Schemi riassuntivi sulla replicazione del DNA

1. La replicazione del DNA
La replicazione del DNA è il processo biologico di produzione di due
repliche identiche di DNA partendo da una molecola di DNA originale.
Questo processo viene definito semiconservativo in quanto ogni filamento
della molecola parentale funziona da stampo per un nuovo filamento così che
le due molecole di DNA neoformate contengono un filamento vecchio e uno
neosintetizzato.
La replicazione si svolge in due fasi e richiede, oltre al DNA, la presenza di
altre molecole tra cui enzimi e nucleotidi. Nella prima fase, gli enzimi elicasi
e topoisomerasi spezzano i legami a idrogeno tra le coppie di basi appaiate e
despiralizzano la doppia elica del DNA così da far allontanare i due filamento
e permettere loro di fungere da stampo per la sintesi dei nuovi filamenti.
Nella seconda fase avviene la sintesi dei nuovi filamenti grazie all’enzima
DNA polimerasi che aggiunge i nucleotidi all’estremità 3’ dei filamenti in
formazione, scaldandoli tra loro mediante l’agami fosfodiesterici.
La formazione dei nuovi filamenti avviene grazie al principio della
completarietà tra le basi: se sul filamento stampo è presente un nucleotide
con la base azotata T, soltanto la base A potrà prendere il posto
corrispondente sul nuovo filamento. Grazie a questo principio di
corrispondenza univoca, alla fine del processo si ottengono due copie
identiche tra loro e identiche alla molecola originaria.
La replicazione ha inizio quando un
complesso proteico detto complesso di
replicazione si lega al DNA in
corrispondenza di una specifica sequenza
di basi chiamata ori o origine di
replicazione. A partire dall’origine della
replicazione, il DNA si replica in
entrambe le direzioni formando una bolla
di replicazione. A entrambe le estremità
della bolla, la molecola forma una
struttura a Y, detta forcella di replicazione.
La replicazione avviene in due direzioni opposte rispetto al punto di origine ed è per questo definita
bidirezionale. Quando viene completata la sintesi dei nuovi filamenti, le due catene a doppio filamento
si separano in due nuove coppie eliche costituite ciascuna da un filamento vecchio e un filamento
nuovo. Durante la sintesi, il DNA scorre attraverso il complesso di replicazione che invece rimane
ancorato a strutture nucleari. Nelle cellule eucariote che possiedono un’elevata quantità di DNA, su
ogni cromosoma lineare sono presenti più origini di replicazione. La replicazione avviene quindi mano
a mano che la bolla si propaga nelle due direzioni fino ad incontrare una bolla adiacente; quando tutte
le bolle si fondono tra loro, l’intero cromosoma sarà stato replicato. Il complesso di replicazione
contiene numerose proteine ed enzimi che intervengono in tutte le fasi del processo. Il primo evento
della replicazione ha luogo nel punto di origine della replicazione dove catalizzato dall’enzima DNA
elicasi, avviene la rottura dei legami a idrogeno e delle iterazioni idrofobiche che tengono uniti i due
filamenti. Non appena l’elicasi apre la doppia elica, i filamenti vengono despiralizzati dall’enzima
topoisomerasi mentre altre proteine dette single-strand binding proteins (SSB) si attacano ai filamenti
per tenerli separati. In questo modo si rende possibile la fase successiva, ovvero la sintetizzazione dei
due filamenti catalizzata da un gruppo di enzimi noti come DNA polimerasi.

2. Le DNA polimerasi sono enzimi molto grandi, dalla forma che ricorda una mano semiaperta: il
palmo contiene il sito attivo dell’enzima e avvicina i nucleotidi allo stampo, mentre le dita
riconoscono la forma delle diverse basi nucleotidiche. Tutte le DNA polimerasi sono capaci di
allunga una catena polinucleotidica preesistente aggiungendo un nucleotide alla volta
all’estremità 3’, ma non riescono ad iniziare una nuova catena.
Per questo motivo hanno bisogno di un innesco o primer complementare al DNA stampo e che
contenga un’estremità 3’ libera. Il primer è una breve sequenza di RNA sintetizzata dall’enzima
RNA primasi e che al termine della replicazione viene rimossa e sostituita dal DNA. La DNA
polimerasi lavora in una sola direzione 3’-5’ e di conseguenza la fase di allungamento procede in
modo diverso:
- Un filamento è detto veloce perché può allungarsi in maniera continua senza interruzioni in
quanto complementare al filamento stampo 3’-5’ e presenta l’estremità 3’ libera;
- Un filamento è detto lento perché procede in modo discontinuo e a ritroso, a partire dalla
forcella di replicazione e operando su segmenti piccoli di DNA detti frammenti di Okazaki.
