lưu ý bởi sự thoái
biến sau khi tiến hành nhiễm xạ acetic acid hay mevalonic acid cây S. laciniatum,
xác nhận được có định vị phóng xạ trong carbon dự đoán của solasodine (dẫn theo
Mann, 1979) [61].
Nhóm spirosolane chỉ khác nhóm spirostane ở nguyên tử oxygen của vòng F
được thay bằng -NH. Một điểm cần chú ý là ở đ y có isomer ở C-22 (khác với
nhóm spirostan). Ví dụ solasonin có trong cây cà Úc S. laciniatum có cấu trúc (25R)
22 còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25S) 22.
Việc thêm nitrogen vào alkaloid xảy ra muộn trong con đư ng phát sinh sinh vật.
Điều này phổ biến khi tìm thấy trong cả solasodine và diosgenine hay chlorogenine
cùng nhau trong các loài thực vật. Tỷ lệ giữa diosgenine và solasodine trong lá của
S. laciniatum giới hạn trong khoảng 1:7 và 1:16 [61].
Con đư ng thông thư ng được chấp nhận của sinh tổng hợp steroid trong
thực vật được trình bày trong hình 2.2. Khởi đầu từ acetyl-CoA biến đổi thành
cholesterol thông qua con đư ng mevalonic acid. Những phản ng giả thiết trong
hình 1.6 cho thấy xuyên suốt quá trình nghiên c u những hợp chất này là một chất
trung gian teinemine. Teinemine có thể là một phần trong con đư ng sản xuất hai
stereoisomer là solasodine và tomatidenol, ho c là solanidine [61].
Thí nghiệm ch ng minh cho con đư ng giả thuyết này ở chỗ hầu hết toàn bộ
các tiền chất đã biết trong thí nghiệm này có thể dự đoán được sản phẩm chuyển
hóa cuối cùng.
Vòng carbon của cấu trúc steroid solasodine chắc hẳn xuất phát từ nhóm
methyl hay carboxyl carbon của acetic acid. Điều này được lưu ý bởi sự thoái biến
sau khi tiến hành nhiễm xạ acetic acid hay mevalonic acid cây S. laciniatum, xác
nhận được có định vị phóng xạ trong carbon dự đoán của solasodine (dẫn theo
Mann, 1979) [61].

28
Nghiên c u nuôi cấy mô cũng cung cấp thêm thông tin minh ch ng. Nuôi
cấy mô cây S. xanthocarpum tổng hợp solasodine khi có 2,4-D hơn là dùng IAA
như một auxin. Khi nuôi cấy dịch huyền phù S. xanthocarpum được bổ sung thêm
cholesterol th solasodine thu được cao gấp 20 lần. Điều này là phù hợp với giả thiết
ở hình 3.2 [61].
1.3.2.1.2. c d ng dược gi ị d ng
- Nhiệt độ nóng chảy: 200 – 202o
C.
Solasodine là một loại steroid alkaloid có trong các cây họ Cà (Solanaceae).
Nó có thể thay thế cho diosgenin để tổng hợp thương mại các loại hormon steroid
khác nhau. Solasodine đã được báo cáo là có thể chống ung thư [35], c chế độc hại
nhiều loài sinh vật [89]. Solasodine alkaloid c chế acetylcholinsterase - một
enzyme quan trọng trong việc truyền xung động thần kinh [88]. Gần đ y, solasodine
được biết như một tác nhân hóa trị liệu mới cho điều trị ung thư đ c biệt là ung thư
da [36].
1. sả ấ s l s d ấ ở
l
Có khoảng gần 100 loài Solanum khác nhau được công bố có ch a
solasodine ở một hay nhiều bộ phận khác nhau (bảng 1.2). Tuy nhiên, chỉ có một số
t loài được xem là có thể sản xuất solasodine thương mại [61].
Bảng 1.3. Tổng h p một số loài Solanum sinh ra solasodine [61]
Loài Cơ q sol sod e
lư ng solasodine
(% khố lư ng khô)
S. abutiloides Lá 0,01-0,03
S. alatum - 0,30
S. astroites - 0,30
S. atriplicifolium - 1,00
S. atropurpureum - 0,10
S. auriculatum - 0,50
S. boerhaviaefolium - 0,20
S. boerhaavii - 0,06

29
S. cornutum - 0,60
S. douglasii - 0,10
S. flavum - 0,80
S. guineense - 0,10
S. haematocarpum - 0,10
S. humile - 0,70
S. laciniatum - 1,00-3,80
S. luteum - 0,50
S. marginatum - 0,10-0,50
S. melanocerasum - 0,10
S. memphiticum - 0,20
S. miniatum - 1,00
S. nodiflorum - 0,30
S. ochroleucum - 0,60
S. paranense - 0,07
S. pyracanthum - 0,20
S. sodomaeum - 1,00
S. tomentosum - 1,00
S. venosum - 0,20
S. verbascifolium - 1,60
S. villosum - 1,00
S. xanthocarpum - 0,70
S. aculeatissium Quả 2,00-3,00
S. americanum - 0,20
S. astroites - 0,60
S. atriplicifolium - 0,50
S. auriculatum - 1,70
S. boerhaviaefolium - 0,20
S. boerhaavii - 0,02
S. capsiciforme - 0,06
S. ciliatum - 0,20
S. curtipes - 0,10

