4. REAKSI KIMIA ASAM AMINO
Gugus karboksil dan gugus amino asam amino
memperlihatakan semua reaksi yg diharapkan
dari fungsi-fungsi ini dlm pembentukan garam,
pengesteran dan asilasi.
Reaksi Warna :
*NINHIDRIN
Suatu zat pengoksidasi yg sangat kuat,
menyebabkan dekarboksilasi oksidatif asam
amino-alfa, menghasilkan CO2, NH3 dan suatu
aldehid dengan satu atom karbon kurang dari
a.a.induknya.
5. O
R – CH – COOH [R – CH – COOH] R – CH – COOH PANAS R – C – H
| 3 4 CO2 5
1
NH2 NH O
+ H2O
O O
O H H
OH N HO
OH
+
H HO
OH H
6 2
2 O O
O
3H2O
O
O O
O-NH4+ NH3
N N
H 7
2 O
8 O
O O
6. MEKANISME Rx.NINHIDRIN O
O
OH
O + H2O
OH R
|
O O
NINHIDRIN H3N – C – H
|
O- H3O+ O COO-
H H
| |
N=C N – C – COO-
ALDIMINE | |
H R CO2 R (schiff base)
H2O O O
|
O=C KETIMINE
O- | NINHIDRIN
R
NH2 O- O
AMINE
NINHIDRIN O INTERMEDIATE N
O NH3 O
OH O O
| RUHEMAN’S PURPLE
|
OH
O O HIDRINDANTIN
7. 1. Asam amino 2.Ninhidrin 3.Asam α-imino
4. Asam α-keto 5.Aldehid 6. Ninhidrin tereduksi
7. Zat antara kompleks 8. kompleks warna
(Ruhman’s purple)
Kompleks warna ini menyerap cahaya dgn λ = 570 nm.
Intensitas warna dasar untuk test kuantitatif
Amina-amina bukan a.amino alfa, juga bereaksi dgn
ninhidrin, membentuk warna biru ungu tetapi tanpa
mengeluarkan CO2. Prolin dan hidroksi prolin dgn
ninhidrin warna kuning.
8. ASAM AMINO YG NAMA REAKSI REAGEN WARNA
DITEMUKAN
ARGININ SAKAGUCHI α-naftol & Na hipoklorit merah
SISTEIN NITROPRUSID Na.nitroprusid dl NH4OHcons merah
SISTEIN SULIVAN Na.1,2.naftoquinon-4-sulfo- merah
nat dan NaHSO3
HISTIDIN,TIROSIN PAULY As.diazosulfanilat dl lrt.Alkali merah
TRIPTOFAN ASAM GLIOKSILAT As.glioksilat dl 36N H2SO4 ungu
(HOPKINS-COLE)
TRIPTOFAN EHRLICH p-dimetilaminobenzaldehid biru
dl 12N HCl
TIROSIN MILLON HgNO3 dl HNO2 : dipanaskan merah
TIROSIN FOLIN- CIOCALTEU As.fosfomolibdatungstat biru hijau
TIROSIN,TRIPTOFAN XANTOPROTEIN HNO3 p.mendidih kuning
FENILALANIN
9. Rx.GUGUS KARBOKSIL
1. Kondensasi ggs karboksil a.a dgn ATP
H O O O O
R – C – C – OH + O – P – O – P – O – P – O – RIBOSA-ADENIN (ATP)
| | | |
NH2 O- O- O-
O O H O O
HO – P – O – P – O- + R – C – C – O – P – O – RIBOSA-ADENIN
| | | |
O- O- NH2 O-
Pirofosfat anor AMINOASIL ADENILAT
10. 2. ESTERIFIKASI ggs karboksil a.a dgn alkohol
O
H+
R – CH – COOH + C2H5OH R – CH – C – OC2H5 + H20
| |
+NH +NH
3 3
atau
konversi menjadi asilklorida O
PCl5
R – CH – COOH R – CH – C - Cl
| POCl3 |
+NH +NH
3 3
atau
dekarboksilasi a.a. menjadi seny.amin
R – CH – COOH R – CH2 + CO2
| |
NH2 NH2
3. Rx dgn benzil hidroksoda O
R2 – CH – COOH + OH – CH2 – R2 – CH – C – O – CH2 – + H 2O
| |
NH2 NH2
Rx ini untuk menghambat ggs karboksil salah satu a.a.