Sul filamento veloce il primer di RNA è unico e si trova all’inizio della catena, sul filamento
lento, invece, i primer sono molteplici e si trovano di volta in volta in prossimità della forcella di
replicazione. Questo è dovuto al fatto che la DNA polimerasi non può catalizzare la sintesi dei
frammenti di Okazaki se non trova un punto di attacco sul filamento da replicare; a mano a mano
che la doppia elica si despiralizza, la DNA polimerasi sintetizza i frammenti muovendosi in
direzione 5’-3’ ovvero in direzione opposta rispetto la forcella. Dopo essere stati utilizzati i
primer sono eliminati e sostituiti con DNA definitivo e i vari frammenti di Okazaki sono legati
insieme dall’enzima DNA ligasi in modo da generare un filamento unico.
La replicazione del DNA avviene con un grado di precisione molto elevato grazie alla presenza di
diversi sistemi di controllo che agiscono durante la sintesi del nuovo filamento. Il primo
meccanismo è la selezione delle basi: le DNA polimerasi sono in grado di formare il legame
fosfodiesterico tra due nucleotidi solo se questi sono appaiati correttamente ai loro nucleotidi
complementari. La distinzione tra nucleotidi corretti e sbagliati avviene non solo in base ai legami
a idrogeno delle coppie (A e T doppio, G e C triplo), ma anche in base alla geometria delle coppie
di nucleotidi che se non accoppiate correttamente non riescono ad entrare nel sito attivo
dell’enzima. Il secondo meccanismo di controllo è basato sulla capacità della DNA polimerasi si
controllare ogni nucleotide dopo che è stato aggiunto. Se quindi è stato inserito un nucleotide non
corretto, l’enzima riposiziona il filamento di DNA in formazione, rimuove il nucleotide sbagliato
e incorpora al suo posto quello corretto attraverso un processo detto proofreading o correzione di
bozze.

3. La riparazione degli errori di appaiamento avviene
subito dopo che il DNA è stato replicato grazie al
sistema mismatch repair che ha il compito di trovare gli
appaiamenti scorretti sfuggiti alla proofreading,
identificare quale filamento è da riparare e infine
sostituire il nucleotide scorretto a opera della DNA
polimerasi e della DNA ligasi. Il sistema deve però poter
distinguere il filamento stampo (copia corretta) dal
filamento neosintetizzato (copia che contiene il
nucleotide errato). Questa distinzione è possibile perché
la cellula etichetta il DNA con gruppi metilici (-CH3);
appena dopo la replicazione, il filamento neoformato
non è ancora stato etichettato ed è quindi riconoscibile
dal sistema di riparazione. Le proteine di riparazione per
escissione agiscono invece sulle basi anomale o sui
dimeri di timina che si formano in seguito
all’esposizione a sostanze chimiche o ai raggi
ultravioletti. Il sistema spezza i legami fosfodiesterici ai
due lati della mutazione e rilascia i nucleotidi escissi; in
seguito la DNA polimerasi sintetizza il frammento
mancante che viene saldato al resto della catena dalla
DNA ligasi.
Preservare l’integrità della molecola di DNA è essenziale per le cellule in quando il DNA può essere
danneggiato per cause diverse, alcune spontanee e alcune indotte, ovvero determinate da fattori
ambientali. Vengono definite mutazioni i cambiamenti permanenti nella sequenza di basi del DNA
che possono essere trasmessi da una generazione cellulare all’altra. Le mutazioni spontanee
insorgono in seguito ad errori nel processo di replicazione mentre le mutazioni indotte sono dovute
ad agenti mutageni chimici o fisici. Tra gli agenti chimici ci sono l’acido nitrico (HNO2) che
converte la citosina in uracile e il benzopropene presente nel fumo della sigaretta che modifica
chimicamente la guanina impedendole di appaiarsi con la citosina. Tra gli agenti fisici ci sono
invece i raggi X che generano radicali liberi che alterano le basi nucleotidiche e danneggiano lo
scheletro zucchero-fosfato e i raggi ultravioletti che creano legami tra timine adiacenti generando
dimeri di timina provocando distorsioni nella struttura a doppia elica che non riesce più a replicarsi
o a svolgere le proprie funzioni. Per questo motivo nelle cellule sono attivi diversi sistemi di
riparazione che si affiancano ai meccanismi di controllo. La riparazione del DNA è possibile perché
al doppia elica è formata da due filamenti complementari e il DNA danneggiato su un filamento può
essere rimosso e sostituito utilizzando come stampo la catena complementare.