30
S. eleagnifolium - 2,00-3,00
S. flavum - 0,90
S. furcatum - 0,30
S. gracile - 0,70
S. guineense - 0,10
S. haematocarpum - 0,20
S. heterophyllum - 0,60
S. incanum - 4,00
S. inopinum - 1,00
S. intergrifolium - 0,10
S. interandium - 0,10
S. jubatum - 2,20
S. khasianum - 5,00
S. laciniatum - 3,60
S. linearifolium - 0,83
S. luteum - 0,80
S. macrocarpum - 0,20
S. mammosum - 2,00
S. marginatum - 0,70-2,30
S. melanocerasum - 0,30
S. memphiticum - 0,07
S. miniatum - 0,50
S. nodiflorum - 0,20
S. ochroleucum - 0,60
S. platanifolium - 1,90
S. pyracanthum - 0,10
S. quinquangulare - 0,90
S. roxburghii - 0,40
S. saponaceum - 0,01-0,09
S. sarachoides - 0,30
S. simile - 0,76
S. sodomaeum - 1,90

31
S. symonii - 0,18
S. torvum - 0,10
S. trachycyphyum - 3,20
S. trilobatum - 3,50
S. umbellatum - 1,50
S. venosum - 0,40
S. vescum - 0,14
S. villosum - 1,00
S. xanthocarpum - 3,00
S. aviculare Toàn bộ
S. platanifolium -
S. indicum Quả và thân/cuống
S. kieseritzkii Phần khí sinh
S. laciniatum Thân/cuống 0,10-0,30
S. lorentzii Đỉnh
S. pyretifolium -
S. quitoense - 0,02
S. rostratum - 0,03
S. saponaceum - 0,03
S. sodomaeum Chồi 0,90
Nigra và cs (1987) đã nghiên c u sự t ch lũy solasodine trong callus từ các
bộ phận khác nhau của S. eleagnifolium là trụ dưới lá mầm, lá mầm, rễ, lá và quả.
Kết quả nhận thấy, callus trong môi trư ng MS cải tiến có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D
đều có khả năng t ch lũy solasodine dù nguồn gốc của chúng không giống nhau.
Callus từ lá mầm, trụ dưới lá mầm và lá t ch lũy solasodine cao nhất sau 4 và 5 tuần
nuôi cấy. Solasodine t ch lũy trong callus từ quả đạt cực đại sau 7 tuần và callus từ
rễ là từ 3 tuần nuôi cấy [69].
Tiếp tục nghiên c u ảnh hưởng của auxin, ánh sáng và sự phân hóa tế bào
đến khả năng t ch lũy solasodine trong callus S. eleagnifolium, Nigra và cs (1989)
nhận thấy bổ sung 4,5 µM 2,4-D vào môi trư ng nuôi cấy callus hàm lượng

32
solasodine t ch lũy cao nhất so với bổ sung IAA (5,7 µM), NAA (5,4 µM), IBA (4,9
µM) hay 2,4,5-T (3,9 µM). Trong điều kiện tối, solasodine t ch lũy thấp hơn so với
khi chiếu sáng chu kỳ 16 gi /ngày. Mô phân hóa bởi cân bằng đầy đủ kích thích
sinh trưởng (tỷ lệ 2,5 µM IBA và 8,8 µM BAP) sản xuất solasodine nhiều hơn các
mô không có sự phân hóa này [67].
Nigra và cs (1990) cũng tiến hành nghiên c u ảnh hưởng của nguồn carbon
và nitrogen đến sinh trưởng và t ch lũy solasodine trong nuôi cấy mẻ dịch huyền
phù S. eleagnifolium. Trên môi trư ng MS cải tiến có 4,5 µM 2,4-D với các nguồn
carbon khác nhau: fructose, glucose, maltose và sucrose. Nghiên c u cho thấy ở
cùng nồng độ lần lượt là 90 mM và 180 mM, cả bốn nguồn carbon đều có khả năng
làm tăng lượng solasodine t ch lũy sau 11 ngày nuôi cấy, tuy nhiên 180 mM sucrose
sau 6 ngày nuôi cấy đạt lượng solasodine cao nhất (0,9 mg/g). Đối với nguồn
nitrogen, kết quả cho thấy sử dụng phối hợp NH4NO3 và KNO3 với tỷ lệ 2:1
solasodine t ch lũy cực đại (4,08 mg/g khối lượng khô) [68].
Quadri và cs (1993) tiến hành nghiên c u ảnh hưởng của elicitor đến việc
t ch lũy solasodine trong tế bào S. eleagnifolium. Chủng nấm thuộc loài Alternaria
sp. phân lập từ các điểm bệnh trên bề m t quả chín của cây S. eleagnifolium hoang
dại được sử dụng như elicitor. Các dòng tế bào 14 ngày tuổi được xử lý elicitor
trong 48-72 gi , kết quả nhận thấy hàm lượng solasodine tăng khoảng 65% trong
nuôi cấy dịch huyền phù [78].
Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng như tuổi và kích
cỡ mẫu đưa vào nuôi cấy in vitro đến khả năng sản xuất solasodine trong cây S.
eleagnifolium đã được Alvarez và cs (1993) nghiên c u. Hàm lượng solasodine tăng
cao hơn khi phối hợp NAA (50 µM) và kinetin (0,25 µM) so với sử dụng riêng lẻ,
tăng từ 0,8 mg/L đến 2,54 mg/L. Mẫu 19 ngày tuổi với kích cỡ 5% v/v được lựa
chọn nuôi cấy trong bioreactor để sản xuất solasodine [23]. Năm 1994, nhóm tác giả
tiếp tục nghiên c u sự t ch lũy solasodine trong nuôi cấy các cơ quan biến nạp (rễ
và chồi) của S. eleagnifolium. Trong các dòng biến nạp của tế bào rễ với
Agrobacterium rhizogenes LBA 9402, dòng 5 có hàm lượng solasodine t ch lũy cao
nhất (1,9 mg/L) sau 30 ngày nuôi cấy [24]. Parsons và cs (2001) cũng nghiên c u

