полногеномный скрининг эмбрионов методом A cgh

Полногеномный скрининг
эмбрионов методом aCGH:
результаты и новые вызовы
Д. А. Микитенко
к.мед.н.
заведующий лабораторией молекулярной диагностики,
врач-генетик
2014

Содержание
• Вступительная часть
• Методы полногеномного скрининга
эмбрионов
• Чип-сравнительная геномная гибридизация
– Общие данные
– Результативность применения в различных
группах пациентов
– Методические вопросы с разбором
клинических случаев
• Заключительная часть

Вступительная часть
Динамика коэффициента фертильности

Число живорожденных на 1000 населения

Характеристика пациентов с бесплодием
• Пациенты старшего возрастного ценза
• Осложненный репродуктивный анамнез
( I / II бесплодие, плод / ребенок с генетически обусловленной патологией)
• Патология:
– анатомическая
– гормональная
– генетическая
• хромосомная (в т. ч. сбалансированная)
• генная
• мультифакторная
Повышение риска генетически
обусловленной патологии, эпигенетических,
мультифакторых заболеваний
Повышение частоты хромосомных аномалий эмбрионов
лишь одно из цепочки следствий

Внешние и внутренние факторы риска
Постнатальное
развитие
Пренатальное
развитие
Родительский
организм
Пре-
эмбриональный
этап Преимплантационные генетические
исследования эмбрионов

PGD TimeLine
1970 1980 1990 2000 2010
Implementation of
the FISH into the
cytogenetics
First PCR - PGD
FISH – sex selection
Implementation of the CGH
into the cytogenetics
arrayCGH reported for clinical genetics
CGH- PGD
aCGH- PGD
PCR -PGD for Fresh ET
SNP-
array
PGD
First delivery
after aCGH-PGS
aCGH
First aCGH-delivery
2012
NGS-PGS
Karyomapping

Содержание
• Вступительная часть
• Методы полногеномного скрининга
эмбрионов
• Чип-сравнительная геномная гибридизация
– Общие данные
– Результативность применения в различных группах
пациентов
– Методические вопросы с разбором клинических
случаев
• Заключительная часть

Методы полногеномного скрининга
Возможности Методы
Q-PCR CGH/aCGH SNP NGS Karymapping
Время +++ ++ ++ + +
Себестоимость ++++ +++ ++ ++/+ ++/+
Оптимизация по
пациента
Не требуется Не требуется Не требуется Не требуется Не требуется
Целесообразность
реализации при потоке
малом среднем среднем Большом Большом
Анеуплоидии + + + + +
Несб. структ. Аномалии - + + + +
Сб. структ. Аномалии - - - -* -
UPD - - + +* +
Моногенная патология - - - +/- + (косвенно)
Триплоидия (чистая) - - * +* +* +*
Тетраплоидия (чистая) - - / +* - - -
Исследование
родительского образца
необходимо необходимо необходимо

11
чип-сравнительная геномная гибридизация (aCGH)
M Shinawi, S. W. Cheung. Drug Discovery Today. 13 (17/18). 2008
aCGH – технология высокоразрешающего полногеномного скрининга, технологія
високороздільного повногеномного скринінгу, которая позволяет детектировать
анеуплоидии и несбалансированные микроструктурные хромосомные аномалии
(M Shinawi, S. W. Cheung. 2008 )

«Ищущим какую-нибудь вещь приходится или найти ее, или дойти до
отрицания нахождения и признания ее невоспринимаемости, или
упорствовать в отыскании»
Секст Эмпирик (начало II века) — древнегреческий врач и философ

Клинические показания к проведению CGH-PGS в Клинике Надия
•Возраст женщины 35 лет и более
•Привычное невышашивание беременности
•Неудачные циклы ВРТ в анамнезе (перенос 3 и более
эмбрионов качества не ниже 3ВВ или более 10 эмбрионов
независимо от качества и количества переносов)
•Высокий уровень анеуплоидии спермы (>5%)
•Подтвердженный случай анеуплоидии плода
•Носительство хромосомных перестроек / генних дефектов
-Исследования проводились в рамках циклов ВРТ с информированного согласия
пациентов
-Исследуемый материал – клетки трофэктодермальной оболочки эмбриона (5 сут)
-Эмбрионы, качества не ниже 3ВВ с начавшимся хэтчингом
-Эмбрионы витрифицировались на время исследования и использовались в
последующих криоциклах
-Платформа исследования - ВАС-aCGH 24sure (BlueGnome, UK)

