лапин

Лапин С.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.

Клональность иммуноглобулинов и
методы ее оценки в диагностике
гематологических и аутоиммунных
заболеваний

Лапин Сергей Владимирович, к.м.н.

Лаборатория диагностики аутоиммунных заболеваний,
Научно-Методический центр по Молекулярной медицине,
Санкт-Петербургский Государственный
Медицинский Университет им.акад.И.П.Павлова


Исследование клональности
иммуноглобулинов в лабораторной
диагностике
Иммуноглобулины представляют гетерогенную
популяцию глобулинов сыворотки крови и биологических
жидкостей
В ходе специфического иммунного ответа может
изменяться уровень синтеза иммуноглобулинов и
изменяется его клональность
Клональность отражает преимущественный синтез
идентичных иммуноглобулинов плазматическими
клетками одного клона
Оценка клональности синтеза иммуноглобулинов
используется в диагностике парапротеинемий и
аутоиммунных заболеваний (рассеянный склероз)


Варианты клональности и синтеза Ig’s
Стволовая клетка

В-клетки/ПК

Поликлональный
синтез Ig
Острый
иммунный ответ
Олигоклональный
синтез Ig
Хронический
иммунный ответ
Моноклональный
синтез Ig
Миелома


Выявление моноклонального
иммуноглобулина - парапротеина

Парапротеин (ПП) является первым среди описанных
онкомаркеров (MacIntyre1846, Apitz 1940)
Фактически представляет новую «фракцию» белков сыворотки,
синонимы М-пик или М-градиент
Состоит из моноклонального иммуноглобулина или компонентов
молекул иммуноглобулина
Концентрация отражает общую опухолевую массу, синтез других
иммуноглобулинов подавлен
В моче ПП представлен белком Бенс-Джонса
Основным методом выявления и измерения концентрации
парапротеина при онкогематологических заболеваниях является
электрофорез (Keren, D.F., et al. Arch Pathol Lab Med 1999)


Иммуноглобулин и его строение

Легкая цепь молекулы Ig
Во всех молекулах синтезируется
либо каппа-цепь или лямбда-
цепь, их соотношение в составе
иммуноглобулинов сыворотки
Тяжелая цепь молекулы Ig составляет 2:1
Тяжелая цепь определяет класс При увеличении продукции Ig
иммуноглобулина – IgG, IgM, IgA, наблюдается аномальный синтез
IgE, IgD. свободных легких цепей каппа
Крайне редко синтезируется без либо лямбда, которые в почке
соответствующих легких цепей. фильтруются и накапливаются в
Несет полисахаридные остатки, моче – белок Бенс-Джонса
что определяет растворимость Ig.


Моноклональный иммуноглобулин обладает
всеми свойствами онкомаркера

Онкомаркер – тканевой продукт (например гликопротеин),
производимый опухолью пропорционально объему опухолевой
ткани.
Концентрация онкомаркера в норме ничтожна
Онкомаркеры иногда появляются в крови при тканевых
воспалениях или доброкачественных заболеваниях в низких
концентрациях
Одним из клинических применений онкомаркера – мониторинг
динамики роста опухоли (объема опухолевой ткани) и оценка
рецидивов и дистантных метастазов
Мониторинг концентрации парапротеина обязателен при
диагностике, оценки течения заболевания и эффективности
терапии (Kyle et al, Leukemia 2010)


Арне Тизелиус
(1902-1971)
Электрофорез в жидкой
среде (moving boundary
electropheresis)

ЭФ в буфере впервые использован для
разделения белков сыворотки крови человека
Арне Тизелиусом (1932 г.)
Он применил U образную ячейку и оптическую
систему Шлирена для детекции смены
оптической плотности раствора с
фотографической регистрацией
Были описаны основные белковые фракции,
включая парапротеин в моче (Longsworth,
1939)

Transactions of the Faraday Society 1937;33:524


Ряд областей диагностического
применения клинического ЭФ
Метод Диагностическое значение
ЭФ белков сыворотки (5/6 Изменение сдвигов метаболизма
фракций, 15 фракций high res) (печень, почки, костный мозг,
нутритивный статус)
Иммунофиксация сыворотки Выявление парапротеина в сыворотке и
и/или мочи моче, оценка клональности
иммуноглобулинов
ЭФ фракций ЛДГ, КФК, ЩФ Биомаркеры органного поражения

ИЭФ цереброспинальной Диагностика рассеянного склероза
жидкости
ЭФ липопротеинов и фракций Типирование гиперлипидемий
холестерина
ЭФ и ИЭФ гемоглобина Талассемии и гемоглобинопатий

ИЭФ трансферрина Оценка злоупотребления алкоголем,
выявление ликвореи в отделяемом


