bài vi sinh ung dụng

1. ĐỀ TÀI:
Sản xuất chế phẩm Trichoderma,
Bacillus dùng kiểm soát sinh học
Fusarium sp. và Pythium sp. và kích
thích sinh trưởng ở cây đậu.
NHÓM 7
BÀI BÁO CÁO VI SINH ỨNG DỤNG

3. Tổng Quan
Bacillus.
Là vi khuẩn hình que, Gram dương, có khả
năng chuyển động.
Phần lớn có lợi cho con người.
Hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi
Hình thành nội bào tử.
Nhiệt độ tối ưu: 30 - 45 độ.
pH: 2- 11
Có khả năng gây bệnh cho côn trùng.

4. Trichoderma:
Thuộc nghành nấm Mycota.
Hiện diện nhiều trong đất.
pH: 4- 8, hiếu khí.
Sinh sản vô tính bằng bào tử, một số sinh sản hữu
tính.
Tiêu diệt, khống chế, ngăn ngừa các loại nấm bệnh:
Fusarium, Pythium...
Tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm.
kích thích tăng trưởng và phục hồi bộ rễ cây trồng.
Phân giải tốt các chất xơ , chitin, lignin... giúp cho
cây hấp thụ dễ dàng.

5. Nấm Fusarium sp.
Là một trong những loại nấm gây hại nhiều
nhất cho cây trồng.
Sinh độc tố có tính độc cao.
phổ biến trong đất, lưu tồn dạng bào tử hoặc
khuẩn ty.
Gây bệnh ngẽn mạch, thối rễ thối thân, thối
hạt, trái.
Tấn công vào bộ rễ. gây hại cho đậu, cà chua,
cam quýt, khoai tây.

6. Pythium sp.
Là một vsv giống với nấm.
Phổ ký chủ rộng.
Sinh sản vô tính bằng bào tử động.
Gây tàn lụi và chết rạp ở cây con( do ẩm
ướt).
Gây thối củ ( khoai tây, cà rốt..).
Gây thối củ và quả : là một bệnh chủ yếu ở
Lạc.

7. Nguyên tắc phân lập:
- Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường
dinh dưỡng đặc trưng (2% thạch hay còn gọi là agar).
- Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các
khuẩn lạc tách biệt nhau.
- Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi
trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng
vi khuẩn thuần khiết (do Robert Koch đề ra).
PHÂN LẬP

8. PHÂN LẬP BACILLUS

9. 1. Mẫu:
Nốt sần đậu phộng có kích thước lớn, có màu đỏ hống.
Rửa sạch, ngâm cồn 5 phút, rửa nước, nghiền nát bằng kim
mũi mác, bổ sung thêm 3ml nước cất ta thu được dung dịch
chứa vi khuẩn trên.
Đất: lấy đất gần tầng mặt, không lấy ở phần đất sâu.
2. Pha loãng mẫu:
Cân 10g đất nghiền trong cối sứ (đã sấy tiệt trùng) hòa với
90ml nước muối sinh lý chứa sẵn trong bình tam giác 200ml
vô trùng.
Lắc đều trên máy lắc tốc độ 150v/p trong 30 phút.
Đun sôi cách thủy 15 phút thu được huyền dịch 10-1, Lắc đều
huyền dịch rồi dùng micropipet hút vô trùng 1ml huyền dịch
vào ống nghiệm chứa sẵn 90ml nước muối sinh lý đã tiệt
trùng để được độ pha loãng 10-2, tương tự thu được các nồng
độ 10-3, 10-4,…

10. 3.Cấy phân lập:
Cấy trang các dung dịch thu được trên thạch đĩa NA
nuôi trong tủ ấm ở 370C trong 24h.
Chọn khuẩn lạc nghi ngờ tiến hành nhuộm Gram và
thử các phản ứng sinh hóa.
4. Xác định vi khuẩn Bacillus
Đem khuẩn lạc nghi ngờ đi nhuộm Gram và xem dưới
kính hiển vi.
Nếu thấy có đặc điểm của Bacillus thì cấy truyền
khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường thạch nghiêng NA
để giữ giống thử test sinh hóa tiếp theo.
Giám định đặc tính sinh hóa: catalaza (+), nitrate (+),
VP (+), citrate (+), methyred (+), maltose (-).

