Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

Biotech 2011-10-methods

1,542 views

Published on

  • Be the first to comment

Biotech 2011-10-methods

  1. 1. Методы часть 2 СмирновАрсений Михайлович
  2. 2. ДНК – наиболее «освоенная»биологическая макромолекула
  3. 3. Основные вехи в развитии методов работы с ДНК1869 Мишер выделяет ДНК из белых клеток крови1944 Эвери доказывает, что ДНК является носителем генетической информации1953 Уотсон и Крик открывают структуру ДНК (двойная спираль)1955 Корнберг открывает ДНК-полимеразу1961 Мармур и Доти открывают ренатурацию ДНК1962 Арбер получает первые доказательства существования рестриктаз1966 Ниренберг, Холли и Корана расшифровывают генетический код1967 Геллерт открывает ДНК-лигазу1972 Прочтён первый ген – ген белка оболочки бактериофага MS21972-1973 Ряд лабораторий развивают технологию клонирования ДНК1975 Саузерн разрабатывает технологию переноса ДНК на фильтр с гибридизацией Сэнгер и Баррел, а также Максам и Гилберт разрабатываю технолигии1975-1977 секвенирования ДНК Пальмитер и Бринстер получают трансгенную мышь,1981-1982 Спрэдлинг и Рубин получают трансгенную дрозофилу1982 Основана база последовательностей ДНК - GenBank
  4. 4. Основные вехи в развитии методов работы с ДНК1985 Мюллис изобретает полимеразную цепную реакцию (ПЦР) Капеччи и Смитис разрабатываю технологию генных модификаций у мышей с1987 использованием эмбриональных стволовых клеток1989 Филдс и Сонг разрабатывают двугибридную систему дрожжей1990 Липман создаёт алгоритм поиска гомологичных последовательностей - BLAST1991 Худ и Хаикепиллер разрабатывают первый автоматический секвенатор1995 Секвенирован первый геном (бактерия Haemophilus influenzae)1996 Секвенирован геном дрожжей Saccharomyces cerevisiae1996-1997 Разработаны первые ДНК-микрочипы1997 Клонирована овечка Долли1998 Секвенирован геном червя Caenorhabditis elegans2001 Готов черновой вариант генома человека2003 Секвенирован геном человека2010 В лаборатории Вентера создана первая живая синтетическая клетка
  5. 5. Методики работы с ДНК1. Выделение2. Электрофорез3. Рестрикция4. Лигирование5. Гибридизация6. Полимеразная цепная реакция7. Секвенирование8. ДНК-микрочипы
  6. 6. Выход ДНК из разных источниковЦельная кровь (1 мл) 20-50 мкгЛейкоциты (из 1 мл цельной крови) 50-200 мкгСыворотка, плазма крови (0,5 мл) 0,3-3 мкгСухая кровь (пятно 0,5-1 см) 0,04-0,7 мкгСлюна (1 мл) 5-15 мкгБуккальный эпителий (1 мг) 1-10 мкгКости, зубы (500 мг) 30-50 мкгКосный мозг 100-500 мкгВолосяные фолликулы 0,1-0,2 мкгБактериальная культура (100 мл) 350-1000 мкг (плазмидной ДНК)
  7. 7. Этапы выделения ДНК/РНК1. Лизис клеток – SDS, гуанидин, лизоцим и т.д.2. Избавление от лишних примесей (белки, липиды и т.д.) – фенол, хлороформ, концентрированные соли3. Преципитация ДНК – осаждение (этанол, изопропанол) – преципитация на сорбент (glass milk, колонки)4. Растворение ДНК
  8. 8. Выделение ДНК
  9. 9. Выделение ДНК
  10. 10. Оценка качества и количества ДНК• Электрофорез• Спектрофотометрия• Флуорометрия спектрофотометрия элетрофорез С*µg/ml] = А260 x K K (dsDNA) = 50 K (ssDNA) = 37 K (ssRNA) = 40 А260 /А280 = 1,8-1,9 – чистая ДНК
  11. 11. Севенирование ДНК - прочтение последовательностиКлассические методы:• Максам-Гилберт (химическое)• Сэнгер (энзиматическое)
  12. 12. Библиотеки ДНК- большое число молекул векторной ДНК со встроенными фрагментами чужеродной ДНК
