Документ описывает основы метода секвенирования следующего поколения (NGS) на примере платформы Illumina, акцентируя его применение для высокоточного скрининга в онкологии, включая возможности обнаружения мутаций и глубокое секвенирование. Приведены сравнительные характеристики различных платформ NGS и их преимущества, такие как высокая точность и производительность. Также представлено множество NGS-панелей для исследования наследственных и соматических мутаций в различных типах рака.

1. Основы метода NGS на примере платформы
Illumina. Применение NGS для высокоточного
скрининга в онкологии
Н. Казачкова
Руководитель Молекулярно-генетического центра
Медицинской лаборатории CSD
1

2. 1. Секвенирование 1-го поколения (с. по Сангеру)
2. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
3. Секвенирование 3-го поколения (секвенирование единичной молекулы)
Oxford Nanopore
MinION
SeqStudio
2

3. Секвенирование 1-го поколения (с. по Сангеру)
3

4. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Общая схема NGS
4

5. Что такое NGS?
• NGS – метод массового параллельного определения последовательности нуклеотидов в ДНК
или РНК, обеспечивающий анализ совокупности генов и, при необходимости, всего генома (или
транскриптома).
1. Быстрый сиквенс целых генов → сохранение времени
на поиски мутаций
2. Обнаружение не только известных, но и новых
мутаций
3. Глубокое секвенирование таргетных регионов
4. Возможность секвенирования РНК → обнаружение
вариантов сплайсинга, количественный анализ
экспрессии генов
5. Возможность анализа эпигенетических факторов, н.,
метилирования ДНК во всем геноме.
6. Возможность секвенирования образцов опухолей для
изучения редких соматических вариантов, субклонов
опухоли и т.п.
5

6. Targeted NGS vs qPCR and Sanger sequencing
6

7. Targeted NGS vs qPCR and Sanger sequencing
qPCR
Sanger
sequencing NGS
Немелкоклеточный рак
легкого (НМРЛ)
Несколько
мутаций в EGFR:
н., p.L858R,
p.T790M
Часть гена EGFR
(десятки >
мутаций)
Все мутации/перестройки в
EGFR,
ALK, ROS1,BRAF, MET, RET,
ERBB2, HER, KRAS, etc.
7

8. Почему именно Illumina?
1. Illumina секвенаторы составляют 70% рынка секвенаторов и продуцируют более 90% всех
задокументированных данных
Basic features and performances of NGS platforms
NGS
platforms/company/
max output per run
Read
length per
run (bp)
No.
reads
per run
Time (h
or days)
Cost per
106
bases
, USD
Raw
error rate
(%)
Chemistry
HiSeq/Illumina/1500
Gb
2x150 5×109 27/240
h
0.1 0.8
Reversible
terminators
/fluorescently
labeled chain
termination
MiSeq/Illumina/15
Gb
2x300 3×108
27 h 0.13 0.8
Ion Proton/Life
Technologies/100 Gb
200 6×107
2–5 h 1 1.7
Proton
detection
Ion PGM/Life
Technologies/2 Gb
200 5×106
2–5 h 1 1.7
Next Generation Sequencing - Advances, Applications and Challenges, Edited by Jerzy K Kulski
2. Illumina - это высокая точность
секвенирования
3. Высокая производительность
4. Возможность двустороннего
секвенирования → увеличивается
точность
5. Лучшее соотношение
производительности/ цены
8

9. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Приготовление библиотеки
9

10. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Амплификация фрагментов/генерация кластеров
• Эмульсионная ПЦР/Ion Torrent
• Твердофазная генерация кластеров, н., метод ПЦР по
типу моста (Illumina) /SOLiD
• Генерация кластеров в растворе (ДНК
наношары/Пекинский ин-т биоинформатики)
10

11. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Амплификация фрагментов
Твердофазная генерация кластеров, н., метод ПЦР по типу моста/ (Illumina)
11

12. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Амплификация фрагментов
12

13. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Амплификация фрагментов
13

14. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Секвенирование амплифицированных фрагментов
• Секвенирование путем синтеза
• Флуоресцентная детекция/Illumina
• Детекция иона водорода/ Ion Torrent
• Детекция светового сигнала/454 Pyrosequencing (Roche)
• Секвенирование путем лигирования (SOLiD)
• Секвенирование путем гибридизации/метод ДНК чипов
(Affimetrix)
14

15. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Секвенирование путем синтеза/Illumina
15

16. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Секвенирование путем синтеза/Illumina
16

17. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Секвенирование путем синтеза/Illumina/Детекция сигнала
17

18. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Секвенирование путем синтеза/Illumina/Детекция сигнала
18

19. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Секвенирование путем синтеза/Illumina/Детекция сигнала
19

20. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Секвенирование путем синтеза/Illumina/Детекция сигнала
20

21. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Анализ данных
(IGV)
21

22. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Анализ данных/ Пример
22

23. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Анализ данных/ Пример
23

24. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Анализ данных/ Пример
24

25. Секвенирование второго/следующего поколения (NGS)
Анализ данных/ Пример
25

26. Секвенирование 3-го поколения (секвенирование
единичной молекулы)
26

27. Применение NGS для высокоточного
скрининга в онкологии
27

28. NGS панели CSD
Код Название услуги
M067 NGS-панель наследственных мутаций в генах BRCA1/2 (кровь, Illumina)
M068 NGS-панель мутаций в генах BRCA1/2 (гистологический материал, Illumina)
M069 NGS-панель для солидных опухолей (67 генов; Illumina)
M070 NGS-панель для рака легких и щитовидной железы (18&18, Illumina)
28

29. BRCA1/2 – гени, мутации в которых повышают риск развития наследственного РМЖ и РЯ.
M067 NGS-панель наследственных мутаций в генах BRCA1/2 (кровь, Illumina)
M068 NGS-панель мутаций в генах BRCA1/2 (гистологический материал, Illumina)
29

30. NGS-панель наследственных мутаций в генах BRCA1/2 (кровь,
Illumina) – M067
Исследуемый материал и условия транспортировки
Венозная кровь в пробирке с ЭДТА, при температуре +2+8°С
Преимущества исследования
• позволяет обнаруживать до 100% мутаций в hot-spot зонах генов BRCA1/2, даже не описанных
ранее;
• отчет по результатам исследования охватывает персонализированную программу скрининга для
носителей мутации, оценку генетических рисков для родственников, а также рекомендации по
профилактике у здоровых носителей
30

31. NGS-панель мутаций в генах BRCA1/2 (гистологический материал,
Illumina) - M068
Показания для назначения
• Пациентам с раком яичника, молочной и поджелудочной железы, предстательной железы у
мужчин
Зачем проводить диагностику генов BRCA1 и BRCA2 на гистологическом материале?
• Для определения чувствительности опухоли к препаратам платины и PARP-ингибиторов.
Исследуемый материал и условия транспортировки
Гистологический (парафиновые блоки, температура +2+25°С)
31

32. NGS-панель для солидных опухолей (67 генов; Illumina) - M069
Solid Tumor Panel – обширное исследование
генетического профиля опухолей солидного
строения
Показания для назначения
• назначается пациентам с любыми
солидными опухолями
• в целях персонализации терапии и
прогнозирования
32

33. Что исследуется?
Мутации (SNVs, CNVs, indels) в
67 генах, определяющих:
- биологическое поведение
опухоли
- чувствительность/
резистентность к терапии
NGS-панель для солидных опухолей (67 генов; Illumina) - M069
33

34. Возможность определения всех клинически значимых генетических нарушений
• Заболевания:
 рак легких EGFR, ALK, ROS1,BRAF, MET, RET, ERBB2, KRAS
 колоректальный рак BRAF, KRAS, NRAS, MLH1, APC, AKT1
 р. мочевого пузыря FGFR1, FGFR2, FGFR3, CDH1, PIC3R1, ERBB2, ERBB3
 р. поджелудочной железы KRAS, TP53, CDKN2A, SMAD4
 меланомы кожи BRAF, KIT, NRAS
 рак мозга EGFR, TERT, BRAF, CDKN2A, CTNNB1, MGMT, H3F3A, IDH1, IDH2, TP53
 GIST (гастроинтестинальные стромальные опухоли) KIT, PDGFRA, BRAF, FGFR1, FGFR2, FGFR3
 и др.
NGS-панель для солидных опухолей (67 генов; Illumina) - M069
34

35. NGS-панель для рака легких и щитовидной железы (18&18, Illumina) -
M070
Показания для назначения
• пациентам с немелкоклеточным раком
легких (НМРЛ)
• пациентам с раком щитовидной железы
и другими солидными опухолями
35

36. Что исследуется?
• Транслокации, слияние генов (gene fusions), альтернативный сплайсинг/ пропуск экзонов
(exon skipping) в 18 генах (ALK, AXL, BRAF, CCND1, EGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, MET,
NRG1, NTRK1, NTRK2, NTRK3, PPARG, RAF1, RET, ROS1, THADA), ассоциированных с
солидными опухолями
• Мутации (SNVs, CNVs, indels) в 18 генах (AKT1, ALK, BRAF, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2,
FGFR1, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, KRAS, MAP2K1, NRAS, PIK3CA, RET, ROS1)
NGS-панель для рака легких и щитовидной железы (18&18, Illumina) -
M070
36

37. Выводы
NGS – удобный и информативный инструмент анализа генетического
профиля опухолей и внедрения персонализированной медицины,
доступный в Украине
37