11. PHÂN LẬP TRICHODERMA

12. 1. Mẫu:
Đất: lấy từ các ruộng trồng đậu.
Làm mịn đất qua rây 1mm.
2. Pha loãng mẫu:
Cân 1g đất mịn hòa vào 100ml nước sinh lý
có 0,5% tween 80.
Đặt lên máy lắc trong 30 phút với tốc độ
110v/p.
Hòa loãng ở các nồng độ khác nhau.

13. 3. Phân lập mẫu:
Đem các dung dịch được pha loãng ở các nồng độ khác
nhau cấy trên mội trường thạch.
Phân lập các khuẩn lạc điển hình của Trichoderma, làm
thuần các dòng Trichoderma.
4. Thử ảnh hưởng độc tố trên cây trồng:
Tẩm hạt và phun lên cây, khi thấy không có ảnh hưởng
xấu với cây mới, thực hiện các thí nghiệm tiếp theo như
định danh, xác định khả năng ức chế phát triển các vi
sinh vật gây bệnh cây.

14. ĐỊNH TÍNH
 Các bước thực hiện:
Chuẩn bị dịch khuẩn: Vi khuẩn được hòa vào
nước muối sinh lý nồng độ 0,85% để có mật độ
khoảng: 1-2.108 CFU/ml).
Chuẩn bị dịch nấm (Fusarium sp, Pythium
sp, Trichoderma): Nấm mốc được pha trong nước
muối sinh lý 0,85% để có mật độ 1 - 2.106 tb/ml
(đếm bằng buồng đếm hồng cầu).

15. Môi trường thử định tính: NA 37oC/24h.
Nấm gây bệnh được hoạt hóa trên môi
trường PDA (Potato dextrose agra)
37oC/3 ngày (ống thạch nghiêng).

16. 1. Thử khả năng đối kháng nấm gây bệnh của
các chủng Bacillus.
Nhằmchọn ra chủng có hoạt tính mạnh nhất.
 Tiến hành thử nghiệm đối kháng:
Hút 10µl dịch nấm (Fusarium sp và Pythium sp)
và dịch khuẩn (Bacillus) cấy đối xứng nhau qua
đường kính đĩa môi trường PGA.
Khoảng cách giữa chúng là 3cm.
Tiến hành lập lại thí nghiệm nhiều lần để cho kết
quả chính xác.

17. Sau khi cấy: Ủ ở 37oC trong 3 ngày.
Đánh giá kết quả: xem chủng Bacillus
nào kháng nấm mạnh nhất, chọn chủng
Bacillus đó.

18. 2. Thử khả năng kháng nấm của
Trichoderma.
Môi trường thử đối kháng: SA( Sabouraud
agar).
Nấm gây bệnh cũng được nuôi trên môi
trường thích hợp để chúng phát triển tốt.

19. Tiến hành thử nghiệm đối kháng:
Hút 10µl dịch nấm Trichoderma và 10µl dịch
nấm gây bệnh (Fusarium sp. và Pythium sp.) cấy
đối xứng nhau qua đường kính đĩa, cách mép đĩa
petri 1-1.5cm.
Tiến hành lập lại thí nghiệm nhiều lần.
Thí nghiệm được quan sát 2 ngày 1 lần, sau 3
ngày tiến hành chọn lọc các chủng kháng bệnh
mạnh nhất.

20. Trichoderma kháng Fusaryum

21. a. Đánh giá khả năng kháng nấm:
•Phần nấm Trichoderma phát triển bao phủ
qua phần nấm gây hại.
•Phần nấm gây hại bị bào mòn dần ở mép
khuẩn lạc.
•Phần nấm Trichoderma phát triển và khống
chế làm cho nấm gây hại không phát triển
được.