Зональный электрофорез:
история развития
В ходе электрофореза образуются стойкие «зоны»,
которые фиксируются и окрашиваются c последующей
денситометрией
В течении ряда лет совершенствовалась подложка для
электрофореза, окрашивание и методы денситометрии
Фильтровальная бумага
Ацетатцеллюлеза (Kunkel 1951)
Агарозе (Wieme,1965)
Денситометрия окрашенных треков (Briere and Mull
1964)


Применение зонного
электрофореза 1940-1950


Аналитическая чувствительность
клинического электрофореза
Чувствительность клинических лабораторных методов:
радиоимммунный метод 1-1000 пкг/л, иммунохимические методы
и ИФА 1-1000 нг/л, нефелометрия и турбидиметрия 1-500 мг/л,
клинический электрофорез 0,2-100 гр/л
Цитокины - 0,001-50 нг/л
Гормоны и тканевые продукты - 0,05-500 мкг/л
Основные белки плазмы - 0,001-10 г/л
Белковые фракции - - 0,5-10 г/л
Выявление парапротеина >0,5 г/л
Минимоноклональные ПП 0,5- 3 гр/л
Моноклональный ПП 10-30 гр/л


ЭФ белков сыворотки «низкого» и «высокого»
разрешения ( чувствительность-0,1-10 г/л)

Стандартное выявление – Высокое разрешение -
5 фракций или 6 фракций до 15 фракций

Количественное содержание:
преальбумин, фибриноген,
альбумин, гаптоглобин,
орозомукоид, трансферин,
α1-антитрипсин, α2-макроглобулин,
α1-липопротеид, β-липопротеид,
антихимотрипсин, IgG, IgA, IgM, С3


Основные и минорные белки белковых фракций
при электрофорезе низкого разрешения
Фракция Основные белки Минорные белки
(>0,5 гр) (<0,5 гр/л)
Альбумин Альбумин Преальбумин

Альфа-1- α-1-липопротеин(ЛПВП) α-1-антихемотрипсин
глобулины α-1-антитрипсин α-1 гликопротеин
(орозомукоид)
ЛПВП
`
Альфа-2- α-2-макроглобулин Гемоплексин
глобулины Гаптоглобин Антитромбин III
C-1 ингибитор эстеразы
Церулоплазмин
ЛПОНП
Бета- Трансферин Пропередин
глобулины С3-комплемент Фактор В, С4, С5,
β-липопротеин (ЛПНП) β-2-микроглобулин
Свободные легкие цепи
Гамма- Фибриноген Ig-D
глобулины IG-M Ig-E
IG-A C-реактивный белок
IG-G Лизоцим


Принцип разделения белков
В ходе электрофореза сыворотки молекулы белка в буфере
упорядоченно двигаются в электрическом поле
Заряд молекулы зависит от суммы зарядов ее частей: -СООН
(СОО-)группы и -NH3 (NH4+)группы, их соотношение
определяется изоэлектрической точкой (рI)
Буфер это среда содержащая полярные ионы, общий заряд
буфера зависит от числа протонов (Н+) – величина (рН)
Много протонов – рН буфера <7 (кислый) в молекуле больше
NH4+ групп – общий заряд положительный
Мало протонов – рН буфера >7(щелочной) – в молекуле
больше СОО- групп, общий заряд отрицательный
Буфер для электрофореза в агарозном геле слабощелочной
(рН=8,6), большинство белков заряжены отрицательно


Заряд белка зависит от разницы между его
pI и pH буфера, чем больше разница
больше заряд и дальше миграция


Характерные паттерны при ЭФ белков сыворотки
Системный воспалительный острофазовый ответ приводит увеличению альфа
1 и альфа 2-фракции, при одновременном снижении уровня альбумина
Характерен для острых инфекционных заболеваний и используется в
дифференциальной диагностике воспалительных состояний.

Снижение содержания фракции альбумина. Возможно при:
-Снижении белковосинтетической функции печени и голодании
-потере белка с мочой при нефропатиях
-повышенном катаболизме при эндокринных заболеваниях

Возрастание фракции γ-глобулинов является признаком поликлональной
гаммопатии и возникает при ряде заболеваний: хроническая патология печени,
системные заболевания соединительной ткани, хронические инфекции,
метастатистическая карцинома, ожоговая болезнь.

Снижение содержания фракции γ-глобулинов (гипогаммаглобулинемия и
агаммаглобулинемия) может говорить о первичном или вторичном
иммунодефиците, а также возможно при амилоидозе и болезни легких цепей.

Резкое возрастание отдельной составляющей фракции γ-глобулинов происходит
при моноклональной гаммапатии и является поводом для углубленного
обследования пациентов в отношении гематоонкологических заболеваний.
Мониторинг содержания парапротеина позволяет оценить эффективность терапии.