33
sản xuất solasodine từ protoplast có nguồn gốc từ nuôi cấy huyền phù tế bào của
cùng một đối tượng S. eleagnifolium Cav. [72].
Weissenberg (2001) đã ph n lập solasodine bằng cách thủy phân trực tiếp
các cây thuộc chi Solanum hay các glycoside của chúng [105].
Bhatnagar và cs (2004) sử dụng phương pháp nuôi cấy mô cây S. laciniatum
để sản xuất solasodine. Solasodine t ch lũy cao nhất trong callus sau 30 ngày nuôi
cấy, và tăng lên 1,2 đến 1,4 lần khi bổ sung thêm L-arginine (50-150 mg/L). Các
chồi tái sinh trên môi trư ng có 4,0 mg/L BA cho hiệu quả t ch lũy solasodine cực
đại, gấp khoảng 10 lần so với callus [30].
Bhat và cs (2008) tiến hành gây stress m n để tăng sự t ch lũy solasodine
trong S. nigrum. Các mô in vitro phát triển khác nhau (callus không tái sinh, callus
tái sinh và chồi tái sinh từ lá) được nuôi cấy trong điều kiện stress m n (0-150 mM
NaCl) để tăng hàm lượng solasodine. Trong môi trư ng có 150 mM NaCl, các
callus tái sinh phát triển và đạt lượng solasodine cao nhất trong các mẫu thí nghiệm
(2,39 mg/g khối lượng khô) sau 12 tuần nuôi cấy [28]. Khảo sát các chồi và lá tái
sinh từ callus cũng nhận thấy solasodine t ch lũy cao hơn so với các chồi ex vitro
(Bhat và cs, 2010) [29]. Sutkovic và cs (2011) cũng nghiên c u đối với callus 15
ngày tuổi của S. nigrum khi xử lý nồng độ NaCl từ 50-200 mM sau 8 tuần nuôi cấy,
ghi nhận kết quả hàm lượng solasodine t ch lũy tăng hơn so với đối ch ng không xử
lý NaCl [96].
Yogananth và cs (2009) tiến hành phân lập so sánh solasodine từ nuôi cấy in
vitro và in vivo của cây S. nigrum nhận thấy, solasodine t ch lũy trong phần lá non
của cây in vivo (0,0798 mg/g) thấp hơn trong callus in vitro. Callus in vitro nuôi
trong môi trư ng bổ sung k ch th ch sinh trưởng khác nhau thì sự t ch lũy
solasodine cũng khác nhau. Solasodine t ch lũy cao nhất trong các thí nghiệm khi
callus nuôi cấy có bổ sung 2,5 mg/L IAA + 0,5 mg/L BAP (0,142 mg/g) và 2,0
mg/L NAA + 0,5 mg/L BAP (0,1162 mg/g) [107].
1. . . C g ứ ố ư g g leo
C y cà gai leo đã được Viện Dược liệu ch ng minh có tác dụng kháng viêm,

34
bảo vệ gan, hạn chế sự tạo thành xơ của các tổ ch c và thuốc “Haina” bào chế từ cà
gai leo đã được thử nghiệm trên lâm sàng (tại Bệnh viện 103) có kết quả tốt đối với
bệnh nhân viêm gan B mạn thể hoạt động [3].
Năm 2000, Nguyễn B ch Thu và cs đã nghiên c u tác dụng của cà gai leo
trên collagenase là một enzyme có tác dụng đ c hiệu trên collagen. Trong các
trư ng hợp bệnh lý như xơ gan, xơ phổi… có sự tăng t ch tụ collagen ở các tổ ch c
này. Quá trình thoái hóa tổ ch c collagen có sự tham gia của collagenase. Bình
thư ng collagenase ở dạng không hoạt động. Khi có các tác nh n tác động như
corticosteroid, bỏng, viêm loét… hoạt động của collagenase mới thể hiện rõ [14].
Nguyễn B ch Thu và cs (2001) đã áp dụng kỹ thuật ELISA để khảo sát mối
tương tác giữa protein sinh ung thư (oncoprotein-E6, E6AP và E7) với sản phẩm
gen c chế ung thư p53 và Rb đã gi p phát hiện dịch chiết từ cà gai leo có tác dụng
chống ung thư do virus như ung thư cổ tử cung, ung thư gan g y bởi các virus HPV,
HBV… [16].
Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2005) đã nghiên c u ảnh hưởng của một số chất
k ch th ch sinh trưởng lên khả năng tái sinh in vitro cây cà gai leo [6].
Nguyễn Hữu Thuần Anh và cs (2008) đã nghiên c u khả năng t ch lũy
glycoalkaloid toàn phần trong callus của cây cà gai leo (Solanum hainanense
Hance). Kết quả cho thấy glycoalkaloid toàn phần tích lũy trong callus của cà gai
leo đạt cực đại sau 10 tuần nuôi cấy (37,73 mg/mL) trên môi trư ng cơ bản MS có
bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L BAP [1].
Loc và Thanh (2011) đã nghiên c u khả năng t ch lũy glycoalkaloid toàn
phần trong tế bào cà gai leo trong nuôi cấy tế bào huyền phù. Kết quả cho thấy hàm
lượng glycoalkaloid toàn phần t ch lũy cao nhất trong tế bào sau 4 tuần nuôi cấy
trong môi trư ng và điều kiện tối ưu gấp 5,9 lần so với rễ c y 1 năm tuổi ngoài tự
nhiên [59].