22. b. Đánh giá mức đối kháng của nấm:
•Kháng mạnh: Nấm Trichoderma tấn công và phá hủy
hoàn toàn nấm gây hại, kí hiệu: +++
•Kháng trung bình: Nấm Trichoderma tấn công và phá
hủy một phần nấm gây hại, kí hiệu: ++
•Kháng yếu: Nấm Trichoderma ngăn chặn sự phát
triển của nấm gây hại, kí hiệu: +
•Không kháng: nấm gây hại gần như phát triển bình
thường, xâm nhập vào vùng phát triển của nấm, kí
hiệu: Chọn chủng Trichoderma kháng nấm mạnh nhất.

23. 3. Thử khả năng kết hợp của nấm Trichoderma với chủng
Bacillus đã được chọn qua định tính.
•Từ chủng nấm Trichoderma và chủng Bacillus đã được
chọn ra sau khi định tính ta tiến hành thử khả năng kết hợp
giữa chúng.
•Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: PGA.
•Trichoderma và Bacillus được cấy đối xứng nhau qua
đường kính đĩa petri, khoảng cách giữa chúng là 3cm .
•Quan sát khả năng kết hợp giữa chúng:
Trichoderma và Bacillus cùng mọc được trên cùng môi
trường: không ức chế lẫn nhau.
Trichoderma mọc lấn ác Bacillus hoặc ngược lại.
Ức chế lẫn nhau.
•Chọn ra chủng nấm Trichoderma và chủng Bacillus có
khả năng kết hợp nhau tốt nhất.

24. ĐỊNH LƯỢNG
Khảo sát phần trăm ức chế:
Công thức tính phần trăm ức chế:
Đường kính đĩa đối chứng - Đường kính đĩa cấy x 100%
Đường kính đĩa đối chứng

25. Nếu % ức chế càng lớn thì khả năng
ức chế của Trichoderma và Bacillus
càng mạnh. Người ta sẽ chọn những
nấm có % ức chế lớn nhất đem thử
nghiệm Invivo.

26. III. THỬ NGHIỆM INVIVO
 Bước 1: Chuẩn bị.
 Vi khuẩn và nấm:
 Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường
Mật rỉ.
 Đo OD
 Lựa chọn mật độ 1 - 2.108 CFU/ml.
 Nấm tăng sinh trong môi trường cám, mạt
cưa, sau đó đem pha với nước muối sinh lý 0,85%
để đạt mật độ 1 - 2.106 tb/ml.
 Đất đã khử trùng.

27. Bước 2: Thử nghiệm.
Phương pháp thực hiện thử nghiệm
Invivo.
Số nghiệm thức: Thực hiện 15 nghiệm
thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần (tổng
cộng có 45 nghiệm thức).

28. Pythium sp Fusarium sp Pythium sp +
Fusarium sp
Không cấy Không cấy Không cấy
Cấy Trichoderma Cấy trichoderma Cấy Trichoderma
Cấy cùng lúc
Ttrichoderma và
Bacillus
Cấy cùng lúc
Ttrichoderma và
Bacillus
Cấy cùng lúc
Ttrichoderma và
Bacillus
Cấy Trichoderma
trước, Bacillus
sau.
Cấy Trichoderma
trước, Bacillus sau.
Cấy Trichoderma
trước, Bacillus sau.
Cấy Bacillus Cấy Bacillus Cấy Bacillus
Bảng: Các lô thí nghiệm

29. Phương pháp trồng thử nghiệm:
• Mỗi chậu cho vào 1kg đất (đã vô trùng), trộn
đều với dịch khoáng.
• Bổ sung nấm, vi khuẩn vào chậu (2ml) như
các lô thí nghiệm.
• Trồng ở mỗi chậu 10 hạt đậu, quan sát tỉ lệ
nảy mầm (đếm hạt nảy mầm) và mức độ cố định
đạm (số nốt sần).
• Đánh giá kết quả thử nghiệm: đánh giá mức
độ kháng Fusaium sp. và Pythium sp. dựa vào
số hạt tỉ lệ hạt nảy mầm và số nốt sần trên rễ
cây.

