Xây dựng đồng thời quy trình xác định đồng thời Methanol và Ethanol trong máu bằng GC - Headspace.doc

Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
Tải tài liệu tại kết bạn zalo : 0973.287.149
BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN THỊ MINH THÚY
MSV: 1201607
XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH
ĐỒNG THỜI METHANOL VÀ
ETHANOL TRONG MÁU BẰNG GC
– HEADSPACE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2017

BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
=====*o0o*o0o*o0o*=====
TRẦN THỊ MINH THÚY
MSV: 1201607
XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH
ĐỒNG THỜI METHANOL VÀ
ETHANOL TRONG MÁU BẰNG GC
– HEADSPACE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Phạm Lê Minh
2. ThS. Phạm Quốc Chinh
Nơi thực hiện:
Khoa Hóa pháp - Viện Pháp y Quốc gia
HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô
giáo, em đã hoàn thành khóa luận của mình.
Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Phạm Lê Minh đã tạo mọi điều kiện cho em tham
gia làm khóa luận tại Viện Pháp y Quốc gia và tận tình hướng dẫn cho em khi gặp
khó khăn trong quá trình làm khóa luận.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS. Phạm
Quốc Chinh, cán bộ khoa Hóa pháp – Viện Pháp y Quốc gia, người đã trực tiếp
hướng dẫn, chỉ bảo nhiệt tình cho em trong suốt thời gian làm nghiên cứu trên viện.
Em xin cảm ơn tới Ban Giám đốc Viện Pháp y Quốc gia và Khoa Hóa pháp đã
tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp trong thời gian ngắn
nhất.
Em xin chân thành cảm ơn tới các cô chú, anh chị trên Khoa Hóa pháp trong thời
gian qua đã luôn nhiệt tình chỉ bảo cho em các thao tác tiến hành thí nghiệm và các
thao tác sử dụng thiết bị, máy móc.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã
luôn bên em, chia sẻ, động viên và giúp đỡ trong học tập cũng như trong cuộc sống.
Do thời gian làm đề tài có hạn nên không thể tránh được những thiếu sót nên em
rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô giáo và các bạn sinh viên.
Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2017
Sinh viên
Trần Thị Minh Thúy

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT...........................................................I
DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................................................I
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ..................................................................................... III
ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN.................................................................................................................. 3
1.1. Thực trạng sử dụng rượu ở Việt Nam............................................................................ 3
1.2. Ethanol......................................................................................................................................... 4
1.2.1. Nguồn gốc của ethanol ................................................................................................ 4
1.2.2. Tính chất vật lý................................................................................................................ 4
1.2.3. Chuyển hóa ethanol....................................................................................................... 5
1.2.4. Độc tính của ethanol..................................................................................................... 5
1.2.5. Các phương pháp xác định ethanol trong máu ..................................................... 6
1.2.5.1. Định tính bằng phương pháp hóa học................................................................... 6
1.2.5.2. Định lượng......................................................................................................................... 7
1.3. Tổng quan về methanol ........................................................................................................ 8
1.3.1. Nguồn gốc của methanol............................................................................................. 8
1.3.2. Tính chất lý học của methanol.................................................................................. 9
1.3.3. Chuyển hóa methanol................................................................................................... 9
1.3.4. Độc tính của methanol .............................................................................................. 10
1.3.5. Các phương pháp xác định methanol.................................................................. 11
1.3.5.1. Định tính methanol...................................................................................................... 11
1.3.5.2. Định lượng methanol ................................................................................................. 11
1.4. Tổng quan về sắc ký khí.................................................................................................... 11
1.4.1. Khái niệm........................................................................................................................ 11
1.4.2. Hệ thống GC.................................................................................................................. 12
1.5. Một số kỹ thuật xử lý mẫu đặc biệt dùng trong sắc ký khí................................ 14
1.5.1. Lấy mẫu khí.................................................................................................................... 15
1.5.2. Nhiệt phân....................................................................................................................... 15

1.5.3. Giải hấp phụ ......................................................................................... 15
1.5.4. Phân tích không gian hơi (headspace analysis) ................................... 15
1.6. Xác định đồng thời methanol và ethanol bằng GC- headspace ................... 17
1.6.1. Phương pháp định tính ......................................................................... 17
1.6.2. Phương pháp định lượng ...................................................................... 17
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 18
2.1.Nguyên liệu và trang thiết bị .......................................................................... 18
2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................... 18
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 18
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 18
2.2.Nội dung nghiên cứu....................................................................................... 19
2.2.1. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời methanol và ethanol trong
máu ..................................................................................................................... 19
2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng methanol và ethanol trong máu .... 19
2.2.3. Ứng dụng của phân tích methanol và ethanol trong máu ........................ 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 19
2.3.1. Chuẩn bị mẫu ........................................................................................... 19
2.3.2. Định tính và định lượng đồng thời ethanol và methanol trong mẫu máu 20
2.4.Áp dụng quy trình để phân tích mẫu thực tế .................................................. 26
2.5. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 26
Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ....................................................... 27
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng ethanol và methanol trong máu bằng
GC-headspace ........................................................................................................ 27
3.1.1. Quy trình xác định đồng thời ethanol và methanol trong máu............. 27
3.1.2. Lựa chọn nội chuẩn…………………………………………………………37
3.1.3. Khảo sát phổ của ethanol, methanol, 2-propanol ................................ 29
3.2. Thầm định phương pháp .............................................................................. 30
3.2.1. Tính phù hợp hệ thống .......................................................................... 30
3.2.2. Tính chọn lọc ........................................................................................ 31

3.3. Đánh giá phương pháp....................................................................................................... 33
3.3.1. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính................................................................... 33
3.3.2. Độ đúng và độ chính xác.......................................................................................... 35
3.3.3. Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng................................... 37
3.4. Áp dụng quy trình phân tích một số mẫu máu thực tế ......................................... 38
BÀN LUẬN............................................................................................................................................. 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................................... 41
PHỤ LỤC ................................................................................................................................................. 46

i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Acetyl CoA
ADH
ALDH
ADH
CYP2E1
D
EtOH
EDTA
GC
GC- headspace
IS
K
β
LOD
LOQ
MeOH
NAD+
RSD
SPME
WHO
v/v
Acetyl coenzym A
Enzym alcohol dehydrogenase
Enzym aldehyd dehydrogenase
Enzym alcohol dehydrogenase
Cytochrome 2E1
Độ hấp thụ
Ethanol
Acid ethylenediamin tetraacetic
Sắc ký khí (Gas Chromatograph)
Sắc ký khí sử dụng phương pháp lấy mẫu không gian hơi
Chất nội chuẩn
Hệ số phân bố
Tỷ lệ pha
Giới hạn phát hiện ( Limit of Detector)
Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)
Methanol
Coenzym nicotinamid adenin dinucleotid
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
Vi chiết pha rắn (Solid Phase Micro Extraction)
World Health Organization
Thể tích/thể tích

ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với methanol và ethanol 31
Bảng 3.2 Diện tích pic của methanol, ethanol và 2-propanol 34
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của methanol và 34
ethanol trong máu
Bảng 3.4 Kết quả diện tích pic của methanol, ethanol và 2-propanol 36
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác của methanol 36
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác của ethanol 37
Bảng 3.7 Kết quả định lượng một số mẫu cụ thể 40

iii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT Tên hình Trang
Hình 2.1 Hệ thống GC- Headspace 19
Hình 3.1 Sắc ký đồ của tert butanol 28
Hình 3.2 Sắc ký đồ của 2-propanol 28
Hình 3.3 Sắc ký đồ của methanol 29
Hình 3.4 Sắc ký đồ của ethanol 29
Hình 3.5 Sắc ký đồ của 3 chất methanol, ethanol, 2-propanol 30
Hình 3.6 Sắc ký đồ của mẫu máu trắng 32
Hình 3.7 Sắc ký đồ của mẫu máu chứa methanol, ethanol và 2- 32
propanol
Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đáp
ứng với nồng độ mẫu nhiễm trong máu của methanol và 35
ethanol

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sử dụng rượu bia đã trở thành phổ biến ở các quốc gia trên toàn thế giới, tuy
nhiên, lạm dụng rượu bia lại là một trong các nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tệ nạn
xã hội do mất kiểm soát hành vi, tai nạn giao thông, tử vong do ngộ độc và các bệnh
không lây nhiễm. Những hậu quả do sử dụng rượu bia ảnh hưởng nghiêm trọng tới
sự phát triển kinh tế và trật tự xã hội.
Theo số liệu của tổ chức y tế thế giới – WHO, tiêu thụ rượu bia trên thế giới ước
tính trong năm 2015 đạt 6,3 lít cồn nguyên chất mỗi người (từ 15 tuổi trở lên) [26].
Trong năm 2012, sử dụng rượu bia làm 3,3 triệu người chết chiếm 5,9% tổng số ca
tử vong trên toàn thế giới [34].
Tại Việt Nam, theo Cục Y tế Dự phòng (Bộ Y tế), những nghiên cứu mới nhất
cho thấy Việt Nam đang là nước sử dụng rượu bia ở mức báo động khi đứng thứ 2
trong khu vực, đứng thứ 10 châu Á và thứ 29 trên thế giới với 77,3% nam giới và
11% nữ giới sử dụng rượu bia. Theo thống kê tính đến tháng 1/2016, Việt Nam tiêu
thụ khoảng 3,4 triệu lít bia và 10 triệu lít rượu [10]. Đặc biệt, tình trạng làm giả
rượu (trộn cồn công nghiệp) là nguyên nhân gây ra tình trạng ngộ độc methanol
trong rượu ngày càng báo động và có thể gây ra tử vong nếu không xử lý kịp thời.
Trong số các trường hợp đó, nhiều mẫu máu đã được gửi xuống khoa Hóa Pháp-
Viện Pháp y Quốc gia để giám định nồng độ cồn trong máu.
Vì vậy, việc định lượng cồn trong máu có vai trò quan trọng trong việc xác định
nguyên nhân ngộ độc rượu để có hướng xử trí kịp thời cũng như nguyên nhân gây
tử vong. Trên thế giới, việc xác định đồng thời methanol và ethanol và các alcol
khác đã được thực hiện bằng phương pháp sắc ký khí [28], [30]. Tuy nhiên, ở Việt
Nam, các phương pháp đang sử dụng chủ yếu để xác định riêng methanol hoặc
ethanol mà chưa có nghiên cứu nào xác định đồng thời methanol và ethanol trong
máu trong khi GC- headspace là phương pháp có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và cho
kết quả nhanh chóng. Để hoạt động cấp cứu bệnh nhân nghi ngờ ngộ độc rượu hiệu
quả và nhanh chóng hơn, chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu ‘‘Xây dựng quy

2
trình xác định đồng thời methanol và ethanol trong máu bằng GC – Headspace’’
này
nhằm mục đích:
- Xây dựng quy trình định lượng đồng thời methanol và ethanol trong máu bằng
sắc kí khí
- Áp dụng vào phân tích mẫu máu thực tế.