После разделения белков проводится их
окрашивание и денситометрия с оценкой %%

НОРМА
М-градиент в зоне
гамма-глобулинов

Альбумин

γ β α2 α1

Глобулины
ПАРАПРОТЕИНЕМИЯ


Ограничения использование
электрофореза белков сыворотки в
диагностике парапротенемий
ЭФ сыворотки позволяет выявить преимущественно ПП во
фракции гамма-глобулинов (класса IgG) ~ 50% от всех
случаев
Ложноотрицательные результаты:
Парапротеины других классов (IgA и IgM), а также легкие цепи
мигрируют в составе других белковых фракций – бета и
альфа 2, а при болезни легких цепей наблюдается
гипогаммаглобулинемия

Ложно-положительные результаты:
Гемолиз, фибриноген, воспаление, рентгенконтрастные
препараты, гиперлипидемия, гипергамма и т.д.


Сложности детекции парапротеина
при клиническом ЭФ

1. Норма; 2 Минимоноклон; 3. Гемолиз; 4 Фибриноген; 5 Бета-гамма
блок - цирроз печени; 6 Пре-бета при ГН; 7 Гипергамма; 8 Гипогамма


Артефактры при
электрофорезе
«Нетипичиные» белки – гемоглобин, миоглобин,
СРБ, фибриноген, криоглобулины и иммунные
комлексы
В агарозе бета-липопротеины (ЛНП) образуют
агрегаты в бета фракции
Терапевтические моноклональные антитела –
напоминают парапротеин
Рентгенконтрастные препараты – возможны
артефакты при капиллярном ЭФ


Методы выявления парапротеина с
помощью электрофореза
Наличие парапротеина в гамма- и бета фракциях
сыворотки крови и пробах мочи должно быть
подтверждено с помощью иммунофиксации
Показанием к проведению иммунофиксации является
изменение альфа 2, бета и гамма – фракций, которое
нельзя объяснить метаболическими сдвигами
Количественная оценка ПП проводится на основе
денситометрии электрофорограмм, иммунохимическая
оценка ПП при онкогематологических заболеваниях не
рекомендована
Порядка 10% результатов ЭФ требуют исследования с
помощью ИФ


Иммунофиксация
Разработана в 80х годах прошлого века, стала заменой
иммуноэлектрофорезу
Метод основан на нанесении антисывороток против белков
человека на поверхность геля, их диффузией и образование
нерастворимого иммунного комплекса в геле
Гель отмывается от несвязавшихся белков сыворотки, после
чего иммунный комплекс окрашивается белковым красителем
В рутинной практике широко используется для определения
клональности иммуноглобулинов, однако может выявлять и
другие белки сыворотки
Основной спектр антисывороток включает пять основных: анти-
IgG, IgA, IgM, anti-kappa, anti-lambda, а также ряд
вспомогательных: анти- IgD, IgE, free-K, free-L, pentavalent,
trivalent


Принцип иммунофиксации
Двухэтапный процесс:
1. проведение электрофореза одного
биоматериала на нескольких
дорожках
2. иммунопреципитация с
антисыворотками (анти IgG, IgM, IgA,
kappa, lambda, дополнительно IgD,
IgE)
Образование иммунного комплекса
зависит от ряда физических факторов
(ионная сила, температура)
Интенсивность преципитации
нарастает линейно вплоть до
феномена «прозоны» при высоких
концентрациях ПП


Пример иммунофиксационного геля - норма


Иммунофиксация сыворотки и мочи
Наиболее чувствительный тест для выявления
парапротеина и его типирования
Парапротеин IgG/L 17 г/л Парапротеин IgA/L 8 г/л


Что оценивать при
иммунофиксации?
Иммунофиксация – качественный метод. С его помощью мы
устанавливаем местонахождение моноклонального
компонента и типируем его, т.е. определяем класс тяжелой и
легкой цепи
Мы идентифицируем новую фракцию (или парапротеин) как
иммуноглобулин или его фрагмент за счет связывания с
антисывороткой известной специфичности
Окрашивание моноклональной полосы антисывороткой
приводит к ее усилению на фоне других иммуноглобулинов
Определяем феномен рестрикции легкой цепи –
моноклональный иммуноглобулин имеет легкую цепь только
одного класса: или каппа или лямбда
При болезни легких цепей выявляется только свободная
легкая цепь (каппа или лямбда) без тяжелой цепи, легкая
цепь того же класса секретируется в мочу