35
C ươ g
C
2.1. C
Tế bào cà gai leo (Solanum hainanense Hance) nuôi cấy in vitro từ callus
được tạo ra từ cây in vitro.
Hình 2.1. Cây cà gai leo in vitro
2. . C
2.2.1. Xác định khả năng sinh trưởng và t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo.
2.2.2. Nghiên c u ảnh hưởng của elicitor đến khả năng sinh trưởng và t ch lũy
solasodine của tế bào cà gai leo:
- Ảnh hưởng của MeJA: nồng độ: 25-250 µM sau đó chọn nồng độ tốt nhất
tiếp tục nghiên c u th i gian nuôi cấy 7 tuần và th i điểm cảm ng từ 7-21 ngày.
- Ảnh hưởng của YE: nồng độ : 1-5 g/L, sau đó chọn nồng độ tốt nhất tiếp
tục nghiên c u th i gian nuôi cấy 7 tuần và th i điểm cảm ng từ 7-21 ngày.
- Ảnh hưởng của SA: nồng độ: 50-250 µM, sau đó chọn nồng độ tốt nhất tiếp
tục nghiên c u th i gian nuôi cấy 7 tuần và th i điểm cảm ng từ 7-21 ngày.
- Ảnh hưởng kết hợp của các elicitor: kết hợp 2 elicitor, kết hợp 3 elicitor:
chọn nồng độ riêng lẽ tốt nhất phối hợp với các nồng độ nghiên c u của elicitor còn

36
lại. Chọn nồng độ phối hợp tốt nhất tiếp tục nghiên c u th i gian nuôi cấy 7 tuần và
th i điểm cảm ng từ 7-21 ngày.
2.2.3. Khảo sát sơ bộ hoạt tính sinh học của dịch chiết solasodine lên khả năng c
chế collagenase.
2.2.4. Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro của
cây cà gai leo.
2. . C
2. .1. ươ g y o
2.3.1.1. Nuôi cấy cây in vitro
Các đoạn thân có mắt lá của cây cà gai leo ngoài tự nhiên rửa sạch bằng
nước xà phòng loãng dưới dòng nước chảy, khử trùng cồn 70% trong 1 phút, HgCl2
0,1% trong 8 phút, rửa lại bằng nước cất khoảng 5 lần trước khi cấy lên môi trư ng
tạo cây in vitro (S0) [4]. Thành phần môi trư ng S0: môi trư ng MS, sucrose 30g,
agar 0,8g; IBA 0,5 mg/L. Đoạn thân ch a mắt lá (dài khoảng 2,5-3,0 cm) được chọn
từ các cành có độ dài khoảng 30 cm trên c y 1 năm tuổi (lấy 5 mắt lá/cành tính từ
ngọn).
Các đoạn thân có mắt lá của cây in vitro tiếp tục được cấy trên môi trư ng S0
để nhân cây tạo nguyên liệu.
2. ấ ll s
Nuôi cấy callus từ các bộ phận khác nhau (cuống lá, mảnh lá, đoạn thân và
đoạn rễ) của cây cà gai leo in vitro trên môi trư ng cơ bản MS có saccharose 30
g/L, agar 8 g/L, bổ sung NAA 0,1 mg/L và 2,4-D 1,0 mg/L [1]. Kết quả cho thấy
các callus tạo từ cuống lá, đoạn th n và đoạn rễ có màu vàng nhạt, tương đối r i
rạc, thích hợp để làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào.
Callus 3 tuần tuổi được cắt thành những khối nhỏ đư ng kính khoảng 0,5 cm
để nhân sinh khối trên cùng môi trư ng nhưng thay 0,1 mg/L NAA bằng 0,1 mg/L
BAP [59].

37
2. ấ
Chọn các callus có màu vàng nhạt, rắn và r i (chủ yếu callus có nguồn gốc từ
đoạn thân, cuống lá và đoạn rễ) để nuôi cấy tế bào. Nghiền nhỏ (sử dụng đầu que cấy
hay đầu dao cấy để tách các tế bào r i ra, một số ít cụm tế bào tương đối khó phá r i
nên dùng dao cấy để chia nhỏ) 3 g callus trong điều kiện vô trùng để chuyển vào nuôi
ở bình tam giác 250 mL ch a 50 mL môi trư ng nhân sinh khối callus (không bổ
sung agar) ở tốc độ lắc 120 vòng/phút. Sau 4 tuần, tế bào được chuyển sang môi
trư ng mới có thành phần giống môi trư ng ban đầu và nuôi trong cùng điều kiện
cho đến khi thu được dịch tế bào huyền phù đồng nhất.
Tế bào sau 4 tuần nuôi cấy tăng sinh được sử dụng cho các thí nghiệm thăm
dò elicitor, nồng độ và th i điểm bổ sung ch ng vào môi trư ng. Mỗi lần cấy chuyển,
lắc đều bình mẫu để có dịch tế bào đồng nhất, hút 20 mL dịch tế bào (khoảng 1,65 g)
đưa vào b nh ch a môi trư ng MS có 40 g sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D
nuôi ở tốc độ lắc 150 vòng/phút [59].
2.3.1.3. Xử lý cảm ng t bào
Bổ sung methyl jasmonate (25-250 µM), dịch chiết nấm men (1-5 g/L), và
salicylic acid (50-250 µM) ở dạng riêng rẽ ho c phối hợp các nồng độ tối ưu của
ch ng vào môi trư ng nuôi cấy tế bào tại các th i điểm khác nhau: lúc bắt đầu nuôi
cấy (0 ngày), 7, 14 và 21 ngày sau khi nuôi cấy.
Tất cả môi trư ng dinh dưỡng được điều chỉnh đến pH 5,8 trước khi khử trùng
ở 121o
C, trong 15 phút. Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro được giữ ở nhiệt độ 25 
2o
C, cư ng độ ánh sáng 2000-3000 lux (đối với callus, tương đương 28-42
µmolphoton/m2
/s) và 500 lux (đối với tế bào huyền phù, tương đương 7
µmolphoton/m2
/s), th i gian chiếu sáng 10 gi /ngày.
2. 4 X đ nh sinh khối t bào
- Tế bào được lọc qua giấy lọc và rửa sạch môi trư ng bằng nước cất bằng hệ
thống lọc ch n không, c n để xác định khối lượng tươi. Tế bào sau đó được sấy khô
ở 50o
C trong khoảng 24 gi cho đến khi khối lượng không đổi, c n để xác định khối