3
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Thực trạng sử dụng rượu ở Việt Nam
Sử dụng rượu đã trở thành một văn hóa ăn sâu vào tiềm thức của người dân Việt
Nam đã và đang ảnh hưởng không nhỏ tới phát triển kinh tế, văn hóa xã hội.
Đặc biệt, trong các dịp Tết Nguyên đán, ngộ độc rượu và tai nạn giao thông có xu
hướng tăng. Theo thống kê của Bộ Y tế, trong 3 ngày nghỉ Tết Nguyên đán 2017, cả
nước đã ghi nhận gần 2.000 trường hợp nhập viện do ngộ độc rượu.
Mới đây nhất là vụ ngộ độc rượu tập thể ngày 13.2.2017 ở xã Ma Ly Chải, huyện
Phong Thổ, Lai Châu làm nhiều người tử vong cũng như ngộ độc. Vụ ngộ độc tập
thể này đã ghi nhận có 159 người liên quan đến ngộ độc ở mức độ từ nhẹ tới nặng,
trong đó có 9 người tử vong. Theo Cục An toàn thực phẩm (Bộ Y tế), báo cáo kết
quả kiểm nghiệm mẫu rượu ngày 15.2.2017 của Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh
thực phẩm quốc gia, 3 mẫu rượu lấy tại vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra tại bản Tả
Chải, xã Ma Ly Chải, huyện Phong Thổ, tỉnh Lai Châu cho thấy: hàm lượng
methanol là 970 mg/l cồn 1000
, 556.000 mg/l cồn 1000
và 475.000 mg/l cồn 1000
.
Theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm đồ uống có cồn (QCVN 6-
3:2010/BYT) và Tiêu chuẩn quốc gia về rượu trắng (TCVN 7043:2013) [1], [4],
hàm lượng methanol trong rượu không được lớn hơn 100 mg/l cồn 1000
. Kết quả
kiểm nghiệm hàm lượng methanol của 3 mẫu rượu này vượt ngưỡng cho phép nhiều
lần có thể xác định nguyên nhân ngộ độc do methanol. Nếu như không kiểm soát
được nguồn rượu, uống rượu giả, rượu pha với cồn công nghiệp thì ngộ độc rượu sẽ
có xu hướng gia tăng đặc biệt là những tháng đầu năm mừng tân xuân, lễ hội.
Tai nạn giao thông cũng là một trong những hệ lụy của việc sử dụng rượu bia.
Theo thống kê của Ủy ban An toàn giao thông quốc gia, khoảng 40% số vụ TNGT
và 11% số người tử vong do tai nạn liên quan đến rượu, bia. Theo báo Người Lao
động, trong năm 2016, cả nước xảy ra 21.589 vụ tai nạn giao thông, làm chết 8.685
người, làm bị thương 19.280 người.[8].
Đặc biệt, bệnh nhân bị ảnh hưởng của rượu bia đang có xu hướng trẻ hóa trong
khoảng từ 30-40 tuổi ảnh hưởng rất lớn tới phát triển kinh tế và xã hội. Như vậy, sử

4
dụng rượu bia tiềm ẩn những hậu quả khôn lường về sức khỏe, kinh tế xã hội như
các bệnh mãn tính (tim mạch, tiêu hóa…), tai nạn giao thông cũng như ngộ độc cấp
tính có nguy cơ dẫn tới tử vong cao.
1.2. Ethanol
1.2.1. Nguồn gốc của ethanol
Ethanol (C2H5OH) là một hợp chất hữu cơ có trong thành phần của đồ uống chứa
cồn.
Ethanol được tinh chế lần đầu tiên bởi các nhà giả kim thuật Hồi giáo bằng
phương pháp chưng. Ethanol nguyên chất lần đầu tiên đã thu được vào năm 1796
bởi Johann Tobias Lowitz, bằng cách lọc ethanol chưng cất qua than củi.
Năm 1807, Nicolas-Théodore de Saussure đã xác định được công thức hóa học
của nó. Năm 1858, Archibald Scott Couper đã công bố công thức cấu trúc của
ethanol. Ethanol lần đầu tiên được Michael Faraday tổng hợp nhân tạo vào năm
1825.
Ethanol có mặt ở tất cả các loại rượu thường dùng trong xã hội ở những tỷ lệ
khác nhau: 2-6% trong bia, 10-20% trong rượu vang, 25-30% trong rượu tự cất, 50-
70% trong rượu mạnh như rượu rum. Việc uống rượu quá liều dẫn tới say, gây ra
những hậu quả tai hại (tai nạn giao thông, mất trật tự xã hội, ngộ độc…). Uống rượu
quá nhiều có thể dẫn tới tử vong [9].
1.2.2. Tính chất vật lý [5], [9]
Ethanol là một chất lỏng, không màu, trong suốt, mùi hắc và đặc trưng, vị cay.
- Tỷ trọng nhẹ hơn nước (khối lượng riêng 0,7943 g/ml ở 15 độ C)
- Dễ bay hơi (sôi ở nhiệt độ 80,260
C), hóa rắn ở -114,15 độ C.
- Độ tan: tan trong nước ở bất kỳ tỷ lệ nào, tan trong ete và clorofom, hút ẩm, dễ
cháy trong không khí tạo CO2 và nước, khi cháy không có khói và ngọn lửa có màu
xanh da trời. Sở dĩ rượu etylic tan vô hạn trong nước và có nhiệt độ sôi cao hơn
nhiều so với este hay aldehyde có khối lượng phân tử xấp xỉ là do sự tạo thành liên
kết hydro giữa các phân tử rượu với nhau và với nước.

5
- Ethanol có tính khúc xạ hơi cao hơn so với của nước, với hệ số khúc xạ là
1,36242 (ở λ=589,3 nm và 18,35 °C).
- Điểm ba trạng thái của ethanol là 150 K ở áp suất 4,3 × 10−4
Pa
1.2.3. Chuyển hóa ethanol
Sau khi uống rượu từ 30 phút tới 1 giờ, ethanol chuyển nhanh vào máu, đi tới cơ
quan, nồng độ ethanol trong máu, thận, vỏ não tương đương nhau, còn ở gan ít hơn.
Ethanol sau khi vào cơ thể sẽ được hấp thu ngay ở dạ dày 20% và ở ruột 80%, qua
tĩnh mạch gan vào gan [9]
Tại gan, 90% ethanol được chuyển hóa, phần còn lại được thải trừ qua thận và
phổi. Quá trình chuyển hóa ethanol ở gan xảy ra theo 3 giai đoạn [18] [17]:
Bước 1: Xúc tác bởi enzym alcohol dehydrogenase, chủ yếu trong gan. Coenzym
là dinucleotid nicotinamid adenin (NAD) có vai trò vận chuyển điện tử, ethanol
được oxy hóa thành acetaldehyd và NAD+
chuyển thành NADH và H+
.
Bước 2: xúc tác bởi enzym aldehyd dehydrogenase (ALDH), acetaldehyd được
oxy hóa thành acid acetic; NAD+
tạo thành NADH. Phản ứng ALDH là phản ứng
một chiều.
Bước 3: Phần lớn các acid acetic được sản xuất bởi quá trình oxy hóa acetaldehyd
ở gan được vận chuyển đến các mô ngoại vi, nơi nó được hoạt hóa để tạo acetyl
CoA. Acetyl CoA cũng là chất chuyển hóa quan trọng của tất cả các carbohydrat
phân tử lớn, chất béo và protein dư thừa. Như vậy, sản phẩm chuyển hóa từ alcohol
cũng như các sản phẩm cùng loại được sản xuất từ quá trình oxy hóa carbohydrat,
chất béo và protein, bao gồm carbon dioxid, các acid béo, các ceton và cholesterol;
trong đó sản phẩm được hình thành phụ thuộc vào trạng thái năng lượng và các điều
kiện dinh dưỡng và nộị tiết.
Khi uống một lượng rượu lớn, ethanol sẽ chuyển hóa qua CYP2E1 ở gan để tạo
thành các gốc tự do phá hủy gan hoặc qua enzyme catalase (chủ yếu ở não) gây rối
loạn dẫn truyền thần kinh [7].
1.2.4. Độc tính của ethanol

6
Ngộ độc rượu cấp gây ra nhiều rối loạn tâm thần và thực thể. Thường do uống
quá nhiều rượu, liều gây độc thay đổi tùy thuộc mỗi cơ thể, thường rất cao ở người
nghiện rượu. Trên lâm sàng thường có các triệu chứng qua các giai đoạn và tổn
thương ở nhiều cơ quan khác nhau [3]:
+ Giai đoạn kích thích: Sảng khoái, hưng phấn thần kinh (vui vẻ, nói nhiều),
giảm khả năng tự kiềm chế (mất điều hòa, kích thích, hung hãn). Vận động phối hợp
bị rối loạn: đi đứng loạng choạng.
+ Giai đoạn ức chế: Tri giác giảm dần, giảm khả năng tập trung, lú lẫn. Phản xạ
gân xương giảm, trương lực cơ giảm. Giãn mạch ngoại vi.
+ Giai đoạn hôn mê: Hôn mê, thở yếu hoặc ngừng thở dẫn đến suy hô hấp, viêm
phổi sặc. Giãn mạch, tụt huyết áp, rối loạn nhịp tim, trụy mạch. Hạ thân nhiệt. Hạ
đường huyết. Co giật, tiêu cơ vân, rối loạn điện giải, toan chuyển hóa.
Những người uống rượu thường xuyên kể cả uống ít, cũng có thể dẫn tới xơ gan,
tổn thương tim, tim to và gan nhiễm mỡ [9]
Các kết quả lâm sàng và nồng độ ethanol trong máu có thể được phân loại như
sau (chỉ là ước tính sơ bộ và chưa được bằng chứng ở trẻ em) [18]:
+Nhiễm độc hoặc ói mửa: 0,125- 0,2% (v/v) (100-150 mg / 100ml)
+Mất cơ phối hợp:0,2-0,25% (v/v) (150-200 mg / 100ml)
+Giảm mức độ ý thức: 0,25-0,4% (v/v) (200-300 mg / 100ml)
+Tử vong: 0,4-0,6% (v/v) (300-500 mg / 100ml)
1.2.5. Các phương pháp xác định ethanol trong máu
1.2.5.1. Định tính bằng phương pháp hóa học[14]
Cho mẫu thử vào bình cất. Sau khi đun sôi bình sinh hơi, acid hóa mẫu thử bằng
acid oxalic 10% và nối nhau với bình sinh hơi. Cất vào 3 bình
- Bình 1: có 2 ml dung dịch natri hydroxyd (NaOH) 15ml
- Bình 2 và bình 3 mỗi bình có 25-30 ml nước cất
Làm các phản ứng định tính sau