Характеристика исследованных эмбрионов
Характеристика Абс Отн количество,
%
Всего 1375
Без результата 29 2,1%
Сбалансированный хромосомный набор 695 51,6%
Несбалансированный хромосомный набор 651 48,4%
Из них: 1019
- Числовые хромосомный аномалии 809 79,4%
Из них: Трисомии 400 (49,4%)
Моносомии 409 (50,6%)
- Несбалансированные структурные аномалии 210 20,6%
1-01-2011 - 30,09-2014

0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 59
К-сть аномалій >3
К-сть аномалій 2

0
2
4
6
8
10
12
14
Хр.1
Хр.2
Хр.3
Хр.4
Хр.5
Хр.6
Хр.7
Хр.8
Хр.9
Хр.10
Хр.11
Хр.12
Хр.13
Хр.14
Хр.15
Хр.16
Хр.17
Хр.18
Хр.19
Хр.20
Хр.21
Хр.22
XY
Трис.%
Монос.%
* *
*

Presence and distribution of abnormal chromosomes in the aneuploid blastocysts detected
by TE biopsy and DNA microarray.
Liu J et al. Biol Reprod 2012;87:148
©2012 by Society for the Study of Reproduction
Presence and distribution of
abnormal chromosomes in the
aneuploid blastocysts detected by
TE biopsy and DNA microarray.
A) Data represent the numbers of
aneuploid blastocysts with a
single abnormal chromosome
and multiple (complex)
abnormal chromosomes.
B) Data show the proportions of
aneuploid embryos with
combined single and multiple
chromosome abnormalities.
Data were based on 138
aneuploid blastocysts.

0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
Хр.1
Хр.2
Хр.3
Хр.4
Хр.5
Хр.6
Хр.7
Хр.8
Хр.9
Хр.10
Хр.11
Хр.12
Хр.13
Хр.14
Хр.15
Хр.16
Хр.17
Хр.18
Хр.19
Хр.20
Хр.21
Хр.22
XY
Структ.%
Анеупл.% (три+моно)*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Распределение хромосом по вовлеченности в полные анеуплоидии и
несбалансированные структурные аномалии

21
Распределение эмбрионов по полу *
Характеристика Пол P
Женский Мужской
Сбалансированный
хромосомный набор
121 112 0,03
Несбалансированный
68 98
Распределение эмбрионов по времени биопсии
Характеристика День биопсии P
5 6/7
Сбалансированный
131 101 0,0005
Несбалансированны
й хромосомный
набор
67 105
Mazur P. Disproportion of sex ratio within aneuploid embryos after acgh / P. Mazur, V. Nagornyy,
D. Mykytenko, L. Semenyuk, V. Zukin // European Society of Human Reproduction and
Embryology. Abstracts ESHRE 2014 (Munich, July, 2014). – P. 33-34 (P-164).

Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology
assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients:
results from a randomized pilot study
Molecular Cytogenetics 2012, 5 :24
Zhihong Yang et al.

Array CGH with Day 5 biopsy:
Results from centers with >20 cycles
total range
per
center
Maternal age: 37.0 36 – 38.6
# zygotes 6.4 5.2-8.3
cycles: 433 20-55
Implantation after PGD 61% 52-83%
Pregnancies / cycle 50% 26-73%
Pregnancies / transfer 67% 53-100%
Reprogenetics data to 9/2011

CGH Aneuploidy Screening in poor prognosis IVF
patients
IVF Hammersmith experience
• 85 embryos transferred in 53 cycles 57%
• Clinical pregnancy rate/cycle started 16/93 17%
• Clinical pregnancy rate/ET 16/53 30%
<37 years CPR/ET 5/14 36% >37
years CPR/ET 11/39 28%
• 1 ectopic, 2 miscarriages, 5 livebirths, 8 ongoing
pregnancies
20:33 24

25
Результативность aCGH-PGD
Выборка – 16 бесплодных пар (носителей транслокации)
PGD-aCGH
эмбрионов - 132
Результат получено по 93,7% эмбрионов (121)
Эуплодиных эмбрионов – 22,3 % (27)
Цикл окончило 15 пар
Частота наступления беременности – 31,3% / пункцию
- 33,3% / перенос (5 пар)

Результативность aCGH-PGS
группах пациентов неблагоприятного репродуктивного прогноза
Результативность aCGH-PGD
у носителей сбалансированнных хромосомных аномалий
2011-…..
Станом на 08-12-2014
111 вагітність
14 с/а (12,6%)
68 пологи, 89 дітей (21 дв.)