38
lượng khô.
- Chỉ số sinh trư ng (GI) được tính theo công th c:
i
f
FW
FW
GI 
Trong đó: FWi là sinh khối tươi của tế bào lúc bắt đầu nuôi cấy và FWf là
sinh khối tươi của tế bào lúc kết thúc nuôi cấy.
2. . . ươ g s
2.3.2.1. Chi t Soxhlet
Sinh khối khô của tế bào cà gai leo được nghiền thành bột mịn. Cân 1 g mẫu
và chiết cách thủy bằng sinh hàn ngược với 50 mL dung dịch acetic acid 5% trong
methanol trong 3 gi . Lọc và cô dịch chiết bằng máy cô quay chân không
(Heidolph, Germany) ở 50o
C. Hòa tan kết tủa bằng methanol và định m c đến 10
mL [15].
2.3.2.2. Sắc ký lỏng hi ă
Dịch chiết solasodine của tế bào cà gai leo được lọc bằng màng Minisart 0,2
µm (Sartorius, Đ c), pha loãng 5 lần trong cùng dung môi và bảo quản ở nhiệt độ
4o
C. Sử dụng cột Hypersil MOS (C8) (5 μm, 4.6×150 mm) của Thermo Scientific,
th i gian chạy cho một mẫu là 5 phút, tốc độ dòng 1 mL/ph t và detector có bước
sóng 254 nm. Pha tĩnh là silica gel (pha ngược) và pha động là methanol 100%.
Ph n t ch HPLC được tiến hành trên hệ thống Shimadzu LC 20A với bơm
LC-20AD, đầu dò SPD-20A, bộ bơm mẫu tự động SIL-20A HT và sử dụng phần
mềm LC Solution (ver. 1.22). Tất cả hóa chất sử dụng trong quá trình phân tích này
đều của hãng Sigma-Aldrich và Merck.
2. ạ c ch collagenase của solasodine
Nguyên tắc của phương pháp này là solasodine sẽ làm giảm hoạt tính
collagenase được biểu thị bằng độ dài (mm) cột collagen gel bị tiêu sau một th i
gian nhất định [14].

39
Chuẩn bị cột gel: Cân 50 mg collagen type I từ g n đuôi chuột (Sigma, Mỹ)
hòa trong 50 mL dung dịch acetic acid 0,05 M, bổ sung NaCl để đạt đến nồng độ
0,04 M, điều chỉnh pH 7,5-8 bằng Tris.HCl 2 M để thu được dung dịch collagen
trong suốt. Dùng các ống mao quản đư ng kính 2 mm, dài 150 mm hút dịch
collagen tới chiều cao 2/3 ống (100 mm). Nút kín một đầu ống bằng paraffin và bịt
đầu còn lại bằng giấy paraffin. Đ t các ống này thẳng đ ng trong tủ ấm 37o
C để qua
đêm, collagen sẽ đông đ c lại thành gel trong suốt.
Xác định hoạt tính của dịch chiết solasodine: Lấy cột gel ra khỏi tủ ấm và
đánh dấu chiều cao cột gel để xác định điểm mốc của quá trình tiêu gel. Pha dung
dịch collagenase type I (C3867-1VL, Sigma-Aldrich, Mỹ) 0,2 mg/mL bằng đệm
Tris.HCl 0,05 M (pH 7,9). Cho 150 µL hỗn hợp dung dịch collagenase 0,2 mg/mL
và dịch chiết solasodine (tỷ lệ 1:1) vào cột collagen gel. Đối ch ng là dung dịch
collagenase 0,1 mg/mL. Để các cột gel vào tủ ấm 37o
C trong 24 gi , sau đó lấy các
cột ra đo chiều dài gel bị tiêu (gel hóa lỏng) do tác dụng của collagenase để xác
định hoạt tính của dịch chiết solasodine. Dịch chiết solasodine sử dụng để xác định
hoạt tính là dịch chiết từ tế bào cà gai leo nuôi cấy có xử lý 150 µM SA.
2. . . l số l ệ
Mỗi thí nghiệm được l p lại 3 lần. Các số liệu thực nghiệm được tính trung
bình mẫu và sai số chuẩn bằng Microsoft Excel, phân tích one-way ANOVA
(Duncan’s test, p<0,05) bằng chương tr nh SPSS (ver. 18.1).

