Лекція 9

1. 1
ТЕХНОЛОГІЇ МІКРОБНОГО
СИНТЕЗУ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ

2. ЗМІСТОВИЙ МОДУЛЬ 2. «Технології
отримання ферментних препаратів»
Тема 1. Основні поняття ензимології
Історія відкриття ферментів. Властивості
ферментів як біологічних каталізаторів.
Класифікація ферментів, найменування та
номенклатура ферментних препаратів.
Джерела отримання ферментних
препаратів.
2

3. Фермент – від лат. fermentum – закваска; ензим
– від грец. ен – усередині, зиме – закваска —
білкові молекули або їхні комплекси, що
прискорюють хімічні реакції в живих організмах.
Ферменти каталізують реакції розщеплювання
(катаболізм) і синтезу (анаболізм) складних
молекул, зокрема, синтез та деградацію ДНК,
РНК, білків, ліпідів та цукрів. У кожній клітині
містяться сотні різних ферментів. За їхньою
допомогою здійснюється багато хімічних
реакцій, які відбуваються з великою швидкістю
при оптимальних для даного організму
температурах, тобто в межах від 5 до 40°С.
3

4. Ферменти – це білки, які зазвичай складаються з
сотень амінокислот, але лише незначна їх
частина взаємодіє з субстратом, і ще менша
кількість – в середньому 3 – 4 амінокислоти в
одній молекулі білка, часто розташовані далеко
одна від одної в первинній амінокислотній
послідовності, – безпосередньо беруть участь в
каталізі. Частина ферменту, яка з'єднується із
субстратом, називається активним центром
ферменту. Наука про ферменти отримала
назву ензимологія, а не ферментологія (щоб не
змішувати слова з латинськими та грецькими
коріннями).
4

5. Історія відкриття ферментів
Наприкінці ХVIII — початку XIX ст. вже був
відомим факт, що м’ясо перетравлюється
шлунковим секретом, а крохмаль перетворює-
ться на цукор під дією слини.
• 1814 рік - російський хімік член Петербур-зької
Академії Наук К.С. Кіргоф відкрив фермента-
тивну дію водних витяжок з пророслого ячме-
ню, які здатні розщеплювати крохмаль до
цукру.
• 1833 рік французькими хіміками А.Пайеном і
Ж.Ф.Персо шляхом осадження спиртом вперше
було виділено із солоду препарат ферменту
амілази у порошковому стані. 5

6. • 1856 рік - розпочаті відомі роботи Луї
Пастера, присвячені природі бродіння. Пастер
розвивав теорію, що бродіння може бути
спричинене лише живими мікроорганізмами і є
невід’ємною частиною їх життєдіяльності.
• 1897 рік- через два роки після смерті Л.Пасте-
ра, Едуард Бюхнер виділив безклітинний
дріжджовий фермент (названий зимазою), що
спричинював спиртове бродіння так само, як і
незруйновані клітини дріжджів. Тим самим було
покладено кінець суперечці – чим викликаний
процес бродіння – живими культурами м/о чи
ферментами. У 1907 році за цю роботу Е.
Бюхнер отримав Нобелівську премію. 6

7. На початку ХХ століття було закладено
основи кінетики дії ферментів. У 1902 році
англійський хімік А. Броун запропонував
гіпотезу, згідно з якою фермент для того, щоб
подіяти на субстрат, повинен утворювати з ним
фермент-субстратний комплекс. У 1913 році Л.
Міхаеліс та М. Ментен підтвердили і розвинули
це припущення створивши сучасну теорію
ферментативного каталізу.
7

8. Властивості ферментів як біологічних
каталізаторів
Ферменти, як каталізатори, мають ряд
загальних з небіологічними каталізаторами
властивостей:
• Вони не входять до складу кінцевих продуктів
реакції і виходять з неї, як правило, в первин-
ному вигляді, тобто вони не витрачаються в
процесі каталізу (в даний час доведено, що
деякі ферменти в кінці хімічної реакції під-
даються модифікації і навіть розпаду, а не
звільняються в незмінному вигляді, як
постулював Л. Міхаєліс).
8

9. 2. Ферменти не можуть каталізувати ті реакції,
протікання яких суперечить законам
термодинаміки, вони прискорюють тільки ті
реакції, які можуть протікати і без них.
3. Ферменти не зміщують положення рівноваги, а
лише прискорюють його досягнення.
Специфічною властивістю ферментів є вузька
вибірковість дії на субстрати. клітинах.
Залежно від механізму дії розрізняють ферменти
з відносною (або груповою) специфічністю і
абсолютною специфічністю.
9