Пример IgG/каппа


Пример IgG/лямбда


Пример IgG/лямбда и свободноый
лямбда цепи в альфа 2 фракции


Парапротеин IgG/kappa в бета 1
фракции


Парапротеин IgM/kappa


Выявлена только легкая цепь лямбда-
требуется дообследование


Анализ белкового состава мочи

Моча содержит в среднем 10 мг белка/л, суточная
протеинурия до 100 мг/сутки.
В норме альбумин (50%) и белок Тамм-Хорсфала
(40%) и низкомолекулярные белки
1) α-1 кислый гликопротеин (40kDa).
2) α-1 микроглобулин (27kDa).
3) β-2 микроглобулин (12kDa).
4) Следы белков гамма-зоны (12kDa).
5) Ретинол связывающий белок (20kDa).
В норме чувствительность электрофореза белков
сыворотки должна быть достаточной для выявление
следовых количеств альбумина – требуется
концентрация мочи


Варианты протеинурии при
гломерулопатиях

1.Селективная протеинурия
(преимущественно альбумин)
2.Неселективная протеинурия
(все белки сыворотки)
3.Протеинурия переполнения
(секреция белка Бенс-Джонса,
представляющего полимер
свободных легких цепей
иммуноглобулинов)
1 2 3


Парапротеинемии в онкогематологии
%% при
Состояние Разновидности выявлении ПП
IgG 50%
IgA 20%
Миелома Бенс-Джонса
15-20%
(болезнь легких цепей)
Множественная миелома
Биклональная 2-4%
Несекретирующая Редко
Редкие формы:
Редко
IgD>IgM>IgE
Макроглобулинемия
IgM 4%
Вальденстрема

Солитарная плазмацитома Свободные легкие цепи 1%

Лимфопролиферативные
Лимфома/ХЛЛ 5%
заболевания
Болезнь тяжелых цепей Альфа/гамма/мю Редко


Моноклональные гаммапатии — это
новообразования из клеток B-лимфоцитарного
ряда, секретирующие парапротеины –
имуноглобулины или их фрагменты.

Эти нарушения часто приводят к синтезу
большого количества нефункционального
моноклонального иммуноглобулина либо
наоборот синтезом его фрагментов с понижением
концентраций нормальных иммуноглобулинов.


Злокачественные моноклональные
гаммапатии

1.Множественная миелома
2.Вялотекущая (тлеющая ) или индолентная миелома
3.Солитарная плазмацитома
4.Злокачественные лимфопролиферативные
заболевания (макроглобулинемия Вальденстрема)
5.Болезнь тяжелых цепей
6.Болезнь тяжелых цепей (первичный AL-амилоидоз)


Множественная миелома
Заболеваемость составляет приблизительно 50 случаев на
1000 000 в год. С возрастом частота заболевания нарастает и
достигает 1% популяции среди лиц старше 80 лет.

Половина больных на момент постановки диагноза старше 68
лет. Выявление ПП у лиц моложе 50 лет требует пристального
онкологематологического обследования.

До появления современной терапии 50% пациентов погибало
в течении первых 3 лет после диагноза. В США в 1996 году
зарегистрировано 14 400 новых случаев и 10 400 смертей от
нее

Ранняя диагностика обеспечивает раннее начало лечения и
отсутствие поражения внутренних органов, которое
определяет прогноз пациентов.


Клиническая картина миеломы

1. Анемия, повышение СОЭ. (увеличение белка,
гиперкальцемия, ЛДГ, высокие Igs сыворотки крови, белок в
моче)
2. Боли в костях, усиливающиеся при
движении (70%), спонтанные переломы.
Обусловлены пролиферацией опухолевых клеток, приводящей к
активации остеокластов и остеолизису. Остеолизис ведет к
поступлению в кровь значительного количества кальция.
3. Бактериальные инфекции (25-30%). Связаны
пониженной продукцией антител и ускоренным их разрушением.
4. Миеломная нефропатия (50%). Обусловлена
гиперкальцийемией, повреждением канальцев легкими цепями
имуноглобулинов.
5. Амилоидоз
6. Синдром гипервязкости крови. Обусловлен
гиперпродукцией моноклонального белка
7. Неврологическая симптоматика. Компрессия
спинного мозга, корешковые боли, периферическая нейропатия.