Распределение эмбрионов на стадии бластоцисты у носиелей сбалансированных
хромосомных аномалий
Микитенко Д. А. Оценка явления межхромосомного
эффекта у эмбрионов пациентов с хромосомными
аномалиями методом полногеномного скрининга / Д.
А. Микитенко, Л. Я. Пилип, В. Д. Зукин, К. В. Лаврова
// Редкие (орфанные) заболевания и врожденные
пороки развития.Севременные возможности
диагностики, профилактики, лечения и реабилитации.
К 45-летию Медико-генетического центра. – Санкт-
Петербург, 2014. – С.340-347.
29.7%
16.2%
16.2%
37.8%
Хромосомные аномалии, ассоциированные с родительской перестройкой
Хромосомные аномалии, ассоциированные с транслокацией, с вовлечением других хромосом
Хромосомные аномалии, не свзанные с родительской транслокацией
Нормальный / сбалансированный хромосомный набор

Выделенные группы с неблагоприятным прогнозом
Эмбрионов/
исследование
К-во случаев Эуплоидных
эмбрионов
(PGS-CGH)
ЕТ Беременность
≤ 3 33 23/73 (31,5%) 14 (42%) 9 (27 % / 64%)
≤ 2 17 7/25 (28%) 5 (29%) 5 (30% / 100%)
1 10 3/10 (30%) 3 (33%) 3 (33%/100%)
Накопичення ембріонів
≥ 4 31 82/221 (37%) 22 (70%) 11 (35%/50%)

Динамика к-ва полученных в зависимости от возраста
пациентки
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
Возраст пациентки, г.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Эффективностьбластуляции,%
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Среднеек-вополученныхэмбрионов/бластоцист
Среднее ко-во полученных эмбрионов
Среднее ко-во полученных бластоцист
Эффективность бластуляции

Распределение эмбрионов (стадия бластоцисты) по к-ву
хромосомных аномалий в зависимости от возраста
пациентки
62,5
75
59,1
75
75,5
61,8
69,8
61
48,3
52,9
57,5
51,2
40 40,6
52,6
34,8
50
28,6
37,5
5,6
8,3
24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Возраст пациентки, г.
0
20
40
60
80
100
Доля,%
62,5
75
59,1
75
75,5
61,8
69,8
61
48,3
52,9
57,5
51,2
40 40,6
52,6
34,8
50
28,6
37,5
5,6
8,3
3 и более хромосомные аномалии
2 хромосомные аномалии
1 хромосомная аномалия
Эуплодиные

Доля эуплодиных эмбрионов (от исходного к-ва), доступных
к переносу после проведения aCGH-PGS
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
Вік, роки
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Доляембріонів,доступнанаперенос,%
N 𝑁 = 41.069 + 0.1952 ∗ возраст − 21 − 0.101 ∗ возраст − 21 2

Прогноз наличия эуплоидных эмбрионов для ЕТ после проведения aCGH-
PGS в зависимости от возраста и количества полученных бластоцист
Досліджених
бластоцист
Вікова група, р.
<30 31-35 36-40 41-42 43-44
1-3
100 86 66 50 30
45 52 38 25 11
4-5
100 86 86 73 35
60 45 41 50 30
6-8
67 53 47 29 41
67 53 47 29 41
>8
100 100 100 100 100
48 61 45 56 66
Примечание : «жирный» шрифт – доля пациентов с 1 и более эуплоидным эмбрионом, доступным к ЕТ, %;
«курсив» - доля эуплоидных эмбрионов, %.
Микитенко Д. О. Прогноз отримання еуплоїдних ембріонів у програмах ДРТ із застосуванням ПГС / Д. О. Микитенко, К. В. Лаврова,
Ю. В. Маслій, В. Д. Зукін // Здоровье женщины. Научно-практический журнал – 2014. - № 4 (90). – С. 164-167.