31. LÊN MEN
CÁC BƯỚC LÊN MEN
Bước 1: Thiết lập môi trường dùng trong tăng sinh
giống sản xuất.
Sử dụng phương pháp lên
men bề mặt( lên men nổi)

32. MÔI TRƯỜNG LÊN MEN TỐI ƯU HÓA CHO
TRICHODESMA
Tạo môi trường hiếu khí.
Tạo môi trường có pH 2-6( pH thích hợp cho nấm
Trichoderma tiết ra Enzyme).
Môi trường có độ ẩm cao.
pH thích hợp để hình thành bào tử là 5-5,8 tùy từng
mức pH mà cho các loại bào tử khác nhau
Nhiệt độ tối ưu là 25-300C
Nhiệt độ thích hợp tiết Chitinase là 400C, Glucanase
ở 350C.
Nguồn cacbon chủ yếu là D-glucose, D-galatose, D-
mantose, D-fructose.

33. MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU HÓA BACILLUS
Sử dụng phương pháp lêm
men chìm( Lên men bề sâu)
Nhiệt độ tối ưu : 550C
PH tối ưu: 7-8.
Môi trường hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi.

34. Bước 2: Thanh trùng môi trường, nồi lên
men và các thiết bị kèm theo.
Bước 3: Nhân sinh khối đủ lớn, mạnh và
thuần để cung cấp cho các bồn lên men
trong quá trình sản xuất.
Bước 4: Cung cấp các điều kiện tối ưu cho
sự phát triển của giống để giống sản sinh
sản phẩm.

35. QUÁ TRÌNH XỬ LÍ SAU LÊN MEN
• Bao gồm: Tách chiết và tinh chế sản phẩm
thành dạng thích hợp cho mục đích nhất định.
• Các loại sản phẩm: Toàn bộ tế
bào, Vaccine, Protein trị liệu, Kháng thể đơn
dòng..Các sản phẩm khác nhau đáng kể về
kích thước phân tử, thành phần hóa học, yêu
cầu về độ tinh sạch...
• Cần các phương pháp khác nhau để thu hồi
và tinh sạch.

36. • Bước 7: Sấy cả 2 sản phẩm ở: 180oC/30
phút, sau đó phối trộn 2 sản phẩm
Trichoderma Và Bacillus lại với nhau.
• Bước 8: Xử lý những chất thải tạo ra
trong qui trình.

37. Điều kiện bảo quản chế phẩm
Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm( thường
là 6 tháng đối với 2 chủng trên).
Với điều kiện nhiệt độ 25 - 30oC (bao bì tốt, nơi
thoáng mát).
Bào tử( của Bacillus) bền nhiệt (8000C) và sản
phẩm được bào chế dưới dạng bào tử tinh khiết
100% (>99,99%)
 Sản phẩm chứa bào tử có thể bảo quản vô thời
hạn ở nhiệt độ phòng trong điều kiện đóng gói
kín hoàn toàn.

38. • Điều này không thể có được ở sản phẩm
probiotic của sinh vật không có khả năng
tạo bào tử, ví dụ như các Lactobacillus
đang sử dụng khá phổ biến hiện nay.
• Tìm hiểu trên thị trường xem đã có sản
phẩm nào tương tự không nếu chưa có sản
phẩm nào tương tự thì ta đăng ký bản
quyền cho sản phẩm.

39. • Nếu Sản phẩm sản xuất ra được chứng
nhận bản quyền thì chúng ta sẽ đưa vào
sản xuất công nghiệp với quy mô lớn
để bán trên thị trường.