Struktur dan Fungsi Protein

1. 1
1
3. Struktur dan fungsi protein
3.1 Hirarki struktur protein
3.2 Pelipatan protein
3.3 Fungsi protein
3.4 Regulasi fungsi protein: degradasi protein
3.5 Regulasi fungsi protein: modifikasi kovalen dan
nonkovalen
3.6 pemurnian, deteksi dan karakterisasi protein
3.7 Proteomik

2. 2
2
3.1
Hirarki
struktur
protein

3. 3
3
Struktur primer
Ujung C
Ujung karboksil
C terminus
Ujung N
Ujung amino
N terminus

4. 4
4

5. 5
5
Struktur sekunder protein
Alpha helix Beta sheet

6. 6
6
Beta turns*
 Located on the
surface of a protein
 Turn towards
interior of protein
 Proline & Glycine
commonly present

7. 7
7
 Protein globular
 Protein integral
membran
 Oil drop model of
globular protein
Struktur tersier
dan kuaterner
protein

8. 8
8
Motif struktural/lipatan

9. 9
Domain pada protein
9
EGF = Epidermal growth
factor
TPA = tissue
plasminogen activator
Hijau = domain EGF
Biru = domain trans
membran

10. 10
Mesin
makromolekular:
kompleks inisiasi
transkripsi

11. 11
Evolusi globin

12. 12
3.2 Pelipatan protein
 Ikatan peptida yang berbentuk bidang datar
membatasi bentuk yang dapat dicapai waktu
pelipatan protein
 Urutan asam amino protein menentukan
pelipatannya
 Chaperone membantu pelipatan protein
 Protein dapat mengalami modifikasi pasca
translasi
 Sel meregulasi degradasi protein

13. 13
Rotasi antara gugus peptida

14. 14
Proses pelipatan protein
 Folding
follows the
structural
hierarchy of
primary 
secondary 
tertiary
structure

15. 15
Chaperone
15
Chaperone
molekuler
Chaperonin

16. 16
Penyakit akibat kesalahan
pelipatan protein
 Penyakit sapi gila (prion)
 Alzheimer: protein amiloid β berubah
dari struktur heliks  menjadi β-
sheet

17. 17
3.3 Fungsi protein
 Pengikatan ligan
 Enzim

18. 18
Interaksi protein ligan
 Spesifisitas ikatan
 Afinitas ikatan
 Kd
 Keq
 Molecular
complementarity
 Contoh: ikatan
antigen-antibodi
18

19. 19
Enzim
 Laju reaksi
meningkat 106 –
1012 kali
 Energi aktivasi
suatu reaksi
turun
 Spesifisitas
tinggi
 Sisi aktif enzim
mengikat
substrat
19

20. 20
Karakterisasi
enzim
20
 E + S  ES → P
 Persamaan Michelis
Menten:
Vo = Vmax([S]/([S]+Km)

21. 21
Energi bebas dari reaksi G3P →DHAP

22. 22
Serin protease
 Menghidrolisis ikatan peptida
 Residu serin mempunyai peranan penting
 Sisi aktif
 Lekukan: terdapat Ser, Asp & His
 His sering terdapat pada sisi aktif enzim karena
mudah menerima atau melepaskan proton pada
pH fisiologis
 Sisi pengikatan substrat
 Berbentuk kantong
 Menentukan spesifisitas enzim

23. 23
Serin protease
α α

24. 24
Kantong sisi aktif dua serin
protease

25. 25
Mekanisme katalisis dari chymotrypsin (1)
 Pengikatan substrat polipeptida.
 Transfer proton dari ser ke his. Substrat dalam keadaan transisi
berbentuk tetrahedral.

26. 26
Mekanisme katalisis dari chymotrypsin (2)
 Transfer proton dari residu di ujung C, yang dilepaskan dengan pemutusan
ikatan C-N. Peptida ujung N terikat pada ser melalui ikatan asil.
 Molekul air terikat enzim, menggantikan polipeptida yang lepas.

27. 27
Mekanisme katalisis dari chymotrypsin (3)
 Molekul air mentransfer protonnya ke His57. Keadaan
transisi tetrahedral terbentuk.