7
- Lấy 1 ml dịch cất vào ống nghiệm, thêm 2 ml dung dịch NaOH 5%. Cho từng
giọt dung dịch iod 1% cho đến khi có màu vàng. Đun nóng nhẹ. Nếu có ethanol thì
có mùi iodoform, nếu có nhiều ethanol sẽ có màu vàng.
- Lấy 1 ml dịch cất, acid hóa bằng acid sulfuric (H2SO4) 10% (thử bằng giấy quỳ).
Thêm 1 ml acid acetic (CH3COOH). Nếu có ethanol sẽ có mùi đặc trưng của ethyl
acetat (CH3COOC2H5).
- Lấy 1 ml dịch cất, thêm 2 ml H2SO4 đặc. Cho vài giọt dung dịch kali dicromat
(K2Cr2O7) 1,9%. Nếu có nhiều ethanol sẽ cho màu xanh lơ.
1.2.5.2. Định lượng
1.2.5.2.1. Phương pháp dicromat [9]
Ở nhiệt độ thường, hơi ethanol hoặc nước tiểu của người uống rượu làm dung
dịch K2Cr2O7 trong H2SO4 chuyển từ màu vàng qua xanh nâu. Đó chính là phản
ứng oxy hóa rượu
C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O
1ml K2Cr2O7 0,1N ứng với 11,5 g ethanol.
Phương pháp này chịu ảnh hưởng nhiều của chất khử nên thường có sai số, tuy
nhiên sai số không nhiều, cách làm đơn giản nên hay được sử dụng trong thực tế.
1.2.5.2.2. Định lượng nồng độ rượu trong máu gián tiếp
Đo nồng độ rượu trong hơi thở có thể ước tính nồng độ rượu trong máu
Nguyên tắc: cho đối tượng nghiên cứu thở vào dụng cụ chứa sẵn hỗn hợp
K2Cr2O7 và H2SO4. Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự oxy hóa ethanol có
trong hơi thở bởi K2Cr2O7 và H2SO4. Áp suất riêng phần của ethanol trong hơi thở
được coi như tỉ lệ thuận với hàm lượng ethanol trong máu.
Hạn chế: phương pháp này chỉ áp dụng cho các đối tượng tham gia giao thông có
nghi sử dụng rượu bia vẫn vòn tỉnh táo, với các trường hợp bệnh nhân ngộ độc rượu
sẽ không sử dụng phương pháp này. Phương pháp này cho kết quả tương đối và có
sự sai khác giữa các cá thể: khoảng thời gian tiêu thụ rượu, dung tích phế nang, lưu
lượng thở ra…[33]

8
1.2.5.2.3. Phương pháp enzym
Đây là phương pháp hay được sử dụng nhất hiện nay trong các khoa xét nghiệm
ở các bệnh viện.
Nguyên lý [2]
Ethanol được định lượng theo phương pháp động học enzym.
Ethanol + NAD+
= acetaldehyd + NADH + H+
Ethanol và NAD được chuyển đổi thành acetaldehyd và NADH bởi enzyme
ADH (alcoldehydrogenase). Các NADH được hình thành trong quá trình phản ứng
làm thay đổi độ hấp thụ, nồng độ ethanol được đo ở bước sóng 340nm.
Phương pháp này rất đặc hiệu, cho kết quả tốt từ 5-5-µg ethanol, có thể định
lượng thẳng trong huyết thanh không màu. Nếu mẫu thử là máu thì cần loại protein
hoặc cất thu lấy ethanol [9]
Hạn chế: xét nghiệm này chỉ phát hiện được ethanol, không phát hiện được các
alcol khác đặc biệt là methanol. Do vậy, xét nghiệm này không xác định được sự có
mặt của các alcol khác trong trường hợp bệnh nhân uống đồng thời nhiều loại rượu.
Trong trường hợp nghi ngờ bệnh nhân ngộ độc rượu do alcol khác cần tiến hành
phân tích sắc ký khí (GC) [19].
Cũng dựa theo nguyên tắc phản ứng enzyme, NADH tạo thành được oxy hóa
thành NAD+
ngay trên bề mặt điện cực cảm ứng tạo thành tín hiệu phân tích.
Ethanol được xác định gián tiếp qua điện cực cảm ứng. Phương pháp này sử dụng
điện thế cao nên có thể ảnh hưởng tới các chất trong mẫu, thường được sử dụng để
định lượng ethanol trong rượu vang, rượu nho. Phương pháp này ít được nghiên cứu
trên mẫu máu [21].
1.3. Tổng quan về methanol
1.3.1. Nguồn gốc của methanol
Methanol còn được gọi là methyl alcohol, là một chất hóa học với công thức
CH3OH (thường được viết tắt MeOH). Methanol có tên "rượu gỗ" vì nó đã từng
được sản xuất chủ yếu từ quá trình chưng cất phân hủy gỗ.

9
Methanol nguyên chất lần đầu tiên được phân lập năm 1661 bởi Robert Boyle,
khi ông chưng cất gỗ hoàng dương. Năm 1834, các nhà hóa học người Pháp Jean-
Baptiste Dumas và Eugene Peligot đã xác định công thức cấu tạo của methanol.
Năm 1923, các nhà hóa học người Đức đã phát triển một phương pháp sản xuất
methanol từ khí tổng hợp (hỗn hợp carbon monoxid, carbon dioxid và hydrogen);
quá trình này sử dụng crom và oxit mangan làm chất xúc tác với áp suất 50-220 atm
và nhiệt độ lên đến 450°C. Sản xuất methanol hiện đại đã được thực hiện hiệu quả
hơn thông qua sử dụng của các chất xúc tác (thường là đồng) có khả năng hoạt động
ở áp suất thấp hơn.
MeOH ít phổ biến hơn EtOH, chỉ được sử dụng trong phòng thí nghiệm, làm
nguyên liệu, dung môi trong công nghiệp hóa học. Tuy nhiên, vẫn thường gặp ngộ
độc methanol do nhiều nguyên nhân: uống nhầm hay dùng rượu pha trộn với
methanol, tiếp xúc với không khí có nhiều methanol…
1.3.2. Tính chất lý học của methanol [9], [27]
Là chất lỏng trong suốt, không màu, có mùi đặc trưng, dễ bay hơi và tan vô hạn
trong nước ở 200
C .
- Dễ bay hơi ở 650
C
- Nhẹ hơn nước với tỉ trọng: 0.796 g/cm3
ở 150
C.
- Áp suất hơi: 13.02 kPa (ở 200
C)
Các tính chất vật lý, hóa học của methanol tương tự ethanol nhưng độc tính cao
hơn rất nhiều.
1.3.3. Chuyển hóa methanol trong máu [24], [31]
Sau khi uống, methanol được hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa và chuyển hóa ở
gan. Trong bước chuyển hóa đầu tiên, methanol được chuyển hóa thành
formaldehyd qua enzyme alcohol dehydrogenase (ADH). Phản ứng này là chậm hơn
so với các bước chuyển hóa tiếp theo, sự chuyển đổi của formaldehyd thành acid
formic qua enzym aldehyd dehydrogenase. Điều này có thể giải thích lý do các triệu
chứng ngộ độc methanol thường chậm giữa thời điểm uống và bắt đầu có hiệu lực.
Nửa đời của formaldehyd được ước tính là 1-2 phút.

10
Acid formic tiếp tục bị oxy hóa thành carbon dioxid và nước khi có
tetrahydrofolat. Chuyển hóa của axit formic là rất chậm; do đó, axit formic thường
tích tụ trong cơ thể gây nhiễm toan chuyển hóa.
Ái lực của enzyme ADH đối với ethanol mạnh gấp 10 – 20 lần methanol. Do vậy,
có thể sử dụng ethanol để làm chậm chuyển hóa của methanol trước khi loại bỏ
chúng ra khỏi cơ thể ở những người ngộ độc methanol [24]
1.3.4. Độc tính của methanol [3]
Hầu hết, các trường hợp ngộ độc methanol do tiếp xúc lâu dài với methanol
đường hít, qua da, đường uống hoặc uống một lượng lớn methanol vào cơ thể. Các
triệu chứng xuất hiện sớm hay muộn tùy thuộc vào lượng methanol đưa vào cơ thể,
uống cùng hay không ethanol và cơ địa mỗi người.
Thường có hai giai đoạn, giai đoạn kín đáo (vài giờ đến 30 giờ đầu) và giai đoạn
ngộ độc rõ tiếp theo sau. Vì triệu chứng lúc đầu thường kín đáo và nhẹ (ức chế nhẹ
thần kinh, an thần, vô cảm) nên thường bị bỏ qua hoặc trẻ nhỏ không được phát
hiện. Biểu hiện thường gặp là:
+ Thần kinh: methanol là chất ức chế thần kinh trung ương, tương tự ngộ độc
ethanol nhưng ở mức độ nhẹ hơn, gây an thần và vô cảm.
+ Mắt: Lúc đầu bình thường, sau đó 12 -24 giờ nhìn mờ, nhìn đôi, sợ ánh sáng.
+ Các di chứng thần kinh: rối loạn ý thức, hôn mê, hội chứng parkinson, thiết hụt
nhận thức.
+ Tim mạch, hô hấp: tụt huyết áp và suy tim thở yếu, ngừng thở; thở nhanh, sâu.
+ Tiêu hoá: viêm dạ dày xuất huyết, viêm tuỵ cấp biểu hiện đau thượng vị, nôn,
ỉa chảy. Ngộ độc trung bình hoặc nặng có thể thay đổi chức năng gan.
+ Thận: suy thận cấp, biểu hiện đái ít, vô niệu, nước tiểu đỏ hoặc sẫm màu nếu
có tiêu cơ vân.
Liều độc của methanol thay đổi tùy mỗi cá thể và điều trị kịp thời. Nồng độ
methanol trong máu trên 0,06% (v/v) (50 mg /100ml) có biểu hiện ngộ độc. Nồng
độ trên 0,18-0,24% (v/v) (150-200 mg / 100ml) sẽ dẫn đến tử vong ở những bệnh
nhân không được điều trị [25].

11
Độc tính của methanol cao hơn rất nhiều ethanol là do thời gian tích lũy trong cơ
thể dài (dài hơn 15 lần so với ethanol), và các sản phẩm chuyển hóa của nó ảnh
hưởng tới rất nhiều enzym [9].
1.3.5. Các phương pháp xác định methanol trong máu [9]
1.3.5.1. Định tính methanol

Nguyên tắc


Loại protein trong máu bằng acid tricloacetic, sau đó oxi hóa bằng kali
permanganat (KMnO4) trong acid phosphoric (H3PO4) và làm phản ứng màu với acid cromotropic ((HO)₂C₁₀H₄(SO₃H)₂).

Thuốc thử và dụng cụ


Dung dịch A: hòa tan 3g KMnO4 trong 15ml H3PO4. Thêm 85ml nước cất.

Dung dịch B: acid tricloacetic (C2HCl3O2)
20%. Natribisulfit, acid cromotropic.

Tiến hành

Lấy 2ml máu (chất chống đông không phải heparin hay EDTA) trộn với 4ml
dung dịch B. Lắc đều, ly tâm loại bỏ kết tủa.
Lấy 0,1ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch A. Đợi đúng 2 phút, loại KMnO4 thừa
bằng natri sulfit. Thêm vài giọt tinh thể acid cromotropic. Trộn đều. Thêm từ từ 3ml
H2SO4 đặc để tạo thành một lớp chất lỏng riêng. Nếu có vòng tròn tiếp xúc giữa hai
bề mặt chất lỏng thì đó là methanol.
1.3.5.2. Định lượng methanol
Các phương pháp định lượng methanol chủ yếu dựa vào phản ứng oxi hóa để tạo
formaldehyde. Sau đó, định lượng bằng phương pháp đo quang với thuốc thử Schiff
hoặc acid cromotropic ở 570nm. Dựa vào giá trị D ước lượng tỉ lệ phần trăm
methanol trong mẫu.
1.4. Tổng quan về sắc ký khí [14]
1.4.1. Khái niệm
Sắc ký khí (GC) là một phương pháp tách các chất từ một hỗn hợp ở thể khí bay
hơi với pha động là một chất khí thường là khí trơ.