Без SYBRGreen
c SYBRGreen
Т. о. – наличие SYBRGreen в реакционной смеси не влияет на эффективность
гибридизации и маскирование сигнала Cy3 / Cy5

Множественные хромосомные аномалии
Множественные хромосомные аномалии
(МХА), как правило, несовместимы с
развитием.
Наличие МХА в бластомерах можно объяснить
развитием эмбриона на этом этапе за счет
материнских факторов или возникновением
хромосомных аномалий за счет процедуры
биопсии.
Однако, однозначно объяснить причины
наличия МХА в образцах трофэктодермы еще
не представляется возможным

Неэффективная WGA
Конденсация WGA-ДНК

Микроструктурные аномалии
?

Мозаицизм – интерпретация?
?
?
Предположить наличие мозаицизма
и отличить его от деградации ДНК
можно исключительно в случае
чистого профайла
Трофэктодерма
Бластомер не мозаичен по
определению.
Трофэктодерма – может……..

Based on our previous findings [13], there are four different human
embryonic mosaicisms:
1) embryos had aneuploid ICM and had both euploid and aneuploid TE cells;
2) embryos had aneuploid ICM and had euploid TE cells. These embryos are
considered to be abnormal;
3) embryos had euploid ICM and aneuploidy TE cells and
4) embryos had euploid ICM and had both euploid and aneuploidy TE cells.
It would appear that the rate of mosaic pregnancy is not related to infertility treatment and IVF [15]. It
has been reported that there was no difference in the prevalence of mosaicism during the first
trimester of pregnancies conceived naturally or with IVF [20]. However, it was found that diploid-
aneuploid mosaicism rate is quite high in the blastocysts produced by IVF [15]. According to our
previous study, four out of nine diploid-aneuploid mosaic blastocysts had euploid ICM [13].

Forty-nine of 51 (96.1%) ICM samples were concordant with TE biopsies derived from the
same embryos. Discordance between TE and ICM occurred only in the two embryos with
structural chromo-some aberration. We conclude that TE karyotype is an excellent
predictor of ICM karyotype. Discordance between TE and ICM occurred only in embryos
with structural chromosome aberrations

Published online before print November 7, 2012, doi: 10.1095/biolreprod.112.103192 Biology of
Reproduction December 1, 2012 vol. 87 no. 6 148
DNA Microarray Reveals That High Proportions of Human Blastocysts from Women of Advanced Maternal
Age Are Aneuploid and Mosaic1
Jianqiao Liu3, et al

Diagrams of types of mosaicism in human blastocysts.
©2012 by Society for the Study of Reproduction
Diagrams of types of mosaicism in human
blastocysts. Type I (top left): Euploid ICM
and TE, a normal blastocyst.
Type II (top right): Consistent aneuploid
TE and ICM, an abnormal blastocyst.
Type III: Euploid ICM cells and aneuploid
TE (middle left) or inconsistent (euploid
and aneuploid) TE (middle right). Both are
mosaic embryos with euploid ICM.
Type IV: Inconsistent (euploid and
aneuploid) TE (bottom left) or mosaic TE
(bottom right) with aneuploid ICM. Both
are mosaic embryos.

Баранов В.С., Кузнецова Т. В.
Цитогенетика эмбрионального развития человека: Научно-практические
аспекты / Баранов В. С., Кузнецова Т. В. — СПб: Издательство Н-Л,
2006.

TE vs ICM
Образец Х-ка Эмбрион ТЕ
1 3pn XY XY
2 3pn XY XY
3 3pn +8,+10,XX +8,+10mos,XX
4 3pn +7,XY +7,XY
5 >3pn +12,XX +12,XX
6 1pn +10,XX +3mos,+4mos, +10,+14mos,XX
7 1pn +16,XX +16,XX
8 1pn XX XX
9 3pn XX XX
10 2pn 5q35.2qter(5Mb)x1,XY 5q31.2qter(42Mb)x1,XY

10 2pn 5q35.2qter(5Mb)x1,XY 5q31.2qter(42Mb)x1,XY
Эмбрион
ТЕ

К******* І. Ю. 26 лет
№ эмбриона
Свежий цикл/
криоцикл
День биопсии
Стадия
бластоцисты
Внутриклет
очная масса
Трофэктодерма Результат анализа ET
1-3 Свежий 5 3 B B arr (1-22,X)x2
ET
1-9 Свежий 5 3 A A arr (1-22)x2,(XY)x1
ET
1-3