Диагноз ММ устанавливается на
основании 3 диагностических критериев
(Kyle 2010)
Характерные «штамованные» деструкции плоских костей и
позвоночника
Обнаружение >10% плазматических клеток в костном мозге
Выявление парапротеина в плазме крови (обычно >30 г/л)

Оценка множественной
миеломы: симптомы CRAB
Calcium (Кальций) >0,115 гр/л
Renal failure (Почечная
недостаточность) (Клиренс
Креатинина<40)
Anemia (Анемия) Hb <10 гр/л or <2 гр/л ниже
нижней границы
Bone lesions (Штампованные деструкции)


Методы обследования при
множественной миеломе


Диагностические критерии доброкачественной
моноклональной гаммапатии и множественной
миеломы
(International Myeloma Working Group, 2003)


Критерии эффективности лечения
множественной миеломы
(интервал мониторинг 3 месяца)
Полная ремиссия: - Отсутствие парапротеина в сыворотке и моче по
данным иммунофиксации в течение как минимум 6 недель; доля
плазматических клеток в костном мозге менее 5%, отсутствием
клинических проявлений заболевания;
Частичная ремиссия - Снижение уровня парапротеина в сыворотке
более чем на 50% либо снижение экскреции легких цепей
иммуноглобулинов с мочой на 90% (или до уровня менее 200 мг/сут) в
течение 6 нед;
Минимальный эффект Снижение уровня парапротеина в сыворотке на
25—49% либо снижение экскреции легких цепей иммуноглобулинов с
мочой на 50—89% (но сохранение ее на уровне, превышающем 200
мг/сут) в течение 6 нед;
Прогрессирование - Нарастание поражения органов и тканей (несмотря
на лечение); повышение уровня парапротеина в сыворотке более чем
на 25% (более 5 г/л), либо увеличение экскреции парапротеина с
мочой более чем на 25% (более 200 мг/сут), либо увеличение доли
плазматических клеток в костном мозге более чем на 25%
Рецидив - Повторное появление признаков заболевания, включая
повышение уровня парапротеина, определяемого с помощью
иммунофиксационного электрофореза, на фоне полной ремиссии


Макроглобулинемия
(болезнь Вальденстрема)
Заболевание пожилого возраста (>70 лет)
В клинической картине преобладает синдром повышенной
вязкости крови (утомляемость, общая слабость,
кровотечения, нарушения зрения, головная боль и
некоторые другие неврологические симптомы), часто
тромбозы
В большинстве случаев парапротеин, представлен IgM/к
Часто аутоантитела: гемолизины, криоглобулины
Основная масса клеток представлена CD20+ клетками
Лимфоплазмоцитарная инфильтрация костного мозга,
лимфатических узлов, селезенки, печени, нет остеолиза.


Болезни тяжелых цепей

Крайне редкие заболевания с частотой менее 1 случая на
1 млн. человек
Атипичная клиника миеломы и «необычный» парапротеин
Синдром Франклина - отек мягкого неба с инфильтрацией
лимфатических структур
При этом заболевании выявляется парапротеин IgG без
легкой цепи
Болезнь тяжелых цепей альфа проявляется хроническая
диаррея, нарушение всасывания, инфильтрация стенки
кишки – часто требует дифференциального диагноза с
амилоидозом кишки
Парапротеин IgA без легкой цепи


Парапротеины, представленные
фрагментам иммуноглобулинов:
свободные легкие цепи (СЛЦ)
Тяжелая цепь – крайне редко, свободные легкие цепь – часто
В 20% случае всех парапротеинемий – болезнь легких цепей
В 40-60% синтез СЛЦ возникает при множественной миеломе
Концентрации в крови минимальны, цепи быстро
фильтруются в мочу
Синтез поликлональных СЛЦ наблюдается при инфекциях и
системных заболеваниях, могут выявляться в моче
«Несекретирующая» миелома, солитарная плазмацитома
Первичный амилоидоз (AL-амилоидоз)
Изолированная продукция легкой цепи может быть выявлена
только с помощью электрофореза мочи
Основа диагностики – Freelight test (The Binding Site, UK),
который измеряет соотношение свободных цепей


Поражения почек – частое осложнение
при множественной миеломе и болезни
легких цепей
В норме почки являются основным местом катоболизма
легких цепей
СЛЦ фильтруются в первичную мочу (20 кДа) и
разрушаются проксимальными канальцами
На фоне увеличения синтеза СКЦ способности канальцев
быстро превышаются – образование белка Бенс-Джонса
Ко-полимеризация легких цепей, наряду с мономером-
полимеры белка
Агрегация ЛЦ с белком Тамм-Хорсфала (уромукоид) с
закупоркой дистальных канальцев- восковые цилиндры
Агрегация ЛЦ с сывороточным амилоидом А (SAP) –
образование амилоидоза