12
Phân tích không gian hơi (headspace analysis) là phương pháp lấy thành phần
bay hơi tách ra từ mẫu rắn hoặc lỏng bằng cách đun nóng mẫu trong bình và hứng
lấy chất bay hơi. Sau khi quá trình bay hơi cân bằng, tỉ lệ thành phần bay hơi ở bình
hứng đại diện cho tỷ lệ ở trong mẫu. Người ta dùng bơm tiêm khí đưa thành phần
bay hơi vào cột sắc ký. Kỹ thuật này rất thích hợp để định lượng alcol hoặc dung
môi trong mẫu máu, monomer trong sản phẩm polymer, hương liệu trong sản phẩm.
1.4.2. Hệ thống GC

Sơ đồ sắc ký khí gồm các bộ phận sau

- Pha động: Khí mang đưa mẫu đi qua cột
- Pha tĩnh: Cột sắc ký dặt trong lò cột
- Hệ thống tiêm mẫu: Đưa mẫu vào cột.
- Detector: Phát hiện chất phân tích trong mẫu
- Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu.
1.4.2.1. Hệ thống cấp pha động
Trong sắc ký khí pha động thường là các khí trơ như: heli, argon, nitơ, hoặc khí
carbonic và khí hydro. Lựa chọn khí trơ nào làm pha động còn phụ thuộc vào loại
detector cần dùng. Nhiệm vụ của pha động là đưa chất phân tích qua cột. Vì vậy,
ngưởi ta gọi pha động là khí mang.
Yêu cầu của khí mang là trơ về mặt hóa học, đảm bảo độ tinh khiết và phù hợp
với từng loại detector.
Với cột mao quản thường dùng hydro hoặc heli. Các khí cần phải thật tinh khiết,
thường cho qua các chất hấp phụ thích hợp (than hoạt, rây phân tử) để loại hơi nước
và các tạp chất (không khí hoặc oxy, hydrocacbon).
1.4.2.2. Hệ tiêm mẫu
Có nhiều kỹ thuật tiêm khác nhau.

Với cột mao quản thường dùng 3 kỹ thuật tiêm mẫu sau:

- Kỹ thuật tiêm chia dòng (split): chia dòng khí mang 1:10 hoặc 1:100 để giảm
lượng mẫu vào cột (giảm 90% hoặc hơn). Kỹ thuật này thích hợp cho cột mao quản.
Độ nhạy giảm vì chỉ có một lượng mẫu nhỏ vò cột.

13
- Kỹ thuật tiêm không chia dòng (splitless): toàn bộ mẫu được ngưng tụ ở đầu cột
đã làm lạnh, sau đó tăng nhiệt độ làm bay hơi mẫu. Độ nhạy tăng, nhưng có nguy
cơ giãn rộng pic.
- Kỹ thuật tiêm thẳng vào cột (on – column): mẫu được ngưng tụ ở đầu cột, sau đó
làm bay hơi theo chương trình nhiệt độ. Tăng độ nhạy, giảm phân hủy mẫu do nhiệt.
Ngoài các kỹ thuật tiêm mẫu trên, còn có hệ tiêm mẫu tự động. Kỹ thuật này
không chỉ xử lý được nhiều mẫu và còn tăng độ chính xác thể tích tiêm.
1.4.2.3. Cột và lò cột
Trong sắc ký khí có 2 loại cột là: cột nhồi (packed column) và cột mao quản
(capillary column). Ngày nay, do nhiều ưu điểm nên người ta sử dụng phổ biến là
cột mao quản.
Nhiệt độ của sắc ký khí là một thông số rất quan trọng cần kiểm soát chính xác.
Lò cột làm nhiệm vụ điều nhiệt cho cột sắc ký khí. Nhiệt độ cung cấp cho cột sắc ký
có thể theo chương trình đẳng nhiệt hoặc chương trình gradient.
 Chương trình đẳng nhiệt: nhiệt độ của lò cột hằng định trong suốt quá trình phân
tích. Tuy nhiện, chương trình đẳng nhiệt thường không cho kết quả như mong muốn
do:

- Nếu đẳng nhiệt quá cao, các pic được rửa giái sớm có thể chưa được phân giải
hoàn toàn.
- Nếu đẳng nhiệt quá thấp, các chất được rửa giải sau có thể có thời gian lưu quá
dài, pic rộng và (hoặc) không cân đối.
 Chương trình gradient nhiệt độ: nhiệt độ của cột được tăng từ từ trong quá trình
sắc ký để tăng độ phân giải cho hỗn hợp nhiều thành phần có điểm sôi khác nhau
đồng thời làm giảm thời gian phân tích. Chương trình nhiệt độ tối ưu cho mỗi mẫu
cụ thể được xác lập thông qua thực nghiệm.
1.4.2.4. Pha tĩnh trong sắc kí khí – lỏng
Có nhiều chất có thể sử dụng làm pha tĩnh. Một vấn đề quan trọng của pha tĩnh là
phải cho hệ số phân bố khác nhau với chất tan. Điều này liên quan đến độ phân cực
của pha tĩnh. Thường phân ra 4 nhóm:

14
- Pha tĩnh phân cực thường chứa nhóm chức: - CN, - CO, - OH,
- Pha tĩnh không phân cực thường là dẫn chất dialkyl siloxan, hydrocarbon bão hòa
- Pha tĩnh rất phân cực như polyol,
- Pha tĩnh phân cực trung bình như: các hợp chất của ether, ceton, aldehyd.
Hiện nay, có hai nhóm chất được dùng rất phổ biến trong sắc ký khí lỏng là:
nhóm dẫn chất polydimethyl siloxan và nhóm polyethylene glycol.
Phát hiện chất phân tích ở dạng khí trong dòng pha động khi đến detector dựa
trên sự thay đổi tính chất vật lý hoặc tính chất riêng biệt nào đó khi rửa giải (ví dụ
như dễ bị ion hóa). Có thể phân loại detector thành hai nhóm:
- Detector vạn năng: đáp ứng với tất cả các chất tan.
- Detector chọn lọc: đáp ứng với đặc tính riêng biệt nào đó của chất tan.
Một detector lý tưởng cho sắc ký khí cần đáp ứng yêu cầu sau:
- Đáp ứng nhanh và lặp lại với sự có mặt của chất phân tích trong khí mang,
- Giới hạn phát hiện cao, có thể phát hiện ở nồng độ hoặc khối lượng rất thấp có thể
có của chất phân tích,
- Tín hiệu đo được tỷ lệ thuận với nồng độ hoặc khối lượng chất phân tích trong một
khoảng rộng (khoảng tuyến tính rộng),
- Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng.
- Dẫn nhiệt TCD (thermal conductivity detector)
- Ion hóa ngọn lửa FID (flame ionisation detector)
- Nitơ phosphor NPD (nitrogen – phosphorus detector)
- Cộng kết điện tử ECD (electron capture detector).
1.5. Một số kỹ thuật xử lý mẫu đặc biệt dùng trong sắc ký khí
Sắc ký khí dùng để phân tích hỗn hợp các chất bay hơi. Tuy nhiên trong nhiều
trường hợp mẫu phân tích chứa cả hợp chất bay hơi và chất không bay hơi hoặc các
chất dễ bị phân huy bởi nhiệt. Để phân tích các chất bay hơi hoặc dễ phân hủy bởi
nhiệt trong mẫu cần xử lý, tìm cách tách riêng thành phần cần định lượng.

15
1.5.1. Lấy mẫu khí
Để lấy mẫu chất khí trong khí quyển người ta dùng bẫy khí. Dùng bơm để hút
một lượng chất khí qua ống đựng chất hấp phụ (thường lấy từ 0,5L không khí trở
lên). Khi lấy mẫu xong, nếu cần lưu giữ phải để lạnh 20
C. Để phân tích , người ta để
bẫy khí vào lò và nối với dầu vào của cột sắc ký. Dòng khí mang sẽ đưa chất cần
phân tích vào cột. Việc phân tích này khá đơn giản do pic sắc ký ít hơn nhiều, mặt
khác cột không bị nhiễm bẩn bởi các chất không bay hơi trong mẫu.
1.5.2. Nhiệt phân
Nhiệt phân dùng để phân hủy mẫu tạo ra các chất có khối lượng phân tử nhỏ hơn
dễ bay hơi. Nhờ sắc ký khi xác định các thành phần này để nhận diện mẫu ban đầu.
1.5.3. Giải hấp phụ
Dùng chất hấp phụ rắn để lấy thành phần bay hơi từ mẫu. Sau đó bằng cách đun
nóng để giải phóng chất bay hơi (giải hấp phụ) đưa nó vào cột sắc ký. Chất hấp phụ
thường dùng là than hoạt hoặc hạt nhồi dùng trong cột sắc ký. Kỹ thuật giải hấp phụ
này có thể dùng phối hợp với kỹ thuật lấy mẫu không gian hơi sẽ được trình bày
dưới đây.
1.5.4. Phân tích không gian hơi (headspace analysis) [16]
1.5.4.1. Nguyên tắc hoạt động
Hầu hết các sản phẩm tiêu dùng và các mẫu sinh học đều chứa các thành phần
khác nhau về cấu tạo, trọng lượng, độ phân cực và độ ổn định. Với các mẫu phức
tạp như vậy thì kĩ thuật lấy mẫu không gian hơi là phương pháp lấy mẫu nhanh nhất
và sạch nhất để tiến hành phân tích các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi. Mẫu được
chuần bị trong một lọ chứa mẫu gồm dung dịch pha loãng và mẫu cần phân tích.
Hợp chất dễ bay hơi sẽ được tách ra khỏi phần không bay hơi và phân bố vào trong
phần khoảng trống phía trên của lọ chứa mẫu. Phần hơi của lọ chứa mẫu sẽ được
tiêm vào sắc ký khí để tiến hành phân tích từng thành phần dễ bay hơi [16], [29].
 Hệ số phân bố K

Mẫu phải được chuẩn bị để nồng độ chất phân tích đạt nồng độ tối đa trong pha
khí vả giảm thiểu ảnh hưởng của các thành phân khác có trong mẫu đến quá trình

16
phân tích mẫu. Để xác định nồng độ chất cần phân tích trong pha hơi cần tính toán
hệ số phân bố K. Hệ số phân bố K được định nghĩa là sự phân bố ở trạng thái cân
bằng giữa pha lỏng và pha khí của chất phân tích
K= Cs/Cg Trong đó: Cs là nồng độ chất phân tích ở pha lỏng
Cg là nồng độ chất phân tích ở pha khí
Các hợp chất có hệ số K thấp sẽ có xu hướng phân bố dễ dàng hơn vào pha khí
và có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp.
K có thể được hạ xuống bằng cách thay đổi nhiệt độ mà các lọ mẫu đạt trạng thái
cân bằng hoặc thay đổi thành phần của mẫu. K có thể giảm xuống bằng cách thêm
muối vô cơ vào trong dung dịch mẫu.
 Tỉ lệ pha (β)
Tỉ lệ pha được định nghĩa là thể tích tương đối của pha khí so với thể tích mẫu
trong lọ. Giá trị β thấp (thể tích mẫu lớn) sẽ làm tăng độ nhạy của hợp chất dễ bay
hơi. Tuy nhiên, giá trị β giảm phải luôn luôn cải thiện độ nhạy. Khi giảm giá trị β
bằng cách tăng thể tích mẫu, các hợp chất có giá trị K lớn sẽ phân bố vào pha hơi ít
hơn so với các hợp chất có giá trị K nhỏ. Vì vậy, đối với hợp chất có giá trị K lớn
cần tối ưu hóa để thu được giá trị K thấp nhất trước khi thay đổi giá trị β
(β) = Vg/Vs Trong đó: Vg là thể tích pha khí
Vs là thể tích mẫu trong lọ
 Mối quan hệ giữa K và β
K và β cùng quyết định nồng độ chất phân tích ở pha hơi. Nồng độ các hợp chất bay
hơi trong pha khí có thể được biểu diễn bằng
Cg = Co/(K+β) Trong đó :Cg là nồng độ chất phân tích ở pha khí
Co là nồng độ chất phân tích trong mẫu ban
đầu 1.5.4.2. Một số kỹ thuật lấy mẫu không gian hơi
Lấy mẫu không gian hơi động (Dynamic headspace sampling): pha động được dẫn
vào trong lọ chứa mẫu đã được làm nóng để lấy thành phần bay hơi trong mẫu.
Thành phần bay hơi sẽ được dẫn vào ống chứa chất hấp phụ đặc biệt gọi là bẫy. Sau
đó, bẫy được làm nóng để giải phóng ra chất cần phân tích và đưa vào cột sắc ký.