4. Il patrimonio genetico di una cellula procariotica è un cromosoma circolare costituito da una sola
molecola di DNA a doppio filamento. Se si considera il filamento di DNA svolto, questo supera di
gran lunga la lunghezza della cellula stessa nonostante sia in essa contenuta. Ciò è possibile perché
all’interno della cellula, il cromosoma è compattato a formare una struttura di forma irregolare detta
nucleoide in cui il DNA è associato a proteine. Il nucleoide non è delimitato da una membrana e si
trova a diretto contatto con il citoplasma. Oltre al DNA cromosomico, molti batteri possiedono altre
molecole circolari di DNA chiamate plasmidi che possono contenere fino a qualche centinaio di geni
e che possiedono anch’esse un punto di origine di replicazione permettendo così di replicarsi
autonomamente. I plasmidi possono sia replicarsi contemporaneamente al cromosoma, sia replicarsi
con frequenza maggiore e quindi avere più copie all’interno della stessa cellula.
Il genoma eucariotico, invece, presenta notevoli differenze rispetto quello procariotico. Il genoma
degli eucarioti è più grande di quello dei procarioti ed è suddiviso in numerosi cromosomi lineari. La
maggiori parte degli eucarioti è, difatti costituita da organismi pluricellulari formati da cellule
altamente specializzate a svolgere diverse attività e tale complessità necessità di un gran numero di
proteine diverse, tutte codificate dal DNA. Nel genoma eucariotico sono presenti molte sequenze
ripetute, ovvero sequenze di nucleotidi presenti in più di una copia. La maggior parte di queste
sequenze non contiene informazioni per la sintesi di proteine, ma può avere funzioni regolatrici in
quanto il sistema eucariotico è soggetto a una regolazione molto più complessa proprio per la
maggiore complessità rispetto a quello procariotico.
I primi studi condotti sul DNA delle cellule eucariotiche hanno rivelato che:
- Ogni cellula di un organismo della stessa specie contiene la stessa quantità di DNA, ma tra specie
diverse ci possono essere differenze molto marcate. Una quantità maggiore di DNA non corrisponde a
un aumento del numero di geni;
- In tutte le cellule eucariotiche esiste una grandissima quantità di DNA le cui funzioni sono ancora
poco conosciute. Nelle cellule umane, solo l’1,5% del genoma contiene informazioni per la sintesi di
proteine; il resto del DNA presenta diversi tipi di sequenze ripetute che hanno un ruolo strutturale o
che addirittura sembra non svolgano alcuna funzione.
Negli eucarioti, gran parte del DNA che non codifica proteine è costituito da sequenze ripetute che
possono essere di tre tipi:
- Le ripetizioni brevi in tandem (STRs) sono sequenze lunghe da 1 a 5 coppie di basi che si ripetono
fino a 100 volte; sono molto diffuse in tutti i cromosomi e costituiscono il cosiddetto DNA
microsatellite. Queste presentano una grande variabilità e per questo sono usate per creare un profilo
del DNA con lo scopo di distinguere ogni individuo da un altro;
- Le sequenze moderatamente ripetute sono presenti da 10 a 1000 volte nei genomi eucariotici e
alcune di esse codificano per gli RNA utilizzati nella sintesi proteica. Una grande parte di esse non è
contenuta in modo stabile nel DNA, ma può muoversi in vari punti del genoma e per questo prendono
il nome di elementi trasponibili o trasposoni;
- Le sequenze altamente ripetute, lunghe circa 100 paia di basi, sono le più numerose e possono
comparire anche in milioni di copie in tutto il genoma infatti nell’uomo costituiscono il 10% del
DNA.