28. 28
Mekanisme katalisis dari chymotrypsin (4)
 Fragmen peptida kedua dilepaskan: Ikatan asil dilepas, proton
ditransfer dari his ke ser. Enzim kembali ke keadaan semula
O-H

29. 29
Stabilitas keadaan transisi
 Keadaan intermediat
tetrahedral
 Stabil
 Akibat ikatan H dari proton
gugus amino Ser 195 & Gly
193 dengan O dari
tetrahedron
 Mirip dengan keadaan
transisi yang diperlukan

30. 30
Motor molekuler
30
Linear motion:
Miosin, kinesin, dinein
Rotary motion:
•Pergerakan bakteri,
•Pengemasan DNA ke dalam
kapsid virus
•Sintesis ATP
Convert energy from ATP or ion gradient into
mechanical force

31. 31
Regulasi aktivitas protein
1. Regulasi konsentrasi protein
 Laju sintesis
 Laju degradasi
2. Mengubah aktivitas spesifik protein
 Afinitas pengikatan substrat
 Konformasi aktif vs konformasi tidak aktif
3. Perubahan lokasi atau konsentrasi di dalam
sel dari:
 Protein tersebut
 Substrat
 Ligan

32. 3.4 Degradasi protein

33. 33
 Di dalam lisosom
 Di dalam sitoplasma
 Ubiquitin
menentukan protein
mana yang akan
didegradasi
 Protein yang terikat
poli-ubiquitin akan
didegradasi oleh
proteasome
Degradasi
protein

34. 34
3.5 Modifikasi non-kovalen
dan kovalen

35. 35
Pengikatan
oksigen ke
hemoglobin
secara
kooperatif
35

36. 36
36
Perubahan
konformasi
kalmodulin
akibat Ca++

37. 37
Regulasi aktivitas protein dengan GDP/GTP
37
GEF =guanine nucleotide exchange factor
GAP =GTPase activating protein
RGS = regulators of G protein signalling
GDI = guanine nucleotide dissociation inhbitors

38. 38
Regulasi aktivitas protein
dengan kinase/fosfatase

39. 39
3.6 Pemurnian protein
 Pemisahan berdasarkan perbedaan sifat
kimia dan fisika protein dgn molekul
lain
 Ukuran
 Afinitas

40. 40
40
Sentrifugasi
memisahkan
berdasarkan
massa atau
densitas

41. 41
SDS-PAGE
41
 SDS terikat pada
bagian hidrofobik
dari protein
 Protein
terdenaturasi
 Muatan protein
menjadi negatif

42. 42
Elektroforesis dua dimensi
42

43. 43
43
Pemisahan
berdasarkan
ukuran

44. 44
44
Kromatografi penukar ion

45. Kromatografi afinitas
 Pemurnian 1.000 – 10.000 x
 Protein rekombinan:
 Hexa-His: mengikat ion logam (Ni2+,
Cu2+
 GST (glutation S- transferase): mengikat
glutation
45

46. 46
46

47. Asai untuk mendeteksi suatu
protein spesifik
 Tergantung sifat spesifik protein
tersebut
 Pengikatan ligan
 Reaksi spesifik
 Mengikat antibodi spesifik
 Asai harus sederhana dan cepat
 Reaksi menghasilkan warna atau cahaya
47

48. 48
Western blotting
/ immunoblotting
48

49. 49
49

50. Deteksi molekul yang dilabel
 Autoradiografi
 Pengukuran radioaktivitas secara
kuantitatif
 Geiger counter → ion
 Scintillation counter → cahaya
 Phosphorimager

51. Autoradiografi
 Film yang kena radiasi akan
menjadi hitam
 Intensifying screen akan
berfluorosensi bila kena sinar β
pada suhu rendah
 Film diletakkan antara sumber
radiasi dan intensifying screen
 Radiasi yang menembus film
akan dipantulkan kembali ke
film sebagai cahaya
 Jumlah radioaktif dapat
dikuantifikasi dengan
densitometer
Densitometer

52. Liquid scintillation counting
 Bahan radioaktif dimasukkan ke dalam
tabung berisi scintillation fluid
 Scintillation fluid mengandung fluor
yang dapat berfluorosensi bila terkena
radiasi
 Tabung photomultiplier mengubah
foton menjadi count per minute (cpm)