11. Rx.GUGUS AMINO
1. Rx dgn 1-fluoro-2,4-dinitro benzena (reagen SANGER)
NO2 NO2
/ H R / H R
| | | |
O2N – –F + H – N – CH – COOH O2N – – N – CH – COOH
+ HF
2. Rx dgn fenilisotiosianat (reagen EDMAN)
S COOH S COOH
H | H H |
– N = C + N – CH – N – C – N – CH
| | |
H R R
S S
H2O
C
/
N NH
H+,nitrometan N NH
H |
O R HO – O – CH
|
FENILTIOHIDANTOIN O R
AS.FENILTIOHIDANTOAT
12. 3. Rx dgn asam nitrit
R – CH – COOH + HNO2 R – CH – COOH + N2 + H2O + H+
| |
NH2 OH
4. Rx dgn dansil klorida H
H H | H
R – C – N – H + Cl - SO2 – HCl + R – C – N – SO2 –
| |
COOH COOH
– N(CH3)2 – N(CH3)2
1- dimetil amino Naffalen
5-sulfonil klorida
5. Rx dgn benzilklorokarbonat
H O H O
| H | H
R – C – N – H + Cl – C – O – CH2 – HCl + R – C – N – C – O – CH2 –
| |
COOH COOH
CBZ-KLORIDA
CBZ-asam amino
(karbobenzoksi-klorida)
13. 6. Rx dgn t-butiloksikarbonil azida (t-BOC-azida)
H O H O
| | H
R – C – NH2 + N3 – C – O – C(CH3)3 R – C – N – C – O – C(CH3)3
| |
COOH t-BOC-azida COOH t-BOC-azida
Kedua pereaksi ini menghambat gugus amin salah satu a.a.
(5&6)
7. Rx dgn trifloroasetat klorida
O H O
H | H
R – C – NH – H + Cl – C – CF3 HCl + R – C – N – C – CF3
| |
COOH Trifloroasetil COOH
A.Amino Trifloroasetil
klorida (mudah menguap)
GLC
14. Rx.INTER MOLEKUL
1. Dehidrasi intermolekul as.glutamat
CH2 – CH2 H2O CH2 – CH2
| | H | 3 4| H
O=C C 2 5C
| | COOH 1 COOH
OH HN O N
H H
As. Pirolidon 5-karboksilat
1. Dehidrasi intermolekul membtk as.hidrida siklik
O H O H
| |
C – OH H–N C – N
2H2O
/ /
R – CH HC – R R – CH HC – R
/ /
N–H OH – C N – C
/ /
H O H O
Rx ini u/ pemisahan asam amino Diketopiperazin
u/ analisis kuantitatif.
15. ANALISIS ASAM AMINO/PROTEIN
1.KROMATOGRAFI KERTAS
Sejumlah kecil (0,005 mL) lrt a.a.yg mengandung 0,01 mg a.a. diletakkan pada
suatu titik (5 cm dari ujung kertas)
Pelarut : air, suatu asam atau basa, dan pelarut organik (spt, n-butil alkohol)
Sis
Lis
Asp His
Gli Arg
Ser
LEMBAR Tre Glu
KERTAS Ala
Bak berisi pelarut
Pro
Tir
PENYEMPROTAN
NINHIDRIN Val Met
± 18 jam 0,5% dl aseton Trp
Fen Ile
80 – 100 oC Les
16. 2. KROMATOGRAFI LAPISAN TIPIS
Lapisan tipis penunjang (penyerap tempel) ADSORBENT
-Bubuk sellulosa, alumina
-Sephadex, silikagel
Asp
Glu
Sis Scr
Gli
Tre
Ala
Gln Tir
Lis
Val
His Met Ile Les
Arg Trp
Pro Fen
± 8 jam
17. 3. KROMATOGRAFI KOLOM PENUKAR ION
MOORE & STEIN menggunakan resin pertukaran ion
(DOWEX) dan berbagai dapar serta perubahan
temperatur untuk melakukan pemisahan pada
kromatografi kolom dari semua a.a. dl hidrolisat
protein
Dgn cara ini analisi a.a.dapat dilakukan ± 4 jam.