Незлокачественные парапротеинемии
Характеристик Состояние Разновидности %% при
а процесса выявлении
ПП
Моноклональная Транзиторная парапротеинемия
гаммапатия неясного Доброкачественная парапротеинемия
Пред- значения (МГНЗ) ( без прогресса >5 лет)
заболевание
Асимптоматическая
Без прогрессии (МГНЗ)
(тлеющая) миелома
Парапротеинемическая
IgM>>IgA=IgG
полинейропатия 20%
I тип Моноклональный КГ
Криоглобулинемия II тип Эссенциальный (смешанная)
III тип Поликлональный КГ
Клинические Холодовая гемолитическая
Холодовые агглютинины IgM/каппа
формы анемия (моноклональная)
Амилоидоз AL-амилоидоз
Болезнь отложения легких цепей
Миседематозный лишай
IgG/каппа Редко
(склеромикседема)
POEMS-синдром болезнь Кастелмана Редко


Частота доброкачественной
парапротеинемии резко возрастает
после 50 лет
Парапротеинемия в разных возрастных группах
25-34 лет 0.8%
35-44 лет 2.3%
45-54 лет 5.6%
55-64 лет 6.6%
65-74 лет 7.8%
75 и более 10%


Содержание парапротеина в зависимости от
формы парапротеинемии

<1,5 г/л – «минимоноклон» – 80%
>3 г/л – очевидная парапротеинемия – 20%
>30 г/л – миеломная парапротеинемия – 1-2%

Концентрации до 15 г/л при неонкологических заболеваниях:
Тразиторное носительство после инфекций (<3 гр/л)
Моноклональная гаммапатия невыясненного значения (MGUS)
– стойкое носительство ПП до 30 г/л
Доброкачественная парапротеинемия – без прогресса за 5 лет
Криоглобулинемия, амилоидоз, холодовая гемолитическая
анемияи др. – моноклональные аутоантитела класса IgM


Моноклональная гаммапатия
невыясненного значения (MGUS)
Содержание парапротеина составляет менее 15 г/л, доля
плазматических клеток в костном мозге составляет менее 10%
Встречается часто у 1% людей старше 50 лет и почти у 10%
старше 75 лет.
Риск перерождения доброкачественной моноклональной
гаммапатии в множественную миелому или B-клеточную
лимфому составляет в среднем 1% в год.
Риск перерождения через 10 лет (в процентах) приблизительно
соответствует уровню парапротеина (в г/л): например, при
уровне 20 г/л риск составляет 20%.
Наблюдение должно включать регулярные осмотры с
измерением уровня парапротеина в сыворотке; при низком
риске прогрессирования интервалы между осмотрами должны
составлять 6-12 мес. (ПП<30г/л), при ПП>30г/л – каждые 3
месяца


Отличие «доброкачественной»
парапротеинемии от
гематоонкологических заболеваний

Небольшая концентрация парапротеина
Сохраняется синтез собственых
иммуноглобулинов
Парапротеин состоит из целых иммуноглобулинов
Редко одновременно синтезируется легкая цепь
Нет белка Бенс-Джонса в моче
Моноклональный компонент может быть
представлен аутоантителом – ревматоидным
фактором, холодовым агглютинином или
антинейрональным антителом


Амилоидоз
Отложения кополимеров СЛЦ и SAP (сывороточный амилоид Р)
Окраска Конго-красным и специфическая поляризация при
поляризационной микроскопии
Формируется первичный или AL-амилоидоз (в отличии от АА
амилоидоза при хроническом воспалении
Отложения AL-амилоидоза в почках, сердце, нервах, стенке
кишечника
В образовании амилоидоза участвуют амилоидогенные СЛЦ
лямбда
Существует форма отложений СЛЦ каппа без формирования
амилоидоза – «болезнь отложений легких цепей»


Амилоидоз при парапротеинемиях

Первичный амилоидоз – заболевание
возникающее спонтанно, без клиники
множественной миеломы
При детальном обследовании может выявляться
несекретирующая миелома или солитарная
плазмацитома
Преимущественный синтез легкой цепи лямбда
При классической миеломе амилоидоз
встречается менее чем в 5% случаев


«Доброкачественные парапротеинемии»
- аутоантитела, представленные
моноклональным парапротеином

Ревматоидный фактор (криоглобулинемия 2 типа)
Антитела к миелин-ассоциированному
гликопротеину (MAG) при полиневритах
Холодовые гемолизины и гемагглютинины –
холодовая гемолитическая анемия
При аутоиммунных заболеваниях аутоантитела
обычно представлены моноклональным IgM/kappa
Терапия аутоиммунных заболеваний снижает
концентрации аутоантител и парапротеинов в
сыворотке


Формирование криоглобулинов

Моноклональный синтез молекул иммуноглобулинов
сопровождается недостаточным гликозилированием молекул
Гликозилирование Fc фрагмента необходимо для
поддержания его растворимости в плазме
Повышенная склонность к самоагрегации молекул
парапротеинов, особенно при повышении концентрации белка
в плазме
Криоглобулины оседают на стенках капилляров кожи, нервов и
почек, что приводит к развитию лейкоцитокластического
криоглобулинемического васкулита