10. Відносною специфічністю, наприклад,
характеризуються деякі внутріклітинні
ферменти, наприклад гексокіназа, що каталізує
у присутності АТФ фосфорилювання майже
всіх гексоз, хоча одночасно в клітках є
специфічні для кожної гексози ферменти, що
виконують таке ж фосфорилювання.
Абсолютною специфічністю дії називають
здатність ферменту каталізувати перетворення
тільки одного субстрату. Будь-які модифікації в
структурі субстрату роблять його недоступними
для дії ферменту.
10

11. Відомо, що швидкість хімічних реакцій залежить
від температури, ферменти також чутливі до
змін температури. Термолабільність, або
чутливість до підвищення температури, є
однією з характерних властивостей ферментів,
що різко відрізняє їх від неорганічних каталі-
заторів, при 100°С майже всі ферменти
втрачають свою активність.
На термолабільність ферментів певний вплив
має концентрація субстрату, рН середовища
і інші чинники.
11

12. По відношенню до температури всі ферменти
поділяють на:
1) термотолерантні (термофільні) – активні
при температурі 55–75○
С, як правило, їх
продукують термостійкі мікроорганізми.
2) мезофільні – оптимум температури для
активності ферментів 25–37○
С.
3) психрофільні – активні при температурі до
15○
С, продукуються психрофільними
мікроорганізмами.
12

13. Залежність активності ферментів від рН
середовища - ферменти зазвичай найбільш
активні в межах вузької зони концентрації вод-
невих іонів, яка лежить в межах фізіоло-гічних
значень. Вплив змін рН середовища на моле-
кули ферменту полягає в дії на стан і ступінь
іонізації кислотних і основних груп (СООН – гру-
пи дикарбонових амінокислот, SH-групи цистеї-
ну, імідазольного азоту гістидіна і ін.). При різ-
них значеннях рН середовища актив-ний центр
може знаходитися в частково іонізованій або в
неіонізованій формі, що позначається на тре-
тинній структурі білка і відповідному формуван-
ні активного фермент-субстратного комплексу.
13

14. За типом біосинтезу ферменти можуть бути:
1) конститутивні – присутні завжди у клітині,
конститутивні ферменти забезпечують
стабільність метаболізму клітини;
2) індуцибельні – утворюються як відгук на
наявність у поживному середовищі певної
речовини – індуктора і не утворюються при
його відсутності (як правило, це усі гідролітичні
ферменти). Наприклад, при біосинтезі
амілолітичних ферментів індуктором біосинтезу
є крохмаль, а репресором – глюкоза.
За місцем дії ферменти бувають внутрішньо і
зовнішньо клітинні.
14

15. Класифікація ферментів, найменування та
номенклатура ферментних препаратів
За типом реакції, що каталізується, ферменти
розподілені на шість класів згідно ієрархічної
класифікації ферментів (КФ, ЕС – Enzyme
Comission code). Кожен клас містить підкласи,
так що кожен фермент описується сукупністю
чотирьох чисел розділених крапками.
• КФ 1: Оксидоредуктази – ферменти, що
каталізують реакції окислення і відновлення.
Наприклад: каталаза, алкогольдегідрогеназа.
15

16. • КФ 2: Трансферази – каталізують перенос
хімічних груп з однієї молекули до іншої.
Наприклад кінази, що переносять фосфатну
групу, як правило, з молекули АТФ.
• КФ 3: Гідролази, що каталізують гідроліз
хімічних сполук. Наприклад: естерази, трипсин,
амілаза.
• КФ 4: Ліази – каталізують розриви хімічних
зв’язків без гідролізу з утворенням подвійних
зв’язків.
• КФ 5: Ізомерази – каталізують структурні зміни
в молекулі субстрату.
16

17. • КФ 6: Лігази – каталізують утворення хімічних
зв’язків між субстратами за рахунок гідролізу АТФ.
Наприклад: ДНК-полімераза.
Класифікаційна система АТСС
Для фармацевтичних ферментних препаратів окрім
загальної класифікації (клас, підклас, підпідклас,
номер в списку), прийнятої в 1961 Міжнародним
біохімічним союзом, використовується міжнародна
класифікаційна система Anatomic therapeutic
chemical classification (АТСС).
17