17
Lấy mẫu không gian hơi tĩnh (Static headspace sampling): Lọ chứa mẫu được làm
nóng trong lò kín ở một khoảng thời gian xác định có thể kết hợp với lắc mẫu để
làm chuyển chất phân tích sang dạng khí. Sau đó, sử dụng kim tiêm tự động hoặc
bằng tay lấy phần khí trong lọ chứa mẫu đưa vào cột sắc ký.

Vi chiết pha rắn (Solid Phase Micro Extraction-SPME) [6], [16] : là kỹ
thuật tách
chiết, làm tăng nồng độ chất phân tích mà không cần sử dụng dung môi. Nguyên lý
tách của phương pháp này là do sự phân bố của các chất phân tích giữa pha lỏng/
pha khí với một lớp hấp phụ mỏng bằng polymer được phủ bên ngoài sợi silica của
thiết bị SPME (được gọi là sợi chiết). Nhìn chung, các sợi chiết không phân cực sẽ
thu hồi tốt các hợp chất không phân cực, sợi chiết phân cực mạnh sẽ nhạy với các
chất phân tích phân cực như cồn.... Các chất bám trên sợi silica sẽ được giải hấp phụ
trực tiếp vào buồng hóa hơi của thiết bị sắc ký khí.
1.6. Xác định đồng thời methanol và ethanol bằng GC- headspace
Các phương pháp đã trình bày ở trên, thường chỉ xác định được methanol hoặc
ethanol. Sử dụng sắc ký khí có thể xác định đồng thời được cả methanol và ethanol
một cách nhanh chóng và chính xác.
1.6.1. Phương pháp định tính
Trong sắc ký thường có hai phương pháp định tính:
- Phương pháp 1: Dựa vào thời gian lưu tR của chất cần phân tích và chất chuẩn
trong cùng điều kiện phân tích sắc ký.
- Phương pháp 2: Thêm chuẩn vào mẫu, so sánh cường độ của chất cần phân tích
trong mẫu ban đầu và mẫu thêm chuẩn (cường độ tăng) trong cùng điều kiện phân
tích sắc ký.
1.6.2. Phương pháp định lượng
Diện tích (S) hay chiều cao (H) của pic sắc ký trên sắc ký đồ tỉ lệ thuận với nồng
độ của chất, do đó từ diện tích hay chiều cao của pic ta có thể tính được chính xác
nồng độ của mỗi hợp chất trong hỗn hợp cần phân tích.

18
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và trang thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
+ Chất chuẩn ethanol: 99,9% (Merck, Đức), khối lượng riêng 789mg/ml, số lô
ET00072500.
+ Chất chuẩn methanol 99,8% (Merck, Đức), khối lượng riêng 792mg/ml, số lô
I558118039
+ Chất chuẩn 2-propannol 99,7% (Merck, Đức), số lô K31073934
+Tert butanol 99,5% (Daejung), số lô 75-65-00
+ Nước cất
+ Natri chlorid PA
2.1.2. Thiết bị và dụngmcụ
+ Máy sắc ký khí: Agilent technologies 6890N
+ Headspace : Agilent Technologies 6188
+ Cột sắc ký khí : HPB ALC 7,5 m × 0.320 mm x 20 µm
Hình 2.1. Hệ thống GC - Headspace
+ Bình định mức, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh khác
+ Lọ thủy tinh 20 ml chứa mẫu, nắp cao su và nắp nhôm.
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
+ Mẫu máu trắng (không nhiễm methanol và ethanol) tại khoa Hóa Pháp – Viện
Pháp y Quốc gia

19
+ Mẫu máu thực gửi tới giám định tại Khoa Hóa Pháp – Viện Pháp y Quốc gia
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời methanol và ethanol trong máu
- Xử lý mẫu để đưa ra quy trình cụ thể
- Lựa chọn điều kiện sắc ký, điều kiện không gian hơi, lựa chọn nội chuẩn đưa ra
chương trình sắc ký để định lượng.
2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng methanol và ethanol trong máu
- Tính phù hợp của hệ thống sắc ký
- Tính chọn lọc - độ đặc hiệu
- Độ tuyến tính
- Độ đúng và độ chính xác
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
2.2.3. Ứng dụng của phân tích methanol và ethanol trong máu
Sử dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích mẫu máu của người nghi ngộ
độc rượu do methanol và ethanol được gửi đến giám định tại Khoa Hóa Pháp – Viện
Pháp y Quốc gia.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chuẩn bị mẫu
Bao gồm chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu nhiễm và mẫu thực.

Lấy mẫu và bảo quản mẫu

Mẫu máu gửi đến Khoa Hóa Pháp – Viện Pháp y Quốc gia, đựng trong tuýp
sạch có nắp kín. Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 2-80
C để xử lý ngay.

Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

- Mẫu chuẩn chứa methanol và ethanol
+ Chuẩn gốc: lấy 3 ml methanol và 3 ml ethanol nguyên chất cho vào bình định
mức 100 ml, cho nước cất vừa đủ 100 ml được dung dịch methanol và ethanol
chuẩn 3%.
Lấy 2 ml methanol và 2 ml ethanol nguyên chất cho vào bình định mức 100 ml,
cho nước cất vừa đủ 100 ml được dung dịch methanol và ethanol chuẩn 2% (v/v).

20
+ Từ dung dịch methanol và ethanol 2% (v/v) pha loãng thành các dung dịch chuẩn
có nồng độ 0,2% (v/v) và 0,02% (v/v) trong nước cất.
- Dung dịch 2-propanol 0,1% (v/v): lấy 0,1 ml 2-propanol nguyên chất cho vào bình
định mức 100 ml, cho nước cất vừa đủ tới vạch.
- Dung dịch tert-butanol 0,1% (v/v): lấy 0,1 ml tert-butanol nguyên chất cho vào
bình định mức 100 ml, cho nước cất vừa đủ tới vạch.
-Các mẫu máu nhiễm :
+ Lấy lọ thủy tinh dung tích 20 ml, sử dụng mẫu máu trắng thêm chuẩn ethanol và
methanol để được các mẫu máu nhiễm với các nồng độ khác nhau dùng đề khảo sát.
+ Thêm 200µl nước muối NaCl bão hòa và 100µl nội chuẩn 2-propanol.
-Mẫu máu thực: bảo quản lạnh và lắc đều mẫu khi dùng.
+ Lấy lọ thủy tinh dung tích 20 ml, cho vào 200 µl máu.
+Thêm 200 µl nước muối NaCl bão hòa và 100 µl nội chuẩn 2-propanol.
* Các lọ thủy tinh trên được đậy nắp kín, chuyển vào khay tự động của máy
Headspace.
2.3.2. Định tính và định lượng đồng thời ethanol và methanol trong mẫu máu
2.3.2.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký
Dựa theo quy trình xác định ethanol và methanol trong máu bằng sắc ký khí
được ghi nhận trong tài liệu “Quy trình giám định pháp y” (2014) của Bộ Y Tế [2]
và “Quy trình xác định đồng thời methanol và ethanol trong máu” của khoa Hóa
pháp, Viện Pháp y Quốc gia, các nghiên cứu xác định methanol và ethanol trong
máu [12], [20], [22], [28], [30] tiến hành lựa chọn điều kiện sắc ký và khảo sát để có
điều kiện sắc ký phù hợp.
2.3.2.2. Lựa chọn nội chuẩn
Trong định lượng bằng phương pháp sắc ký, phương pháp chuẩn ngoại tỏ ra có
nhiều nhược điểm trong phân tích các mẫu phải xử lý phức tạp (chiết tách…) có thể
gây mất mẫu và đặc biệt là các mẫu vừa phức tạp vừa có hàm lượng nhỏ như mẫu
huyết tương. Phương pháp chuẩn nội giúp khắc phục được những nhược điểm của

21
phương pháp chuẩn ngoại. Ngoài ra, nó còn giúp cực tiểu hóa được những sai số do
máy móc và kỹ thuật [11] [30].
Yêu cầu của chuẩn nội:
- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải được tách ra hoàn toàn và có
thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.
- Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử.
- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ của chất thử.
- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.
- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.
Tiến hành: Dựa vào công thức của methanol và ethanol, tham khảo các tài liệu
[20] và tính sẵn có của hóa chất, tiến hành chạy sắc ký của các chất chuẩn 2-
propanol, tert butanol, nội chuẩn đươc lựa chọn sử dụng là 2-propanol.
Chuẩn bị 2 lọ thủy tinh chứa mẫu đánh số 1, 2. Cho vào lọ 1: 100 µl dung dịch 2-
propanol 0,1% (v/v), lọ số 2: 100 µl dung dịch tert butanol 0,1% (v/v). Sau đó, cho
vào mỗi lọ 200 µl dung dịch NaCl bão hòa.
2.3.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp các
bằng chứng khách quan chứng minh rằng các phương pháp đó đáp ứng được các
yêu cầu đặt ra. Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh
giá chất lượng, độ tin cậy của các kết quả phân tích. Thẩm định phương pháp là một
phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả đáng tin cậy.
Quá trình phân tích các mẫu sinh học thường bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như
lượng mẫu ít, nồng độ các chất phân tích thường thấp, lẫn nhiều tap là các chất nội
sinh (các muối vô cơ, lipid, protein và các chất chuyển hóa) và sự khác nhau giữa
các cá thể, do vậy phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước khi áp
dụng vào mẫu phân tích để đảm bảo độ tin cậy [11].
Sự phù hợp hệ thống sắc ký khí [5], [15], [32], [13]

22
Đánh giá sự phù hợp hệ thống là một phần không thể thiếu trong phân tích sắc ký
khí hay sắc ký lỏng. Đánh giá sự phù hợp hệ thống để chứng minh rằng hệ thống
sắc ký hoạt động đúng theo mục đích sử dụng.
Các yếu tố tác động đến quá trình phân tích của hệ thống sắc ký khí [23]:
 Thành phần, lực liên kết ion, pH của pha động

 Lưu lượng, kích thước cột, nhiệt độ cột và áp lực cột

 Tính chất của pha tĩnh: kích thước hat, độ xốp, diện tích bề mặt

 Hiện tượng đảo pha, biến tính bề mặt pha tĩnh.