Криоглобулинемия
Парапротеины утрачивают гликозилирование, что
делает их менее растворимыми и склонными к
аггрегации
Криоглобулины - моноклональные
иммуноглобулины, преципитирующие при низкой to
Состав: IgG или IgM, нередко с активностью
ревматоидного фактора
Клиника: увеличение вязкости крови, пурпура,
полиневрит и артрит
Обычно на фоне гаммапатии, вирусного
гепатита С, ревматических заболеваний


Выявление криоглобулинов

Смешанная криоглобулинемия возникает на
фоне гематоонкологии, вирусных инфекций
(ВГС) и ревматических заболеваний

50мм

17мм
CRT = 36%

День 1 День 2 ДеньДень 3
3 День 7
CRT=34%


Выявление криоглобулинов
Кровь забирается в теплый шприц и
доставляется в лабораторию в термосе при
температуре 35-37оС
Выпадение КГ занимает 5 дней
Подтверждается обратимость преципитации
В составе КГ измеряется активность РФ
Оценивается клональность криопреципитата
Наличие моноклонального компонента
указывает на смешанный характер КГ


Парапротеинемические полинейропатии

Моноклональная гаммапатия
невыясненного значения Плазмаклеточная дискразия
IgM 60% IgA,IgG – 40% IgG/IgA – 60%, FLC – 30% ,
(криоглобулины 40%) IgM – редко
Легкая цепь – каппа Легкая цепь – лямбда
Аутоантитела– РФ, холодовые Моноклональные
гемолизины, миелин- аутоантитела не выявляются
ассоциированный гликопротеин Заболевания: амилоидоз,
(MAG) , параглобозид (SGPG) болезнь Бенс-Джонса,
Заболевания: б.Вальденстрема, POEMS синдром,болезнь
гемолитическая анемия Кастелмана
криоглобулинемия Тесты: парапротеин
Тесты: парапротеин сыворотки, сыворотки и мочи (БДП),
криоглобулины, РФ, гемолизины, Freelight test, стернальная
СЗ, С4 пункция, биопсия Конго-Рот


Показания для ЭФ белков сыворотки и
мочи и проведения иммунофиксации ИФ

Образование «штампованных» деструкций в костях
Боли в спине
Спонтанные переломы костей
Частые бактериальные инфекции
Полиневрит
Гемолитическая анемия
Кожные высыпания (пурпура) и васкулит
Синдром повышенного СОЭ и другие необъяснимые
лабораторные находки
Нефротический синдром или полиурия
Амилоидное поражение сердца и почек
Эндокринопатия и органомегалия


Частота обследований
(ЭФ белков сыворотки и мочи с ИФ)

Минимоноклон – повторное обследование через 1 год
Моноклональная гаммапатия невыясненного значения с
парапротеинемией до 15 г/л – ежегодное обследование
парапротеинемией до 15-25 г/л – повтор через 3-6 месяцев,
затем ежегодное обследование
парапротеинемией более 25 г/л – обследование каждые 3-6
месяцев
Множественная миелома или ее формы – повтор обследования
каждые 3 месяца до достижения полной ремиссии


Алгоритм обследования пациентов с парапротеином

Аномальный профиль электрофореграммы белков
сыворотки крови пациента без симптомов

Концентрация моноклонального компонента

<15 г/л 15 – 25 г/л 25 г/л

Иммунофиксация аликвоты суточной Рентген плоских костей
мочи Аспирация и биопсия костного мозга
Абдоминальная КТ
Бета-2-микроглобулин
СРБ, исследование суточной мочи
Норма Патология

Норма Патология
Электрофорез белков Направление к
сыворотки крови через гематологу-
3-6 месяцев онкологу Электрофорезбелко Направление к
в сыворотки крови гематологу-
через 3-4 месяца онкологу

Норма

Норма

Электрофорезбелко
в сыворотки крови
через 3-4 месяца

Норма

Ежегодный электрофорез белков сыворотки крови

Нефротический
синдром/амилоидоз ЭФ белков
почек сыворотки
Остеолиз/остеопороз (М-градиент; гипо-
Полиневрит /гипер-гамма)
Анемия/гиперкальциеми
я/лихорадка

Иммунофиксация IgG, A, M κ/λ- свободые
белков сывороки (+IgE) легкие цепи
сыворотки и мочи

IgG,A,M (E,D)+ κ/λ сыв. тольк Только Бета-2
+свободные κ/λ- о свободные микроглобул
моча IgG, A, M κ/λ (моча>1 ин
Количество г/24 ч.)
парапротеина