18. Найменування ферментів
• Ферменти називають за типом реакції, яку
вони каталізують, додаючи суфікс -аза до
назви субстрату (наприклад, лактаза –
фермент, що приймає участь у перетворенні
лактози або за локалізацією в клітині
(мембранна АТФаза). Номенклатура
ферментних препаратів – система, яка
дозволяє враховувати походження препарату
та технологічний спосіб його отримання.
18

19. Основою такої номенклатури є назва
ферментного препарату, яка складається з
назви ферменту та видової назви продуцента і
закінчується суфіксом «ін», наприклад,
амілосубтилін – амілаза, продуцентом якої є
Bacilus subtilis, пектофоетидін – пектиназа,
продуцент Aspergilus foetidus.
Далі літерами позначають спосіб
культивуван-ня продуцента: Г– глибинне
культивування, П – поверхневе культивування.
Після цих літер вказують цифру, яка
характеризує ступінь очищення препарату,
неочищений препарат має позначення – х.
19

20. Індекси у номенклатурі ферментних
препаратів:
П2х і Г2х – рідкий концентрат вихідної культури,
вивільнений від нерозчинної частини. Для
поверхневої культури – це концентрат з
вмістом сухих речовин 50%; для глибинної
культури – не більше 40%;
ПЗх і ГЗх – сухі ферментні препарати, отримані
висушуванням шляхом розпилення екстракту з
поверхневої культури або фільтрату
культуральної рідини у разі глибинного
культивування;
20

21. П10х і Г10х – сухі ферментні препарати,
отримані осадженням ферментів з водних
розчинів органічними розчинниками або
методом висолювання;
П20х і Г20х – препарати очищених ферментів, в
технології яких використані різноманітні методи
очищення і фракціонування ферментів;
П25х і Г25х – високоочищені, але не кристалічні
ферментні препарати, що містять до 20 – 25%
баластних речовин.
21

22. У харчовій промисловості використовують
ферментні препарати зі ступенем очищення не
нижче 10х.
Для отримання фармацевтичних препаратів
– використовують в якості субстанції ферментні
препарати з ступенем очищення 10х і вище.
22

23. Джерела отримання ферментних препаратів
Виділяють такі основні джерела одержання
ферментів: рослини, органи та тканини
тварин, мікроорганізми. Для виділення
необхідного ферменту використовують ті
природні об’єкти, у яких вміст його становить
не менше 1%.
Рослини як джерело ферментів. В тропічних і
субтропічних країнах в якості джерела
ферментів протеолітичної дії використовують
динне дерево (папаїн), листя інжиру (фіцин),
сік зеленої маси ананасу (бромелаїн).
23

24. Органи та тканини тварин як джерело
ферментів
Для отримання ферментів використовують
органи травлення великої рогатої худоби,
свиней: підшлункову залозу, оболонку тонких
кишок, шлунків, сечовик і т.д. Підшлункова
залоза містить велику кількість ферментів –
хімотрипсин, колагеназу, еластазу, трипсин,
амілазу, ліпазу. Із сичугів молочних телят
одержують ренін.
24

25. Мікроорганізми як джерело ферментів
В спеціально створених умовах м/о здатні
утворювати велику кількість різноманітних
ферментів. У виробництві ферментних
препаратів використовують як мікроскопічні
гриби, так і бактерії, і дріжджі. М/о можуть
синтезувати одночасно цілий комплекс
ферментів або один фермент у великій
кількості. Для синтезу ферментів м/о
використовують, як правило, відходи інших
виробництв, що робить їх вартість низькою.
25

26. До мікроорганізмів-продуцентів ферментів
висувають певні вимоги:
• Висока активність штамів по цільовому
продукту;
• Фагостійкість і загальна стійкість щодо
спонтанної дисоціації;
• Стійкість штаму до температури, рН,
несприятливих умов;
• Відсутність токсичних речовин, як побічних
продуктів культивування
26

27. Деякі штами-продуценти, що зберігаються в
Українській колекції мікроорганізмів
27
Фермент Назва таксону і номер штаму
α-галактозидаза Cladosporium cladosporioides F-
16038
Penicillium canescens F-16073
Глюкозоізомераза Streptomyces chromogenes Ac-2024
Streptomyces cyanogenus Ac-2062
Фібринолітичні ферменти Streptomyces griseus Ac-2040
Streptomyces ignobilis Ac-2086
Каталаза Penicillium canescens F-6601
Penicillium verruculosum F-4962
Уреаза Bacillus pasteurii B-5890

28. 28
Далі буде!