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một mẫu chuẩn (methanol-ethanol) vào hệ
thống sắc ký khí theo chương trình đã chọn. Tính phù hợp của hệ thống được thể
hiện qua độ lệch chuẩn tương đối của hai yếu tố thời gian lưu và diện tích pic.
Yêu cầu: Đạt yêu cầu khi RSD ≤ 2,00 %.
Tiến hành: khảo sát trên dung dịch chuẩn (methanol-ethanol) 0,2% (v/v). Chuẩn
bị 6 lọ chứa mẫu đánh số thứ tự từ 1 tới 6. Cho vào mỗi lọ 200 µl dung dịch NaCl
bão hòa và 200 µl dung dịch methanol và ethanol 0,2% (v/v), 100 µl dung dịch
chuẩn 2-propanol 0,1% (v/v). Tiến hành chạy sắc ký. Ghi lại thời gian lưu và diên
tích pic của các lần sắc ký.
Tính chọn lọc và đặc hiệu [13]
Tính chọn lọc: là khả năng phát hiện được các chất phân tích khi có mặt các tạp
chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất.... Cụ
thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh được kết quả là dương
tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải
là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích. Trong
phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu
khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác.
Tiến hành:
Phân tích các mẫu trắng: chuẩn bị 6 lọ chứa mẫu cho mỗi mẫu máu. Cho vào lần
lượt các lọ 200 µl dung dịch NaCl bão hòa và 200 µl máu cùng loại vào mỗi lọ. Phát
hiện mẫu máu trắng không cho tín hiệu phân tích của methanol và ethanol.

23
Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn: chuẩn bị 6 lọ chứa mẫu. Cho lần lượt vào các lọ
200 µl dung dịch NaCl bão hòa, 20 µl dung dịch chuẩn chứa methanol và ethanol
0,2% (v/v) và 180 µl máu không chứa methanol- ethanol đã phân tích ở trên, 100 µl
chuẩn nội 2-propanol 0,1% (v/v).
Phân tích mẫu máu trắng thêm chuẩn nội: chuẩn bị lọ chứa mẫu. Cho lần lượt vào
lọ 200 µl dung dịch NaCl bão hòa, 200 µl máu không nhiễm methanol- ethanol và
100 µl chuẩn nội 2-propanol 0,1% (v/v).
Chạy sắc ký và ghi lại sắc ký đồ của các mẫu.
Độ tuyến tính [13]
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự
phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.
Tiến hành: Chuẩn bị 6 lọ 20 ml chứa mẫu và đánh số thứ tự từ 1 tới 6. Cho lần
lượt vào các lọ từ 1 tới 6. Lọ số 1 và 2 lần lượt cho 20 µl và 50 µl dung dịch hỗn
hợp chứa methanol và ethanol 0,2% (v/v). Lọ số 3, số 4 và số 5 cho lần lượt các thể
tích 10 µl, 20 µl, 50 µl dung dịch hỗn hợp chứa methanol và ethanol 2% (v/v). Lọ
số 6 cho vào 40 µl dung dịch hỗn hợp chứa methanol và ethanol 3%. Sau đó, cho
vào 6 lọ lượng máu không nhiễm để được vừa đủ 200 µl mẫu. Tiếp theo, cho lần
lượt vào 6 lọ chứa mẫu trên 200µl NaCl bão hòa, 100 µl 2-propanol 0,1% (v/v).
Mẫu thu được từ 1 tới 6 có nồng độ methanol và ethanol trong máu lần lượt là
0,02%; 0,05 %; 0,1 %; 0,2 %; 0,5%; 0,6 % (v/v).

24
Tóm tắt sơ đồ chuẩn bị mẫu:
Chuẩn bị 6 lọ chứa mẫu đánh số từ 1
tới 6
Cho vào 6 lọ 200µl NaCl bão hòa,
100 µl 2-propanol 0,1 %.
Lọ số 1,2: 20 µl, 50
µl dung dich chứa
methanol và ethanol
0,2 %.
Lọ số 3,4,5: 10 µl, 20
µl, 50 µl dung dịch
chứa methanol và
ethanol 2%.
Lọ 6: 40 µl dung
dịch chứa methanol
và ethanol 3%.
Tiến hành chạy sắc ký 6 mẫu. Ghi lại giá trị diện tích pic của ethanol, methanol
và nội chuẩn. Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu methanol hoặc ethanol
chia cho nội chuẩn (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ methanol hoặc ethanol (trục
hoành x). Tính các hệ số hồi quy (a, b trong phương trình hồi quy y = ax + b) và hệ
số tương quan (R).
Yêu cầu: đường chuẩn phải có dạng đường thẳng và 0,995 ≤ R ≤ 1.

Độ đúng

Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung
bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng (μ)
[13].
Theo FDA, độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn (methanol-
ethanol) ở 3 nồng độ thấp, trung bình và cao vào mẫu máu trắng sao cho các nồng
độ này đều nằm trong khoảng tuyến tính. Ở mỗi nồng độ sẽ đo 5 lần. Chạy sắc ký,
dựa vào đường chuẩn để tính nồng độ chuẩn thêm vào. Độ đúng của phương pháp
được khảo sát bằng mẫu tự tạo có nồng độ chất phân tích đã biết [23].
Tiến hành: mẫu tự tạo có nồng độ methanol và ethanol lần lượt là 0,05% (v/v);
0,2% (v/v) và 0,4% (v/v). Chuẩn bị mẫu trắng thêm dung dịch (methanol- ethanol)
để thu được các mẫu có nồng độ 0,05%; 0,2% như chuẩn bị mẫu để xây dựng

25
đường chuẩn đã trình bày ở trên. Chuẩn bị mẫu tự tạo có nồng độ methanol và
ethanol 0,4% (v/v) như sau: cho vào lọ chứa mẫu 200 µl dung dịch NaCl bão hòa,
100 µl dung dịch 2-propanol 0,1% (v/v), 40 µl dung dịch methanol và ethanol 2%
(v/v) và 160 µl máu trắng. Chuẩn bị mỗi nồng độ 5 mẫu, đo 5 lần và tính giá trị
trung bình.
Yêu cầu: sai số cho phép là 15%, riêng tại giới hạn định lượng cho phép là 20%
(tính giá trị trung bình).

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)


Giới hạn phát hiện (LOD)

- Khái niệm: là nồng độ thấp nhất chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được
nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng).
-Cách xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Phân tích mẫu (mẫu thực,
mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của
chất phân tích. Số lần phân tích lặp lại 3 4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu
(S/N = Signal to noise ratio),
trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích,
N là nhiễu đường nền
-Tiến hành: chuẩn bị dung dịch chuẩn chứa methanol và ethanol ở nồng độ 0,02%.
Từ dung dịch chuẩn chứa methanol và ethanol 0,02% pha các mẫu chứa methanol
và ethanol trong máu trắng với nồng độ giảm dần 0,01%; 0,0025%; 0,0015%;
0,001%.
-Yêu cầu: LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3
lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N =3

Giới hạn định lượng (LOQ)

-Xác định LOQ: LOQ = 3,3 x LOD.
- Tiến hành: sau khi xác định LOD xác định LOQ=3,3 x LOD.

26
2.4. Áp dụng quy trình để phân tích mẫu thực tế
Mẫu thực tế là mẫu lấy từ các đối tượng nghi ngờ ngộ độc methanol và ethanol
được gửi tới Khoa Hóa pháp- Viện Pháp y Quốc gia và được tiến hành xác định
đồng thời ethanol và methanol theo quy trình đã khảo sát trước đó.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các công thức đã xây dựng hoặc các
hàm số trong phần mềm Microsoft Excel 2013.

Nồng độ ethanol trong mẫu máu

Cethanol(%) = 1− 1
× 1
1
Cethanol(mg/100ml)=
1− 1
× 1 × 1
1
Trong đó: S1 là tỉ lệ diện tích pic ethanol và nội chuẩn
a1, b1 là tham số trong phương trình hồi quy của ethanol
D1 là khối lượng riêng của ethanol (mg/ml)
A1 là hàm lượng tinh khiết của ethanol

Nồng độ methanol trong mẫu máu là:

Cmethanol (mg/100ml) = 2− 2
× 2
2
Cmethanol (mg/100ml) = 2− 2
× 2 × 2
2
Trong đó: S2 là tỉ lệ diện tích pic methanol và nội chuẩn
a2, b2 là tham số trong phương trình hồi quy của methanol
D2 là khối lượng riêng của methanol (mg/ml)
A2 là hàm lượng tinh khiết của methanol
Tiến hành thí nghiệm n lần, thu được các kết quả xi là x1, x2,…,xn. Khi đó:
 Trung bình các kết quả x =
1
∑ =1
 Độ lệch chuẩn S2 =
1
∑ ( − )2
−1 =1
 Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) =

27
Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng ethanol và methanol trong máu bằng
GC-headspace
3.1.1. Quy trình xác định đồng thời ethanol và methanol trong máu được thiết lập
như sau:
- Điều kiện sắc ký khí:
+ Cột HPB ALC 7,5 m × 0.320 mm x 20 µm
+ Khí mang Nitơ, tốc độ dòng 1 ml/phút.
+ Nhiệt độ đầu cột: 2500
C.
+ Detector FID nhiệt độ 2700
C.
+ Chương trình nhiệt độ: Bắt đầu 1200
C giữ 2 phút, tăng nhiệt 50
C/phút đến 1300
C
giữ 8 phút.
- Điều kiện kỹ thuật phân tích không gian hơi:
+ Nhiệt độ nung: 600
C, lắc nhẹ.
+ Thời gian nung 17 phút.
+ Thời gian tiêm mẫu 1 phút
3.1.2. Lựa chọn nội chuẩn
Tiến hành chạy sắc ký của tert butanol 0,1% (v/v), 2-propanol 0,1% (v/v) được sắc
ký đồ như hình 3.1 và 3.2.

28
Hình 3.1: Sắc ký đồ của tert butanol
Hình 3.2: Sắc ký đồ của 2-propanol
Nhận xét: pic sắc ký của tert butanol doãng chân, có lẫn nhiều pic lạ (do hàm lượng
tinh khiết thấp). Pic sắc ký của 2-propanol có tính cân xứng. Kết luận: 2-propanol
thích hợp để sử dụng làm nội chuẩn.

29
3.1.3. Khảo sát phổ của ethanol, methanol
Tiến hành khảo sát phổ của ethanol, methanol, 2-propanol chuẩn với nồng độ
0,2% (v/v) để lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để tiến hành định lượng thu được
kết quả như sau:
Hình 3.3: Sắc ký đồ của methanol
Hình 3.4: Sắc ký đồ của ethanol

30
Hình 3.5: Sắc ký đồ của 3 chất methanol, ethanol, 2-propanol
Nhận xét: Với chương trình sắc ký đã xây dựng, sắc ký đồ của methanol, ethanol
và 2- propanol có thời gian lưu khác nhau, các pic tách nhau ra hoàn toàn. Do vậy,
dựa vào thời gian lưu của methanol và ethanol có thể định tính sự có mặt của chúng
trong máu. Dựa vào diện tích pic thu được để định lương methanol và ethanol trong
máu.
3.2. Thầm định phương pháp
3.2.1. Tính phù hợp hệ thống
Độ phù hợp của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của
thời gian lưu và diện tích pic.