MGUS Миелома, Тяжел Легких Плаз Несекрети
(< 10 МГ ых цепей/ мо- рующая
г/л) Вальден цепей Амилоид цито миелома
стрема оз ма


Изоэлектрофокусирование
Разновидность ЭФ, при котором вещества разделяются в
зависимости ее изоэлектрической точки
Разделение происходит благодаря присутствию в геле веществ
– амфолитов, имеющих в своем составе разное количество
отрицательно и положительно заряженных групп
Под действием электрического тока амфолиты распределяются
в геле, образуя«градиент рН» - т.е. непрерывную буферную
среду с различными значениями кислотности (например от 3 до
10,5 единиц рН)
Белки мигрируют в ней до своей изоэлектрической точки, в
которой общий заряд молекулы становится нейтральным
Белки накапливаются в этих зонах, образуя тонкие полосы -
буквально «фокусируясь»


Рассеянный склероз
Хроническое воспалительное заболевание ЦНС,
сопровождающееся тканевым воспалением,
ассоциированным с HLA-A3, B7, DRB1, контролируемое
иммуносупрессивной терапией (солюмедрол, ФНГ, НАТ)
Поражает лиц в возрасте 20-40 лет, ♀/♂ - 3/1,
популяционная частота 50-100/100 000, в СПб
зарегистрировано 4000 пациентов
Разнообразная неврологическая симптоматика (неврит
зрительного нерва, миелит, мозжечковые симптомы,
спастичность, недержание и т.д.)
В дебюте ремиттирующая форма 85%, первично-
проградиентная – 15%, в дальнейшем более 50%
реммиттирующих форм трансформируется во вторично-
проградиентное течение


Интратекальное
воспаление в ЦНС
Минимальное повреждение гематоэнцефалического барьера
Выраженный интратекальный гуморальный ответ
Третичную лимфоидная ткань, содержащие Т, В зоны и
фоликуллярные дендритные клетки и астродендроглиальные
клетки (ICAM, VCAM, CXCL13, TNFa), повышение BAFF
(Krumbholz et al., 2006)
В клетки представлены преимущественно CD 19+CD27+ (В
клетки памяти)
В ликворе появляются лимфобластные клетки и плазмациты,
преобладают в ЦНС и коротко живущих плазмабластов CD
19+CD27+CD138+ (Cepok et al., 2005)
Местный синтез антител к «анамнестическим антигенам» - MRZ
реакция (корь 78%, краснуха 65%, варицелла-зостер 55%)


Изменение клональности синтеза и
оликолональный IgG (ОКП)
При РС в цереброспинальной жидкости синтезируется
преимуществено олигоклональный IgG
Местный олигоклональный синтез иммуноглобулинов:
синдром Шегрена - слеза, ревматоидный артрит- СЖ
Синтеза олигоклонального IgG (ОКП) выявляется у
80-95% пациентов с РС
Метод изоэлектрофокусирования Ig для определения
олигоклонального IgG признан наилучшим
лабораторным тестом диагностики РС (Thompson
EJ,Freedman MS, 2006, Polman CH 2005)


Типичный результат обнаружения олигоклонального
IgG в ЦСЖ и сыворотке крови больных

ли

сы

сы

сы
ли

ли
кв

во

во

во
кв

кв
ор

ор

ор
ро

ро

ро
тк

тк

тк
а

а

а


Интерпретация результатов (2)

Тип Л С Состояние

1 П П Норма или острое воспалительное
заболевание
2 О П Высокоспецифичен для РС, чувствительность
достигает 85-95% в дебюте заболевания
3 О >О Характерен для РС, иногда (+) при СКВ,
постинфекционных энцефалитах, саркоидозе
4 О =О Характерен при генерализованных процессов
с вовлечением ГЭБ: боррелиоз,
нейросифилис, Гийен-Барре, ВИЧ, грибковый
менинго-энцефалит
5 М М Моноклональные гаммапатии


Клиническое значение
олигоклонального IgG при РС

Нет зависимости между олигоIgG и тяжестью
заболевания, временем и длительностью обострений
ОлигоIgG является очень стабильным феноменом при РС,
персистирует 7-12 лет, не изменяется при терапии
(Thompson EJ 2006)
Выявление олигоIgM указывает на плохой прогноз (Reske
D 2005)
5-10% пациентов РС негативны по олигоIgG, чаще ППРС,
больные старше, очаги глубже, однако олигоIgG могут
появляться через некоторое время, до 4 лет( Zeman 1996)
При КИС обнаружение олигоIgG - риск РС до 50% (Nilsson
2005) , при идиопатическом поперечном миелите – 40%

лапин

More Related Content

What's hot

Viewers also liked

Similar to лапин

More from pasteurorg

лапин