53. Phosphorimaging
 Lapisan molekul pada plat
phosphoimager mengabsorbsi
sinar β dan tereksitasi
 Phosphoimager melakukan
scanning terhadap plat dengan
sinar laser
 Energi dari sinar β dilepaskan dan
ditangkap oleh detektor yang
dihubungkan ke komputer
 Energi dikonversi menjadi gambar
berwarna
 Energi terrendah kuning, tertinggi
hitam

54. Percobaan
pulse chase
 Pulse: cells labelled
for 1 hour with
[35S]Met, Cys
 Chase: cells grown
in non-radioactive
medium
 Immunoprecipitation
 SDS-PAGE
54

55. 55
55
MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/
ionization time of flight)
Rasio m/z
Peptida + asam
organik dikeringkan
pada logam/keramik
Sampel ditembak
dengan sinar laser,
peptida lepas dalam
bentuk gas terionisasi
Partikel terionisasi diakselerasi dalam medan listrik dan
terbang ke arah detektor
Waktu untuk mencapai detektor ditentukan massa dan
muatan

56. Electrospray (ES) ionization
 Mengubah peptida dalam larutan menjadi ion gas
56

57. Penentuan urutan asam amino
dgn alat MS/MS
 Mass spek I
 Protein diberi perlakuan dengan protease
 Massa masing-masing peptida ditentukan
 Mass spek II
 Peptida ditembak dengan atom-atom gas berenergi tinggi
 Ikatan peptida putus, terbentuk fragmen-fragmen yang
masing-masing berbeda 1 aa
 Fragmen-fragmen peptida dipisahkan dan massanya
ditentukan
 Urutan asam amino ditentukan berdasarkan perbedaan
massa antara peptida
 Bila massa aa jauh lebih tinggi, berarti ada modifikasi
pasca translasi
57

58. Penentuan struktur primer
protein
 Secara kimia
 Degradasi Edman: gugus amino pada
ujung N dilabel, asam amino dipotong dan
diidentifikasi dengan HPLC
 Siklus diulangi
 Dari sequence gen/genom
 Kombinasi MS dengan database
 Sidik jari massa peptida: BM peptida yang
dihasilkan setelah dipotong protease
58

59. Penentuan konformasi protein
 Kristalografi sinar X
 Mikroskopi krio-elektron
 Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic
Resonance)
59

60. 60
X-ray
cristallografy
60
 Sinar X: panjang gelombang 0,1 nm
(diameter atom H)
 Kristal protein diberi sinar X
 Sebagian besar menembusnya
 Sebagian dibelokkan, dibeberapa titik
bertemu & dicatat oleh detektor
 Dari pola yang muncul dapat
ditentukan strukturnya
 Data
 Resolusi 0,5 nm: struktur tulang
punggung protein
 Resolusi 0,15 nm: posisi semua
atom yang bukan H

61. 61
NMR (Nuclear Magnetic
Resonance)
 Dapat menentukan struktur protein kecil/domain protein
(≤200 aa)
 Diperlukan larutan protein dalam konsentrasi tinggi
 Larutan protein diletakkan pada medan magnetik yang kuat
 Momen magnetik / spin dari inti atom H menjadi searah medan
magnetik
 Diberi pulsa frekuensi radio (RF):
 Spin berubah
 Spin kembali searah, radiasi RF dilepaskan
 Inti tereksitasi mempengaruhi absorbsi dan emisi radiasi inti yang lain,
tergantung jarak antara inti
 Dengan informasi urutan asam amino, struktur 3D dapat ditentukan

62. 3.7 Proteomik:
Mempelajari semua atau sebagian besar
protein dalam sistem biologi
 Jumlah
 % proteome yang diekspresi
 Konsentrasi relatif masing-
masing protein
 Modifikasi
 Konsentrasi relatif masing-
masing bentuk protein
 Aplikasi
 Pola ekspresi protein untuk
diagnostik/target obat
 Interaksi
 Lokasi
 Fungsi
62

63. LC-MS/MS
 Campuran protein dipotong dgn protease
 Peptida difraksinasi dgn LC
 Fraksi di ES ke MS/MS
 Urutan asam amino peptida-peptida ditentukan
 Dari database dapat diketahui protein apa saja
yang terdapat dalam campuran protein semula
63

64. Identification of proteins in
organelles
Cell
lysis
64
Density
gradient
centrifugation
SDS-PAGE
and
immuno-
blotting
Proteolysis
and
LC-MS/MS

65. Quiz
 4 September quiz: bahan sampai daftar
serine protease
65