5. Quando la cellula eucariotica si trova nell’interfase del ciclo cellulare, il suo materiale genetico si trova
sotto forma di cromatina, una sostanza intensamente colorata e uniformemente dispersa all’interno del
nucleo e costituita da fibre formate di proteine, DNA e da un piccola quantità di RNA. Le proteine più
abbondanti sono gli istoni che costituiscono la parte strutturale della cromatina e che hanno il ruolo di
condensare e impacchettare il DNA. Gli istoni sono proteine ricche degli amminoacidi arginina e lisina
e per questo interagiscono facilmente con il DNA che è carico negativamente a causa della presenza dei
gruppi fosfato. Esistono cinque tipi di istoni (H1, H2A, H2B, H3 e H4) presenti in grandi quantità
all’interno dei nuclei delle cellule. Gli istoni H3 e H4 presentano una sequenza di amminoacidi identica
in tutti gli eucarioti, mentre gli altri variano a seconda della specie. Altre proteine che sono associate
alla cromatina sono gli enzimi impegnati nella sintesi del DNA e dell’RNA e le proteine regolatrici che,
a differenza degli istoni, variano molto da un tipo di cellula all’altro. Esistono due tipi di cromatina:
Il nucleo delle cellule umane, seppur ha un diametro di soli 5 µm, contiene al suo interno quasi 2 metri
di DNA. Questo è possibile perché il DNA è compattato in modo da occupare il minor spazio possibile.
La compattazione o spiralizzazione del DNA è raggiunta per mezzo di un ripiegamento ordinato che
avviene su più livelli e che raggiunge il massimo grado subito prima della meiosi e della mitosi, quando
la cromatina si addensa a formare i cromosomi.
Il primo livello di spiralizzazione corrisponde all’avvolgimento del DNA attorno agli istoni. Le unita
strutturali costituite dal DNA e dagli istoni, che costituiscono le unità organizzative di base della
cromatina, prendono il nome di nucleosomi. I nucleosomi appaiono come granuli collegati tra loro
attraverso sequenze di DNA. Ogni nucleosoma è formato da otto istoni, due coppie dei tipi H2A, H2B,
H3 e H4, e da un tratto di DNA lungo 200 paia di basi: 146 paia di basi sono avvolte attorno agli istoni
e le restanti 54 servono da collegamento tra un nucleosoma e l’altro. A questo collegamento è poi legato
un istone di tipo H1. Il legame del DNA agli istoni del nucleosoma non è casuale, ma avviene in
corrispondenza di sequenze specifiche ricche di appaiamenti A=T. l’avvolgimento attorno agli istoni
rende il DNA sette volte più compatto. Infine, grazie alla presenza di una rete filamentosa di proteine,
questa fibra si compatta ulteriormente formando una serie di anse dette domini ad ansa che a loro volta
si spiralizzano per dare origine ai cromosomi.
- L’eucromatina, pari all’80%, appare più dispersa e si
colora debolmente in quanto rappresenta la parte attiva del
DNA, ovvero la parte in cui si trovano i geni che vengono
letti per guidare la sintesi delle proteine;
- L’etercromatina, più condensata, si colora più
intensamente ed è associata a strutture come centromeri e
telomeri, ovvero la parte dove non sono presenti geni attivi.
Nei batteri la replicazione si arresta quando le due forcelle di replicazione si incontrano e si fondono.
Nei cromosomi lineari eucariotici la situazione è diversa in quanto se si considera il filamento lento,
quando viene rimosso dall’estremità del cromosoma il primer terminale, questo non può essere sostituito
da DNA perché non c’è alcuna estremità 3’ da prolungare. Di conseguenza ogni nuovo cromosoma
presenta a ciascuna estremità un breve tratto di DNA a filamento singolo. Questa situazione attiva gli
enzimi che tagliano via il tratto a filamento singolo insieme ad un po’ del DNA a filamento doppio. Ad
ogni divisione cellulare, il cromosoma eucariotico diventa leggermente più corto. Per impedire sia
l’accorciamento, sia la saldatura, le estremità dei cromosomi eucariotici presentano lunghi tratti di DNA
chiamati telomeri che sono costituiti da sequenze ripetute. Nei vertebrati, i telomeri sono costituiti da
sequenze ripetute di tipo TTAGGG alle quali si legano speciali proteine che proteggono l’integrità di
queste sequenze. A ogni divisione cellulare, un cromosoma perde da 50 a 200 coppie di basi di DNA
telomerico; dopo 20-30 divisioni, le estremità sono diventate troppo corte per mantenere la loro funzione
protettiva per cui la cellula va incontro ad apoptosi e muore. Alcune cellule, come le cellule staminali e i
progenitori dei gameti, sono in grado di mantenere intatto il proprio DNA telomerico grazie alla
presenza di un enzima, la telomerasi che è capace di aggiungere i telomeri all’estremità dei cromosomi,
utilizzando come stampo una sequenza di RNA contenuta al proprio interno.