40
sơ ồ g ệ
Thăm dò nồng độ elicitor
Thăm dò th i điểm bổ sung elicitor
Thu sinh khối tế bào
Định lượng
Tách chiết solasodine
Thử nghiệm hoạt t nh sinh học
Nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy callus
Nhân callus
Cây cà gai leo in vitro
Xử lý các elicitor khác nhau

41
C ươ g
K T QU NGHIÊN C U
3.1. C CỦA T BÀO CÀ GAI
LEO
3.1.1. ưởng c a t bào
Tiến hành nuôi cấy tế bào và thu sinh khối sau mỗi tuần, từ tuần th 1 đến
tuần th 7, để khảo sát quá trình sinh trưởng của chúng. Kết quả được trình bày ở
hình 3.1.
Hình 3.1. Đư ng cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo
không xử lý elicitor sau 7 tuần nuôi cấy
Pha lag của tế bào chỉ xuất hiện trong một th i gian ngắn (1-2 ngày đầu),
nhưng do sinh khối tế bào được thu 1 tuần/lần nên khó quan sát giai đoạn này. Cũng
có thể do chúng tôi sử dụng các tế bào đang trong giai đoạn sinh trưởng từ nuôi cấy
dịch huyền phù tế bào. Pha log kéo dài từ pha lag đến hết tuần th 4, trong th i gian
này tế bào sinh trưởng tương đối mạnh, đạt 4,98 g khối lượng tươi (0,45 g khối

42
lượng khô). Dịch tế bào có màu vàng nhạt và tế bào khá đồng nhất. Sau pha log,
sinh trưởng của tế bào bắt đầu giảm và sinh khối chỉ còn 3,35 g tươi (0,24 g khô) ở
tuần th 7, l c này dịch huyền phù tế bào chuyển từ màu vàng nhạt sang nâu và
xuất hiện tế bào chết do môi trư ng cạn kiệt dinh dưỡng.
Hình 3.2. (a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo
trong môi trư ng không xử lý elicitor sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trư ng
MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D; tốc độ lắc 150 vòng/ph t
3.1. . lũy sol sod e a t bào
Khả năng t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo được khảo sát từ 1-7 tuần
nuôi cấy. Kết quả nghiên c u cho thấy lượng solasodine t ch lũy trong tế bào tăng
dần từ tuần th nhất đến tuần th 4 và đạt cực đại là 123,5 mg/g khối lượng khô.
Sau đó, từ tuần th 5-7, hàm lượng solasodine bắt đầu giảm dần chỉ còn 51,5 mg/g
(Hình 3.3).
Thông thư ng, các HCTC t ch lũy nhiều nhất vào cuối pha sinh trưởng. Một
số nghiên c u cho thấy mối tương quan nghịch giữa tốc độ sinh trưởng và khả năng
sản xuất các HCTC. Khi tốc độ sinh trưởng tăng, hoạt động phân chia và sản xuất
sinh khối của tế bào diễn ra mạnh. Nhưng khi chuẩn bị bước vào pha ổn định, sinh
trưởng bắt đầu giảm, lúc này hoạt động sản xuất các HCTC mới tăng lên [83].
Trong nghiên c u của chúng tôi, pha ổn định của tế bào cà gai leo rất ngắn, sau khi
tế bào kết th c sinh trưởng thì sinh khối giảm ngay (bước vào tuần th 5). Vì vậy,
a b 1 cm

43
lượng solasodine được tổng hợp cao nhất ở cuối giai đoạn sinh trưởng của tế bào
(tuần th 4) là hợp lý.
Hình 3.3. Đư ng cong t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo
không xử lý elicitor sau 7 tuần nuôi cấy
Kết quả của chúng tôi cho thấy hàm lượng solasodine của tế bào tăng dần
theo th i gian nuôi cấy, đạt cao nhất ở tuần th 4, cao hơn trong rễ tự nhiên khoảng
5,3 lần. Kết quả này phù hợp với các kết quả đã được công bố trước đ y [59].
3.2. NG CỦA ELICITOR C
SOLASODINE CỦA T BÀO CÀ GAI LEO
3.2.1. ưởng c a methyl jasmonate
3.2.1.1. N độ methyl jasmonate
Bổ sung MeJA nồng độ từ 25 µM đến 250 µM vào môi trư ng dinh dưỡng
lúc bắt đầu nuôi cấy, kết quả về khả năng sinh trưởng và t ch lũy solasodine sau 4
tuần được trình bày trong bảng 3.1 và 3.2.
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy tế bào cà gai leo được xử lý MeJA sinh trưởng
chậm hơn đối ch ng. Sinh khối tươi giảm nhiều (3,98-2,29 g, đối ch ng 4,98 g) khi