Ч***** О. Е. муж 46,XY,t(2;15)(q21.2;q23)
криоцикл
Стадия
Внутрикле-
точная масса
4 Свежий
5 4
А А arr(1-22)x2,(XY)x1 normal male
ET

CEP 18(SA),X(SG),Y(SO)
Зам 8 нед
Предварительно
47,X,-X,?+der(X)(pter-p11),+der(X)(p11-qter)[4]
18
18
Х
Х
Y
arr(1-22)x2,(XY)x1

К ******* И. А.
ТЕ.
Перенос 2 эмбрионов
криоцикл
Стадия
Внутрикле-
точная масса
1 Свежий
5
3 A A normal female
ET
2 Свежий
5 4
B B normal male
ET

Замершая
беременность
В. Х.
FISH – 90% клеток - +22
?
47,XY,+22.ish(BCRx3).arr[GRCh37] 22q11.1q13.33x3
22
15

Полиплоидия
DIPLOIDS
autosome X Y
46,XY 2 1 1
normalised log2ratio 0 0 0
46,XY 2 1 1
autosome X Y
46,XX 2 2 0
normalised log2ratio 0 1 #ЧИСЛО!
46,XY 2 1 1
TRIPLOIDS
autosome X Y
69,XXY 3 2 1
normalised log2ratio 0 0,415037 -0,58496
46,XY 2 1 1
autosome X Y
69,XYY 3 1 2
normalised log2ratio 0 -0,58496 0,415037
46,XY 2 1 1
autosome X Y
69,XXX 3 3 0
normalised log2ratio 0 1 #ЧИСЛО!
46,XY 2 1 1
USING MALE REFERENCE

69,XXY – В. Х. – замершая
беременность

Полиплоидия?
ТЕ – 5 day

Y
Y
Y
13
13
13
13
13
13
21
21
21
21
21
21
1818
18
18
18
18
X
X
X
НЕТ!
Полиплоидия?
Критерии детекции
полиплоидии нуждаются в
доработке и оптимизации

aCGH –
WGA BlueGnome
aCGH – WGA Sigma Aldrich

Использование разных систем WGA
Sigma Aldrich WGA BlueGnome WGA
24sure+ 24sure+
24sure 24sure V3
…2011 2011…

Динамика чувствительности метода (Oligo-aCGH)
2014 © Алексей Екимов
ФГБУ "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии
им. академика В.И.Кулакова" Минздравсоцразвития РФ
2010
OGT
2014
OGT
Agilent

Выводы
• Вывод 1. Условный. Все виды генетической диагностики (не
только в отношении эмбрионов) отражают исключительно
результат по исследованных клеткам, который мы пытаемся
(иногда безуспешно) экстраполировать на уровень всего
эмбриона/организма.
• Вывод 2. Безальтернативный.
Методы полногеномного скрининга, несмотря на
существование ряда нерешенных методических вопросов,
остаются наиболее приемлемым подходом PGS.
• Вывод 3. Неопределенный.
Генетический скрининг эмбрионов не должен быть причиной
необоснованной выбраковки эмбрионов. Но, если
характеристики профайла не укладываются в вариант принятой
нормы (учитывая переанализ), от переноса такого эмбриона
следует воздержаться.

….и все те, без кого данная презентация была
бы невозможна…..
Зукин Валерий Дмитриевич Директор клиники
Лаврова Екатерина Васильевна Лаборатория молекулярной
диагностики
Семенюк Людмила
Станиславовна
Лаборатория эмбриологии
Мазур Павел Сергеевич
Нагорный Виктор Олегович
Пилип Лариса Ярославовна Лаборатория цитогенетики

Спасибо за внимание
82
Клиника репродуктивной медицины
«НАДИЯ»
www.ivf.com.ua
“Our goal is to preserve the past
using 21st century technology”
James Dewey Watson

полногеномный скрининг эмбрионов методом A cgh

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Viewers also liked

Viewers also liked (14)

Similar to полногеномный скрининг эмбрионов методом A cgh

Similar to полногеномный скрининг эмбрионов методом A cgh (20)

More from Dmytro Mykytenko

More from Dmytro Mykytenko (9)

полногеномный скрининг эмбрионов методом A cgh

Editor's Notes