31
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với methanol và ethanol
Methanol Ethanol 2-propanol
Lần Thời gian Diện tích Thời gian Diện tích Thời Diện
lưu (phút) pic lưu (phút) pic gian lưu tích pic
1 1,331 92,9 2,792 209,8 5,140 99,4
2 1,330 93,5 2,792 210,8 5,145 98,5
3 1,328 91,7 2,791 208,9 5,136 99,3
4 1,329 92,0 2,786 209,9 5,134 100,0
5 1,329 91,5 2,787 206,6 5,132 98,9
6 1,330 94,6 2,793 206,9 5,125 97,7
Trung
1,330 92,700 2,789 208,817 5,135 98,967
bình
RSD(%) 0,07 1,18 0,09 0,78 0,12 0,81
Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy, 2 pic của methanol và ethanol có độ cân xứng
và tách nhau, độ lệch chuẩn tương đối RSD về thời gian lưu và diện tích pic của cả
methanol và ethanol, 2-propanol đều đáp ứng yêu cầu nhỏ hơn 2,00% ( RSD của
thời gian lưu của cả methanol và ethanol, 2-propanol đều nhỏ hơn 1%, diện tích pic
đều nhỏ hơn 2%) ở các lần tiêm khác nhau của cùng một nồng độ cho độ lặp lại tốt
(<2%).
Kết luận: Các thông số thực nghiệm thể hiện được sự phù hợp của hệ thống sắc
ký khí đã lựa chọn để phân tích các hợp chất nghiên cứu. Vì vậy, hệ thống sắc ký
khí ổn định, đảm bảo tính chính xác để phân tích các mẫu cho kết quả tin cậy.
3.2.2. Tính chọn lọc
Phân tích 6 mẫu máu trắng, 6 mẫu máu tự tạo chứa chuẩn methanol và ethanol
với nồng độ 0,02% (v/v), nội chuẩn 2- propanol và mẫu máu trắng chứa chuẩn nội
theo phương pháp đã xây dựng.
Tiến hành chạy sắc ký theo chương trình đã chọn, thu được sắc ký đồ như hình
dưới đây:

32
Hình 3.6: Sắc ký đồ của mẫu máu trắng
Hình 3.7: Sắc ký đồ của mẫu máu chứa methanol, ethanol và 2-propanol

33
Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu máu trắng chứa 2-propanol
Nhận xét:
- Sắc ký đồ của mẫu máu trắng khảo sát tại thời gian lưu tương ứng của methanol,
ethanol và 2-propanol không thấy xuất hiện pic.
- Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn chứa methanol, ethanol, 2-propanol có sự
xuất hiện các pic tại thời gian lưu là 1,331 phút, 2,828 phút và 5,158 phút tương ứng
với giá trị thời gian lưu của methanol, ethanol, 2-propanol chuẩn đã khảo sát.
Vậy phương pháp sắc ký khí vừa xây dựng có tính chọn lọc để định tính và định
lượng methanol và ethanol.
3.3. Đánh giá phương pháp
3.3.1. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
Khảo sát khoảng tuyến tính trên các mẫu máu thêm chuẩn có nồng độ từ 0,02% -
0,6% (v/v) theo quy trình đã xây dựng.
Tiến hành sắc ký, ghi lại diện tích pic của ethanol, methanol và 2-propanol, thiết
lâp phương trình hồi quy. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2, 3.3 và hình 3.9:

34
Bảng 3.2. Diện tích pic của methanol, ethanol và 2-propanol
Nồng độ (%) Diện tích pic của Diện tích pic của Diện tích pic của 2-
ethanol methanol propanol
0,02 21 8,8 101
0,05 50,4 24,4 102,4
0,1 98,3 43.4 100,2
0,2 206,6 90,1 103
0,5 529,4 226,3 102,7
0,6 613,3 268,1 100,9
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của ethanol và methanol trong máu
Nồng độ (%)
Tỷ lệ diện tích pic Tỷ lệ diện tích pic
Sethanol/S2-propanol Smethanol/S2-propanol
0,02 0,2079 0,0871
0,05 0,4922 0,2383
0,10 0,9810 0,4331
0,20 2,0058 0,8748
0,50 5,1548 2,2035
0,60 6,0784 2,6569
Phương trình hồi quy Y = 10,2297x – 0,0196 Y = 4,4157x +0,0004
Hệ số tương quan
R2
= 0,9998 R2
= 0,9999
R = 0,9999 R = 0,9999

35
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đáp ứng
với nồng độ của methanol và ethanol
Nhận xét: Kết quả thẩm định cho thấy trong khoảng nồng độ đã khảo sát từ
0,02% tới 0,6% (v/v) có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ methanol và ethanol
trong máu với tỉ lệ diện tích pic của methanol/2-propanol, ethanol/2-propanol với hệ
số tương quan xấp xỉ 1.
3.3.2. Độ đúng và độ chính xác
Độ đúng và độ chính xác được xác định trên 3 mẫu máu thêm chuẩn có nồng độ
methanol và ethanol là 0,05% (v/v); 0,2% (v/v) và 0,4% (v/v). Mỗi nồng độ tiến
hành thực nghiệm 5 lần. Xác định nồng độ methanol và ethanol trong mẫu máu
bằng phương pháp đường chuẩn và tính độ thu hồi bằng tỉ lệ phần trăm giữa lượng
mẫu xác định được so với lượng thêm vào. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng
3.4, 3.5 và 3.6

36
Bảng 3.4. Kết quả diện tích pic của methanol, ethanol và 2-propanol
Nồng độ methanol và ethanol trong mẫu máu trắng (%)
Lần 2-
0,05 0,2 0,4 propanol
Methanol Ethanol Methanol Ethanol Methanol Ethanol
1 22,8 50,6 88,2 214,0 184,0 436,0 100,2
2 22,7 49,6 86,5 199,0 175,0 417,0 100,0
3 21,5 49,7 87,5 203,3 175,5 416,0 100,4
4 22,0 49,0 90,0 216,4 180,4 426,0 100,2
5 21,8 49,6 85,8 202,3 175,0 419,0 100,4
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác của methanol
Lần
Nồng độ methanol trong mẫu máu trắng
0,05% 0,2% 0,4%
1 0,051 0,20 0,420
2 0,052 0,192 0,397
3 0,048 0,198 0,398
4 0,047 0,210 0,410
5 0,049 0,190 0,396
Trung bình (%) 0,0494 0,1980 0,4040
Tỉ lệ thu hồi (%) 98,80 99,00 101,00
RSD (%) 3,75 3,56 2,32

37
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác của ethanol
Lần
Nồng độ ethanol trong mẫu máu trắng
0,05% 0,2% 0,4%
1 0,052 0,21 0,425
2 0,051 0,190 0,397
3 0,048 0,199 0,395
4 0,047 0,212 0,415
5 0,048 0,198 0,398
Trung bình (%) 0,0492 0,2018 0,406
Tỉ lệ thu hồi (%) 98,40 100,90 101,50
RSD (%) 3,94 4,04 2,93
Nhận xét:
Độ lệch chuẩn tương đối ở cả 3 nồng độ của cả ethanol và methanol đều nhỏ hơn
5,0%. Như vậy, phương pháp có độ chính xác khá tốt.
Độ thu hồi trung bình của methanol trong khoảng 98,80%- 101,00%, của ethanol
trong khoảng 98,40- 110,50%.
Kết luận: Các kết quả này đáp ứng được yêu cầu về độ đúng và độ chính xác của
phương pháp phân tích đồng thời methanol và ethanol trong máu.
3.3.3. Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Chuẩn bị một dãy mẫu máu trắng nhiễm chứa methanol và ethanol với nồng độ
giảm dần, xử lý mẫu, chạy sắc ký theo chương trình đã xây dựng, đo tỷ số diện tích
giữa chiều cao pic và nhiễu đường nền. Tại nồng độ cho tín hiệu thỏa mãn giới hạn
phát hiện.
Kết quả thực nghiệm cho thấy: tại nồng độ methanol và ethanol là 0,0015% (v/v),
sắc ký đồ cho tín hiệu của methanol S/N=2,8 và tín hiệu của ethanol S/N=2,7. Vậy
giới hạn phát hiện của cả methanol và ethanol đều là 0,0015% (v/v), giới hạn định
lượng của cả methanol và ethanol là 3,3 x 0,0015= 0,005% (v/v).
Kết quả cho thấy độ nhạy phân tích cao, đáp ứng được yêu cầu phân tích đồng
thời methanol và ethanol trong máu.

38
3.4. Áp dụng quy trình phân tích một số mẫu máu thực tế
Sau khi khảo sát thu được kết quả phân tích đồng thời methanol và ethanol trong
mẫu máu trắng thêm chuẩn (methanol và ethanol) khả quan, dựa trên quy trình đã
xây dựng để tiến hành áp dụng vào một số mẫu thực. Các mẫu được gửi để xét
nghiệm tại khoa Hóa Pháp- Viện Pháp y Quốc gia.
Bảng 3.7: Kết quả giám định một số mẫu máu thực
S Nồng độ methanol Nồng độ ethanol
T Họ tên Tuổi Địa chỉ
% mg/100ml %
mg/100m
T l
1 C A M 70 Lai Châu 0,434 343,04 (-) (-)
2 C Ô X 56 Lai Châu 0,087 68,57 (-) (-)
3 M G G 19 Lai Châu (-) (-) (-) (-)
4 P A S 27 Lai Châu 0,456 360,61 (-) (-)
5 C A H 69 Lai Châu 0,307 242,73 (-) (-)
6
Nguyễn
27
Quảng
(-) (-) 0,404 318,90
V Ninh
7 Trần V T 31 Hà Nội 0,110 87,04 0,216 171,15
8
LươngV
40 Hà Nam (-) (-) 0,411 326,32
L
Trên thực nghiệm 8 mẫu máu nghi ngộ độc rượu được gửi về khoa Hóa pháp –
Viện Pháp y Quốc gia, có 4 mẫu dương tính với methanol, 2 mẫu dương tính với
ethanol, 1 mẫu dương tính với cả ethanol và methanol, 1 mẫu âm tính với cả
methanol và ethanol.