44
tăng nồng độ MeJA. Tuy nhiên, khối lượng khô thay đổi không đáng kể giữa các
công th c xử lý elicitor (0,34-0,37 g, đối ch ng 0,45 g).
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của MeJA lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo
ồ g ộ eJ
(µM)
ố lư g o (g)
GI
ươ Khô
25 3,89b
0,37b
1,30
50 3,38d
0,35bc
1,13
100 3,57c
0,34c
1,19
150 2,96e
0,36bc
0,99
200 2,40f
0,34bc
0,80
250 2,29g
0,35bc
0,76
ĐC 4,98a
0,45a
1,66
Đ : ế bào không x lý elicitor. Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có
nghĩ hống kê của các trung bình mẫu ở p < 0,05 (Duncan's test). Chú thích này dùng
chung cho tất cả các bảng.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của MeJA lên khả năng t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo
ồ g ộ eJ (µ ) Solasodine (mg/g)
25 127,5c
50 159,0a
100 138,0b
150 98,0e
200 38,0f
250 36,5f
ĐC1 123,5d
ĐC2 23,5g
Đ 1: ế bào không x lý elicitor. Đ 2: ễ của cây tự nhiên 1 năm ổi
Dịch chiết tế bào 4 tuần tuổi được ph n t ch HPLC để khảo sát ảnh hưởng
của nồng độ MeJA (25-250 µM) lên t ch lũy solasodine. Phân tích HPLC dịch chiết
của tế bào cà gai leo nuôi trong môi trư ng có bổ sung MeJA ở các nồng độ khác

45
nhau cho thấy các phổ sắc ký đều có kiểu peak giống nhau, trong đó 1 peak có th i
gian lưu khoảng 2,1-2,2 phút, gần trùng với peak của solasodine chuẩn (2,2 phút) và
của dịch chiết rễ cây cà gai leo tự nhiên 1 năm tuổi (2,2 phút) (Phụ lục 1). Kết quả
trình bày ở bảng 3.2 cho thấy ở nồng độ MeJA từ 25-50 µM, solasodine t ch lũy
mạnh trong tế bào và đạt cực đại 159 mg/g, gấp 1,3 lần tế bào đối ch ng không bổ
sung MeJA (123,5 mg/g) và gấp 6,8 lần rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi (23,5 mg/g).
Lượng solasodine giảm dần khi tăng MeJA từ 100-250 µM.
Hình 3.4. (a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo trong môi
trư ng MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D bổ sung 50 µM MeJA
(lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc độ lắc 150 vòng/ph t sau 4 tuần nuôi cấy
3.2.1.2. Thời gian nuôi cấy
Nồng độ MeJA 50 µM được chọn để khảo sát quá tr nh sinh trưởng và th i
điểm t ch lũy solasodine cao nhất của tế bào cà gai leo trong suốt 7 tuần nuôi cấy.
Kết quả tr nh bày ở hình 3.5 cho thấy sinh khối tươi tăng dần từ tuần th 1 và đạt
cực đại sau 4 tuần nuôi (3,38 g), sinh khối khô đạt cực đại ở tuần th 4 và 5 (0,35 và
0,38 g, sai khác không có ý nghĩa thống kê với p>0,05), thấp hơn đối ch ng tương
ng khoảng 0,7 và 0,8 lần. Sau tuần th 4 ho c 5, sinh khối tươi và khô bắt đầu
giảm và đến tuần th 7 còn lại 3,26 g khối lượng tươi và 0,27 g khối lượng khô.
ba 1 cm

46
Hình 3.5. Đư ng cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50 µM MeJA
sau 7 tuần nuôi cấy
Hình 3.6. Đư ng cong t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo
khi bổ sung 50 µM MeJA sau 7 tuần nuôi cấy

47
Hình 3.6 biểu diễn đư ng cong t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo được
xử lý elicitor bởi 50 µM MeJA sau 7 tuần nuôi cấy. Lượng solasodine cũng tăng
dần từ tuần th 1 đến tuần th 4 tương tự sinh khối tế bào. Trong giai đoạn đầu của
sự sinh trưởng (tuần 1-3), solasodine được tổng hợp không nhiều. Tuy nhiên, từ
tuần th 4 hàm lượng solasodine tăng nhanh và đạt cực đại đến 159 mg/g khối
lượng khô, cao hơn trong rễ của c y 1 năm tuổi khoảng 6,8 lần và đối ch ng là tế
bào không xử lý MeJA khoảng 1,3 lần. Từ tuần th 5-7, hàm lượng solasodine giảm
nhiều chỉ còn 69,5 mg/g khối lượng khô.
3.2.1.3. Thờ đ m cảm ng
Dựa vào kết quả nghiên c u ảnh hưởng của nồng độ MeJA lên khả năng t ch
lũy solasodine trong tế bào cà gai leo, nồng độ MeJA 50 µM được chọn để khảo sát
th i điểm cảm ng trong nuôi cấy tế bào. Sinh khối tế bào được thu sau 4 tuần và
kết quả được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của th i điểm xử lý MeJA 50 µM lên sinh trưởng của tế bào cà gai
leo
Ngày ả ứ g
ố lư g o (g)
GI
ươ Khô
7 3,39b
0,31b
0,88
14 3,43b
0,33ab
0,84
21 3,71a
0,34a
0,99
C 3,38b
0,35a
1,13
Đ : bổ sung MeJA 50 µM o môi ường lúc bắ đầu nuôi cấy.
Số liệu ở bảng 3.3 cho thấy th i điểm bổ sung MeJA đã ảnh hưởng đến khả
năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo. Tại các th i điểm khảo sát là 7, 14 và 21
ngày, sinh trưởng của tế bào đều giảm so với đối ch ng (th i điểm ban đầu của quá
trình nuôi cấy). Như vậy, tế bào cà gai leo sinh trưởng tốt nhất khi bổ sung 50 µM
MeJA ở th i điểm ban đầu nuôi cấy.