Sistem ini dapat digunakan baik dgn pengumpulan
fraksi (fraction collector) maupun dgn alat pencatat
automatis.
KOLOM : Resin Polistiren
(Amberlite IR-120)
Analisis Protein : Histon Dapat juga dipakai u/penentuan a.amino dl :
Hemoglobin -Plasma
Ribo nuklease -Urin
-Jaringan tumbuhan dan hewan
18. AMONIA
Glu
St.internal
Asam & netral
Ala
Scr
Gli
Les
Asp
Lis
Tre
Val
His
Arg
Pro
Ile
Met
A B
Fen
Tir
Sis
570 nm 570 nm
pH 5,28 pH 3,25 pH 4,25
A. Kolom pendek (5,0 x 0,9 cm) = 60 mt
B. Kolom panjang (55 x 0,9 cm) = 180 mt
Analisis Automatis suatu Hidrolisat
ENDOSPERMA JAGUNG
MOORE-STEIN (DOWEX 50)
PADA 55OC
19. 4. ELEKTROFORESIS VOLTASI TINGGI (H.V.E)
Pemisahan peptida dan asam amino dgn meletakkannya
dalam medan listrik 2000-5000 Volt selama 0,5-2 jam
HVE = merupakan tambahan yg berharga pada teknik
pemisahan kromatografi
PENDUKUNG : kertas
lapisan tipis bubuk sellulosa
Pemisahan tergantung pada 2 faktor :
- Selisih muatan molekul
pada pH yg dipilih
- Berat molekul
Bila muatan sama, BM < akan berimigrasi lebih jauh.
Lempeng gelas tipis
– +
Katode Anode
20. Contoh diletakkan pada bagian tengah lapisan pendukung.
Kmd dibasahi dgn lrt dapar dan dialiri arus listrik.
Mol + bergerak ke arah katode
pada pH yg dipilih
Mol – bergerak ke arah anode
Elektroferogram yg kering diberi mimhidrin mol2 terpisah
pada pita2 yg
nampak (biru U)
Mis. pH 6,4 glutamat dan aspartat mempunyai selisih
muatan -1, bergerak ke anode, dan mudah
dipisahkan, berdasarkan perbedaan BM
(30 menit, 2000 Volt)
Lisin, Arginin, dan Histidin bergerak ke arah
katode, sedang as. amino lainnya tetap berada
pada tempat semula
pH 3,5 peptida yg berasal dari pencernaan enzimatik
protein
21. 5. PENENTUAN PROTEIN DGN METODE LOWRY
PEREAKSI : A : 2% Na2CO3 dl 0,1 N NaOH (b/v)
B : 0,5% (b/v) CuSO4 5H2O
C : % (b/v) Natrium Kalium Tartrat
D : 500 ml A, 0,5 ml B dan 0,5 ml C (camp.
Segar)
E : larutan folin (diencerkan 3 kali dgn H2O)
PROSEDURE : 1 ml lrt. (0,1 – 1 mg protein) + 5 ml lrt. D,
diaduk, dan setelah 10mt di+ 0,5 ml lrt. E
Campuran diaduk kembali dan
absorbansnya atau Do dibaca setelah 30
mt pada 650 mm
LARUTAN STANDARD : SERUM ALBUMIN BOVIN dl lrt NaCl (9 g/l)
Konsentrasi 0,1 – 1 mg/ml
22. DO 650 nm
A
0,7
0,6
0,5
Ax
0,4
0,3
0,2
0,1
0,1 0,2 0,3 Cx 0,4 0,5 mgProt/mL