  13. 13. Секвенирование (Максам-Гилберт) Четыре группы химических реагентов, разрезающих молекулу ДНК перед нуклеотидами:• G• A или G• T или C• C
  14. 14. Секвенирование (Максам-Гилберт)
  15. 15. dNTP и ddNTP
  16. 16. Секвенирование (Сэнгер)
  17. 17. Сравнение секвенирования поМаксаму-Гилберту и по Сэнгеру
  18. 18. Автоматическое секвенирование
  19. 19. Поиск мутаций с помощью секвенирования
  20. 20. Анализ полиморфизмов
  21. 21. Полногеномное секвенирование1. Геном разбивается на небольшие перекрывающиеся фрагменты2. Фрагменты секвенируются3. Сиквенсы собираются в итоговую последовательность • картирование • перекрывание
  22. 22. Полногеномное секвенирование подход, основанный на картировании
  23. 23. Полногеномное секвенирование подход, основанный на перекрывании
  24. 24. Проект «Геном человека» 1990-2003 Джеймс Уотсон и Крейг Вентер – первые люди с индивидуальными прочитанными геномами
  25. 25. «Геном человека» Государственный проект vs. частная компания Международный консорциум Celera Genomics Метод Hierarchical shotgun Whole-genome shotgunПланируемые сроки 1990 – 2005 1998 – раньше гос. проектаПланируемый бюджет 3 млрд. $ 300 млн. $ Доступность Полностью доступны Полностью запатентованы результатов
  26. 26. «Геном человека»Государственный проект vs. частная компания
  27. 27. «Геном человека» 3 500 000 000 $1990 1995 2000 2003
  28. 28. Стоимость секвенирования одного генома1 000 000 000 $ 100 000 000 $ 10 000 000 $ 1 000 000 $ 100 000 $ 10 000 $ 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 “Sanger” “NGS”
  29. 29. tSMS (True Single Molecule Sequencing) Helicos
  30. 30. SMRT sequencing (Single-Molecule, Real-Time sequencing) Pacific Biosciences
  31. 31. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)– метод, позволяющий избирательно синтезировать большие количестваопределённых фрагментов ДНК• «Полимеразная» - используется фермент ДНК-полимераза• «Цепная» - состоит из повторяющихся циклов,количество ДНК с каждым циклом увеличивается вгеометрической прогрессии 1983 г, Кэри Муллис
  32. 32. Компоненты ПЦР Праймеры Определяют амплифицируемый участок dNTP «Строительный материал» Моновалентные катион необходим для оптимальной KCl гибридизации праймеровБуфер Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента Полимераза Осуществляет синтез ДНК Матрица Анализируемый образец ДНК
  33. 33. Этапы ПЦР Предварительная ~950C 1-10 мин денатурация Денатурация ~950C 10-60 сек25-50 циклов Отжиг 50-700C 10-60 сек Элонгация 68-720C 10-180 сек Финальная 68-720C 7-10 мин элонгация
  34. 34. Полимераза Полимераза Процессивность Активности Taq 5→3 полимеразная 3-5 т.п.н. (Thermus aquaticus) 5→3 экзонуклеазная 5→3 полимеразная Pfu 1-2 т.п.н. 5→3 экзонуклеазная (Pyrococcus furiosus) 3→5 экзонуклеазная 3-5 т.п.н. 5→3 полимеразная Tth (800 п.н. для 5→3 экзонуклеазная(Thermus thermophilus) ревертазной активности) 5→3 ревертазная Pwo 5→3 полимеразная 3 т.п.н. (Pyrococcus woesei) 3→5 экзонуклеазная 5`-3` полимеразная активность
  35. 35. Полимераза 3`-5` экзонуклеазная активность 5`-3` экзонуклеазная активность
  36. 36. Стадии ПЦР
  37. 37. АмплификаторыТермостатирование:• твёрдый термоблок (элемент Пельтье)• жидкость• поток воздуха
  38. 38. Клонирование ДНК и кДНК
  39. 39. ДНК-дактилоскопия
  40. 40. Сайт-специфический мутагенез
  41. 41. ПЦР для клонирования в вектор
  42. 42. Аллель-специфичная ПЦР- анализ точечных полиморфизмов