39
BÀN LUẬN
1. Về quy trình định lượng và thẩm định
Phương pháp GC- headspace là một trong các phương pháp được sử dụng phổ
biến trong phân tích các chất dễ bay hơi. Phương pháp có độ nhạy và độ chính xác
khá cao. Quy trình định lượng ở đây chủ yếu tham khảo theo tài liệu của Khoa Hóa
pháp- Viện Pháp y Quốc gia.
Theo tài liệu “Quy trình xác định đồng thời ethanol và methanol trong máu” của
Khoa Hóa pháp- Viện Pháp y Quốc gia, sử dụng tert butanol làm nội chuẩn cho pic
sắc ký doãng chân, thời gian lưu dài 8,851 làm quá trình phân tích kéo dài. Chất nội
chuẩn 2-propanol lựa chọn có thời gian lưu tách biệt hoàn toàn so với các chất phân
tích, thời gian lưu 5,095 phút, do vậy, có thể cho kết quả nhanh hơn so với lựa chọn
tert butanol. Như vậy, các kết quả phân tích cho thấy lựa chọn chuẩn nội là 2-
propanol cho kết quả khả quan.
Về thẩm định quy trình cho thấy rằng, quy trình có tính phù hợp hệ thống, tính
chọn lọc, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng và độ chính xác đạt yêu cầu. Giới hạn
phát hiện của cả ethanol và methanol là 0,0015%, giới hạn định lượng là 0,0045%.
Vì vậy, quy trình thích hợp để định tính và định lượng đồng thời methanol và
ethanol trong máu.
2. Về phân tích mẫu máu trong thực tế
Mẫu máu là loại mẫu hay được sử dụng cho hầu hết các xét nghiệm. Mặt khác,
đối với những bệnh nhân nhập viện do ngộ độc hoặc tai nạn do rượu bia thì việc lấy
mẫu máu là đơn giản hơn so với các mẫu không xâm lấn khác (nước tiểu). Trong
các nghiên cứu cho thấy có sự tương quan giữa mức độ ngộ độc và nồng độ
methanol và ethanol trong máu, vì vậy, lựa chọn mẫu máu được lựa chọn để tiến
hành phân tích trong đề tài này.
Trên thực nghiệm đã tiến hành xác định đồng thời methanol và ethanol trên 8
mẫu, kết quả cho thấy có 4 mẫu dương tính với methanol, 2 mẫu dương tính với
ethanol, 1 mẫu dương tính với cả methanol và ethanol, 1 mẫu âm tính với cả
methanol và ethanol. Đặc biệt, những mẫu máu dương tính với methanol và âm tính

40
với ethanol có nồng độ methanol trong máu ở mức rất cao, có nguy cơ tử vong nếu
không được cấp cứu kịp thời. Do vậy, những trường hợp bệnh nhân này có thể
khẳng định được nguyên nhân ngộ độc là do uống rượu giả được pha chế hoàn toàn
từ cồn công nghiệp. Vì vậy, kiểm soát nguồn gốc rượu để phát hiện các trường hợp
làm giả rượu có thể giảm thiểu nguy cơ ngộ độc rượu do methanol.

41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Sau khi hoàn thành đề tài này, chúng tôi đã thực hiện được các mục tiêu đề ra với
kết quả cụ thể như sau:
1.1. Xây dựng hoàn chỉnh phương pháp xác định đồng thời methanol và ethanol
trong máu
Quy trình như sau:
Xử lý mẫu
-Pha dung dịch methanol và ethanol 3%.
-Pha dung dịch chứa hỗn hợp methanol và ethanol có nồng độ 2% (v/v) làm chuẩn
gốc. Từ đó pha loãng để có được nồng độ 0,2% (v/v) và 0,02% (v/v).
-Thêm lần lượt 20 µl, 50 µl dung dịch chuẩn chứa methanol và ethanol 0,2% vào
mẫu máu không nhiễm để được vừa đủ 200 µl máu nhiễm có nồng độ lần lượt
0,02% và 0,05% (v/v).
-Thêm lần lượt 10 µl, 20 µl, 40 µl, 50 µl dung dịch chuẩn chứa methanol và ethanol
2% (v/v) vào mẫu máu không nhiễm để được vừa đủ 200 µl máu nhiễm với nồng độ
0,1%; 0,2%; 0,4% và 0,5% (v/v).
- Thêm 40 µl dung dịch hỗn hợp chứa methanol và ethanol 3% (v/v) vào mẫu máu
không nhiễm để được vừa đủ 200 µl máu nhiễm với nồng độ 0,6% (v/v).
Các mẫu đã chuẩn bị có nồng độ 0,02%; 0,05%; 0,1%; 0,2%; 0,5%; 0,6% được
thêm lần lượt 200 µl dung dịch NaCl bão hòa và 100 µl nội chuẩn 0,1% (v/v) (2-
propanol).
- Dung dịch chuẩn chứa hỗn hợp methanol và ethanol 0,02% (v/v) pha loãng bằng
máu không nhiễm được vừa đủ 200 µl máu nhiễm để có nồng độ phù hợp. Sau đó
thêm 200 µl dung dịch NaCl bão hòa vào các mẫu nhiễm vừa tạo và tiến hành chạy
sắc ký để xác định giới hạn phát hiện.
Sắc ký khí – headspace
Điều kiện sắc ký
+ Cột HPB ALC 7,5 m × 0.320 mm x 20 µm

42
+ Khí mang Nitơ, tốc độ dòng 1 ml/phút.
+ Nhiệt độ đầu cột: 2500
C.
+ Detector FID nhiệt độ 2700
C.
+ Chương trình nhiệt độ: Bắt đầu 1200
C giữ 2 phút, tăng nhiệt 50
C/phút đến 1300
C
giữ 8 phút.
- Điều kiện Headspace:
+ Nhiệt độ nung: 600
C, lắc nhẹ.
+ Thời gian nung 17 phút.
+ Thời gian tiêm mẫu 1 phút
1.2. Thẩm định quy trình và áp dụng mẫu thực
Đã thẩm định phương pháp đề ra với sự phù hợp hệ thống, độ đúng, độ chính
xác, độ tuyến tính phù hợp với yêu cầu, phương pháp có độ nhạy tốt với LOD là
0,0015%, LOQ là 0,005%.
Đã áp dụng để phân tích được 8 mẫu pháp y trong đó có 4 mẫu dương tính với
methanol, 2 mẫu dương tính với ethanol, 1 mẫu âm tính với cả ethanol và methanol,
1 mẫu dương tính với cả ethanol và methanol
2. Kiến nghị
-Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định methanol và ethanol trong máu
giám định pháp y.
-Một số mẫu máu gửi về viện Pháp y có pic 4,0 phút trong sắc ký đồ. Trong phạm vi
đề tài này, chúng tôi không tiến hành xác định hai chất này, cần có các nghiên cứu
tiếp theo để xác định chất này.

43
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bộ Khoa học và Công nghệ (2013), TCVN 7043:2013 Tiêu chuẩn Quốc gia
về rượu trắng, Hà Nội, pp.
2. Bộ Y tế ( 2013), Quy trình giám định nồng độ cồn trong máu, Hà Nội,
tr.274-275; 287-288.
3. Bộ Y tế (2015), Hướng dẫn chẩn đoán và xử trí Ngộ độc, Hà Nội, tr. 171-
176.
4. Bộ Y tế (2010), "Thông tư ban hành Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các
sản phẩm đồ uống có cồn".
5. Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV.
6. Khoa Hóa học (2013), Phương pháp SPME và ứng dụng (Solid Phase Micro
Extraction), Trường Đại học Bách khoa TPHCM.
7. Mai Văn Hiên (2017), Chuyển hóa rượu trong cơ thể, Trường Đại học Dược
Hà Nội.
8. Nguyễn Khánh (04/10/2016), "Gần 40% số vụ tai nạn giao thông liên quan
đến rượu bia", Báo VTV.
9. PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu (2015), Độc chất học, Nhà xuất bản Y học,
Trường đại học Dược Hà Nội, tr.77-84.
10. Thùy Linh (26/09/2016), "Việt Nam đứng hàng đầu khu vực và thế giới về
sử dụng rượu bia", Báo Lao động, tr.106-107.
11. Trần Tử An (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, Bộ y tế, Nhà xuất bản Y học,
12. Trương Minh Vũ (2014), Nghiên cứu xác định nồng độ cồn trong máu bằng
phương pháp sắc ký khí và so sánh với phương pháp phân tích sinh hóa,
Luận văn thạc sĩ hóa học, Trường Đại học Vinh.
13. Viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định
phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học
và Kỹ thuật Hà Nội, tr. 16-59.

44
14. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích tập 2- Phân tích dụng cụ, Trường đại học
Dược Hà Nội, Nhà xuất bản Y học, tr.146-160.
Tiếng Anh
15. Asean guidelines (2004), "The conduct of bioavailability and bioequivalence
studies".
16. B. Kolb, L.S. Ettre (2006), Static Headspace Gas Chromatography, Theory
and Practice, Wiley–VCH, Hoboken, New Jersey.
17. Cederbaum Arthur I. (2012), "ALCOHOL METABOLISM", Clinics in liver
disease, 16(4), pp. 667-685.
18. Fernandez Elizabeth (2017), "Pediatric Ethanol Toxicity", Medscape.
19. Flanagan R.J. et al (1995), Basic analytical toxicology, Wordl health
organization.
20. Fred Feyerherm et al (2014), "Quantitation and Confirmation of blood
ethanol content using a new GC/FID/MS blood alcohol analyzer", Agilent
Technologies.
21. Gang Tian Xiao-Qing Zhang, Ming-Song Zhu, Zhong Zhang, Zheng-Hu Shi
& Min Ding,, Quantification of ethanol in plasma by electrochemical
detection with an unmodified screen printed carbon electrode. 2016:
Scientific Reports.
22. H. Rachelle Wallage and James H. Watterson "Formic acid and methanol
concentrations in death investigations ", Journal of Analytical Toxicology,
32.
23. Health US Department of, Services Human (2001), "Guidance for industry,
bioanalytical method validation", http://www. fda. gov/cvm.
24. Kalyani Korabathina (2017), "Methanol Toxicity", Medscape.
25. Kruse JA (1992), "Methanol poisoning", Intensive care medicine, 18(7), pp.
391-397.
26. Organization World Health, Global NCD target reduce the harmful use of
alcohol. 2015.

45
27. Organization World Health (1997), "Methanol health and safety guide".
28. Pontes H et al (2014), "GC Determination of Acetone, Acetaldehyde,
Ethanol and Methanol in Biological Matrices and Cell Culture", Journal of
Chromatographic Science, 47.
29. Restek A (2000), "Technical Guide for Static Headspace Analysis Using
GC", Restek Corp, pp. 11-12.
30. Seda Kaya et al (2011), "Simultaneous Headspace-GC–FID Analysis for
Methanol and Ethanol in Blood, Saliva and Urine: Validation of Method and
Comparison of Specimens", LCGC Europe.
31. Skrzydlewska E. (2003), Toxicological and metabolic consequences of
methanol poisoning.
32. U.S. Department of Health and Human Services (2001), Guidance for
Industry Bioanalytical Method Validation.
33. Vukovic J, Modun D, et al. (2015), "Comparison of Breath and Blood
Alcohol Concentrations in a Controlled Drinking Study", Pubmed.
34. World Health Organization, Global Health Observatory (GHO) data.

46
PHỤ LỤC
SẮC KÝ ĐỒ XÁC ĐỊNH LOD VÀ SẮC KÝ ĐỒ CỦA MỘT SỐ MẪU CỤ
THỂ
Phụ lục 1. Sắc ký đồ của mẫu máu tự tạo chứa đồng thời methanol và ethanol ở
nồng độ 0,0015%

47
Phụ lục 2. Sắc ký đồ của mẫu máu Chang A M
Phụ lục 3. Sắc ký đồ của mẫu máu L V L

48
Phụ lục 4. Sắc ký đồ của mẫu máu M G G
Phụ lục 6. Sắc ký đồ của mẫu máu C A H

49
Phụ lục 6: Sắc ký đồ của T V T

Xây dựng đồng thời quy trình xác định đồng thời Methanol và Ethanol trong máu bằng GC - Headspace.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Xây dựng đồng thời quy trình xác định đồng thời Methanol và Ethanol trong máu bằng GC - Headspace.doc

Similar to Xây dựng đồng thời quy trình xác định đồng thời Methanol và Ethanol trong máu bằng GC - Headspace.doc (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (18)

Xây dựng đồng thời quy trình xác định đồng thời Methanol và Ethanol trong máu bằng GC - Headspace.doc