48
Th i điểm xử lý elicitor là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng
t ch lũy các sản phẩm th cấp của tế bào thực vật, ảnh hưởng của xử lý MeJA lên
hàm lượng solasodine sau 4 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của th i điểm bổ sung MeJA 50 µM lên khả năng t ch lũy
solasodine của tế bào cà gai leo
ờ ( g y) lư g ( g g)
7 108,5b
14 79,5c
21 74,5d
ĐC 159,0a
Đ : bổ sung MeJA 50 µM o môi ường lúc bắ đầu nuôi cấy.
Các th i điểm bổ sung elicitor từ 7-21 ngày của quá trình nuôi cấy đều cho
thấy hàm lượng solasodine giảm so với đối ch ng bổ sung th i điểm ban đầu. Tế
bào t ch lũy solasodine thấp nhất khi bổ sung MeJA vào ngày nuôi cấy 21 (74,5
mg/g khối lượng khô) và cao nhất vào ngày bắt đầu nuôi cấy (159,0 mg/g khối
lượng khô).
3.2.3. ưởng c a dịch chi t n m men
3.2.3.1. N độ d ch chi t nấm men
Nồng độ YE được sử dụng để bổ sung vào môi trư ng lúc bắt đầu nuôi cấy
là từ 1-5 g/L. Sinh khối tế bào được thu sau 4 tuần để đánh giá ảnh hưởng của YE.
Kết quả trình bày ở bảng 3.5.
Nhìn chung, YE có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng của tế bào cà gai leo
nhưng theo hướng ngược với MeJA. YE có tác dụng k ch th ch sinh trưởng của tế
bào, sinh khối tươi tăng mạnh so với đối ch ng không xử lý elicitor (7,94-9,30 g và
4,98 g), tuy nhiên sinh khối khô chỉ tăng nhẹ (0,41-0,54 g và 0,45 g).

49
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của YE lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo
ồ g ộ (g )
ố lư g o (g)
GI
ươ Khô
1 9,30a
0,54a
3,10
2 9,20b
0,53a
3,07
3 8,80c
0,48b
2,93
4 8,08d
0,43c
2,69
5 7,94
e
0,41c
2,65
ĐC 4,98f
0,45bc
1,66
Đ : ế bào không x lý elicitor.
Trong các nồng độ được khảo sát, 3 g/L YE có tác dụng kích thích sinh tổng
hợp solasodine mạnh nhất (220,5 mg/g khối lượng khô), gấp khoảng 1,8 lần đối
ch ng không xử lý elicitor và 9,4 lần so với rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi. Các nồng độ
khác như 2 và 4 g/L YE cũng có hiệu quả tương tự như yếu hơn. Riêng nồng độ 5
g/L YE có tác dụng ngược lại, hàm lượng solasodine thu được từ công th c xử lý
này thấp hơn đối ch ng không elicitor (Bảng 3.6).
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của YE lên khả năng t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo
ồ g ộ (g ) lư g ( g g)
1 125,5d
2 165,0c
3 220,5a
4 198,0b
5 112,0e
ĐC1 123,5d
ĐC2 23,5f
Đ 1: ế bào không x lý elicitor. Đ 2: ễ của cây tự nhiên 1 năm ổi

50
Hình 3.7. (a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo trong
môi trư ng MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D bổ sung 3 g/L YE
(lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc độ lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy
3.2.3.2. Thời gian nuôi cấy
Từ kết quả thăm dò nồng độ, 3 g/L YE được chọn để bổ sung vào môi trư ng
lúc bắt đầu nuôi cấy và khảo sát th i điểm t ch lũy solasodine cao nhất của tế bào cà
gai leo trong suốt 7 tuần. Kết quả nghiên c u được trình bày ở hình 3.8.
Hình 3.8. Đư ng cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 3 g/L YE
ba
1 cm

51
Sinh khối tế bào tăng dần từ tuần th 1 và lớn nhất vào tuần th 4 (8,8 g khối
lượng tươi, tương ng 0,48 g khối lượng khô), sau đó giảm khá nhanh và thấp nhất
ở tuần th 7 (chỉ còn 5,78 g khối lượng tươi và 0,32 g khối lượng khô).
Hàm lượng solasodine cũng tăng dần từ tuần th 1 đến tuần th 4 và đạt cực
đại là 220,5 mg/g khối lượng khô, gấp khoảng 1,8 lần so với tế bào đối ch ng,
khoảng 9,5 lần so với rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi và khoảng 1,4 lần so với tế bào
được xử lý MeJA 50 µM. Hàm lượng solasodine sau đó giảm dần đến tuần th 7
(còn 51,5 mg/g).
Hình 3.9. Đư ng cong t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung 3g/L YE
3.2.3.3. Thờ đ m cảm ng
Dựa vào kết quả khảo sát nồng độ và đư ng cong t ch lũy solasodine, chúng
tôi chọn nồng độ xử lý 3 g/L YE và thu sinh khối của tế bào 4 tuần tuổi để nghiên
c u ảnh hưởng của th i điểm cảm ng (7-21 ngày sau khi nuôi cấy) lên khả năng
sinh trưởng và t ch lũy solasodine của chúng. Các tế bào được bổ sung YE vào lúc
bắt đầu nuôi cấy được sử dụng để làm đối ch ng.

Ảnh hưởng của elicitor lên khả năng tích lũy ở tế bào solasodine

Ảnh hưởng của elicitor lên khả năng tích lũy ở tế bào solasodine

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Ảnh hưởng của elicitor lên khả năng tích lũy ở tế bào solasodine

Similar to Ảnh hưởng của elicitor lên khả năng tích lũy ở tế bào solasodine (20)

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Ảnh hưởng của elicitor lên khả năng tích lũy ở tế bào solasodine