  43. 43. Асимметричная ПЦР- наработка одноцепочечного продукта
  44. 44. Инвертированная ПЦР- исследование фланкирующих областей
  45. 45. Вложенная ПЦР- уменьшение числа побочных продуктов реакции
  46. 46. ПЦР в реальном времени• одновременная амплификация и измерение количества продукта• наличие флюоресцентного красителя в смеси• наличие оптического блока в амплификаторе
  47. 47. Системы детекции1. Неспецифичные – интеркалирующие красители (SYBR Green и др.)2. Специфичные – линейные разрушаемые пробы (TaqMan) – «молекулярные маячки» (beacons) – примыкающие пробы
  48. 48. SYBR Green
  49. 49. Линейные разрушаемые пробы (TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
  50. 50. «Молекулярные маячки» (molecular beacons)
  51. 51. Примыкающие пробы
  52. 52. Флюорофоры и гасители флюоресценции
  53. 53. Представление результатов ПЦР в реальном временилинейный lg
  54. 54. Денатурация
  55. 55. Плавление после ПЦР обратная производная
  56. 56. Плавление после ПЦР
  57. 57. Количественная ПЦР• Подсчёт числа копий генов• Анализ представленности транскриптов• Оценка инфекционной нагрузки
  58. 58. Количественная ПЦР серия 10-кратных разведенийthreshold – пороговая флюоресценцияCt – пороговый цикл
  59. 59. Преимущества ПЦР в реальном времени:• Отсутствие этапа электрофореза• Снижение риска контаминации• Возможность контролировать амплификацию на каждом цикле• Количественная оценка исходной матрицы• Более высокая специфичность и чувствительность• Реактивы не намного дороже обычной ПЦРНедостатки ПЦР в реальном времени:• Трудности с мультиплексной ПЦР• Сложнее оптимизация• Высокая стоимость оборудования
  60. 60. Применение ПЦР1. Научные исследования – амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг, микрочипы) – амплификация ДНК для секвенирования – клонирование геномной ДНК, кДНК – филогенетическое сравнение геномов – генетическое картирование – анализ уровня транскрипции
  61. 61. Применение ПЦР2. Медицина – генетическое тестирование – типирование тканей (для трансплантации) – тестирование мутаций в онкогенах – диагностика инфекций3. Судебная медицина – ДНК-дактилоскопия – установление родства4. Анализ пищевых продуктов, детекция ГМО
  62. 62. Применение ПЦР Получение информации Получение материи • анализ уровня • клонирование ДНК транскрипции • мутагенез • ДНК-диагностика • секвенирование • генотипированиеЗалог успеха ПЦР• высокая процессивность• высокая чувствительность• высокая специфичность• низкая стоимость, быстрота
  63. 63. Гибридизация нуклеиновых кислот• Анализируемая ДНК• Зонд• Система детекции Southern blot → DNA-microarray
  64. 64. Микрочипы (microarrays)
  65. 65. Affymetrix GeneChip
  66. 66. Гибридизация на микрочипе1. Получение одноцепочечных меченных молекул ДНК исследуемого образца (ПЦР, ОТ-ПЦР)2. Гибридизация3. Отмывка несвязавшейся ДНК4. Считывание флюоресценции
  67. 67. Микрочип на 40000 проб
  68. 68. Применение микрочипов• Анализ экспрессии• Сравнительная гибридизация геномов• Идентификация организма• Анализ полиморфизмов• Иммунопреципитация хроматина на чипе• Анализ альтернативного сплайсинга• Анализ перестроек
  69. 69. Экспрессионный профиль
  70. 70. Сравнение экспрессии
  71. 71. Сравнение экспрессии
  72. 72. Сравнительная гибридизация геномов
  73. 73. Иммунопреципитация хроматина на чипе - для поиска участков связывания белков с ДНК
  74. 74. Химический синтез олигонуклеотидов
  75. 75. Спасибо за внимание!

×