Successfully reported this slideshow.
Your SlideShare is downloading. ×

صبغ والكشف المجهري للبكتيريا

Ad
Ad
Ad
Ad
Ad
Ad
Ad
Ad
Ad
Ad
Ad
Loading in …3
×

Check these out next

1 of 61 Ad

More Related Content

Viewers also liked (20)

Advertisement

More from Univ. of Tripoli (20)

Recently uploaded (20)

Advertisement

صبغ والكشف المجهري للبكتيريا

  1. 1. ‫صبغ والكشف المجهري للبكتيريا‬ ‫‪Microscopy and Staining‬‬ ‫01‬ ‫دكتور يوسف الشريك‬
  2. 2. ‫فحص الشرائح تحت المجهر‬ ‫•‬ ‫• الهدف من فحص الشرائح تحت المجهر: -‬ ‫• للكشف عن الميكروبات التي ال تري بالعين المجردة لضآلة حجمها:‬ ‫1. تعتبر خلية البكتيريا من نوع وحيدة الخلية ‪ prokaryotic‬بحيث أنها أصغر‬ ‫من نوع متعددة الخاليا ‪.Eukaryotic‬‬ ‫2. للكشف عن الخاليا البكتيرية تحت المجهر الضوئي بالطرق التالية.-‬ ‫• طريقة ‪Wet mount‬‬ ‫• صبغ اللطخة البكتيرية، وتعتبر هذه الطريقة أكثر استعماال، للكشف عن‬ ‫البكتيرية تحت المجهر، ومن عيوبها يمكن أنها تبين البكتيريا الحية‬ ‫والميتة، ومن أهم مميزاتها يمكن التفريق بها بين أشكال البكتيريا‬ ‫عصوية أو كروية وتنظيماتها (شكل )وغيرها، ويمكن بهذه الطريقة‬ ‫التفريق بين البكتيريا الموجبة، أو السالبة لصبغة الجرام‬ ‫3. للكشف على خاليا البكتيرية تحت المجهر يستعمل عدسة مكبرة مع زيت‬ ‫خاص بالكشف ‪.Oil immersion‬‬
  3. 3. ‫النواة غير الحقيقية‬ • pro·kar·y·ote • [proh-kar-ee-oht, -ee-uh t] Show IPA • nounany cellular organism that has no nuclea r membrane, no organelles inthe cytoplasm e xcept ribosomes, and has its genetic material in theform of single continuous strands formi ng coils or loops, characteristicof all organism s in the kingdom Monera, as the bacteria and blue-green algae.
  4. 4. ‫النواة الحقيقية‬ • Eukaryote • An organism whose cells contain a nucleus surrounded by me mbrane and whose DNA is bound together by proteins (histo nes)into chromosomes • The cells of eukaryotes also contain anendoplasmic reticulum a nd numerous specialized organelles not present in prokaryotes, especially mitochondria, Golgi bodies, and lysosomes. • The organelles are enclosed in a threepart membrane(called a unit membrane) consisting of a lipid layer sandwichedbetween two protein layers. • All organisms except for bacteria andarchaea are eukaryotes. C ompare prokaryote.
  5. 5. ‫هناك طريقتان لتجهيز الكشف عن البكتيرية الحية وهما:-‬ ‫•‬ ‫طريقة الرطبة أو المبتلة ‪.Wet mount‬‬ ‫1.‬ ‫طريقة النقطة المعلقة ‪Hanging drop‬‬ ‫2.‬ ‫• طريقة الرطبة أو المبتلة ‪ Wet mount‬تطبق هذه الطريقة لدراسة شكل وترتيب‬ ‫الخاليا البكتيرية، واختبار قدرة البكتيريا على الحركة، ومن ها الطرق التالية:-‬ ‫1. ينقع التبن في 006 مل من الماء، لمدة أسبوع قبل إجراء التجربة، مع التخلص من‬ ‫الفقاقيع الهوائية.‬ ‫2. يعمل إطار مربع في منتصف الشريحة النظيفة، من الهالم النفطي ، بحيث تكون‬ ‫أبعاده، نفس أبعاد الشريحة الزجاجية الرقيقة.‬ ‫3. توضع قطرة واحدة، من محلول نقع التبن، في منتصف الشريحة الزجاجية الرقيقة.‬
  6. 6. ‫تقلب الشريحة الزجاجية، التي تحتوي على اإلطار ، ويلصق‬ ‫4.‬ ‫األخير بغطاء الشريحة الزجاجية الرقيق، المحتوية على قطرة‬ ‫ماء التبن بحذر.‬ ‫تقلب الشريحة بحيث يصبح غطاء الشريحة الزجاجية إلى‬ ‫5.‬ ‫أعلى.‬ ‫توضع الشريحة تحت المجهر، لدراستها، مع تقليل كمية‬ ‫6.‬ ‫الضوء الساقط ،على العدسة العينية.‬ ‫تحديد األحياء الدقيقة، في العينة بعدسة قوتها (01 ‪ ، ) X‬ثم‬ ‫7.‬ ‫بعدسة قوتها (04 ‪ ، ) X‬مع تعديل قوة اإلضاءة، عند كل‬ ‫تغيير العدسة .‬ ‫يالحظ وجود أنواع مختلفة، من األحياء الدقيقة، في عينة‬ ‫8.‬ ‫التبن، مثل: وجود بكتيريا عصوية، أو كروية وغيرها، كما هو‬ ‫موضح في جدول (2 ) و ( 3 ) وشكل (34 ).‬
  7. 7. ‫• طريقة النقطة المعلقة الختبار قدرة البكتيريا على الحركة‬ ‫• هدف ومبادئ هذه الطريقة مثل الطريقة الرطبة، ومن أهم‬ ‫مميزاتها التالية:-‬ ‫1. مراقبة حركة البكتيريا في نقطة معلقة داخل تجويف‬ ‫زجاجي مغلق‬ ‫2. نادراً ما يحدث جفاف للشريحة.‬ ‫3. بقاء الخاليا في حالة نشطة لمدة أطول من الطريقة‬ ‫الرطبة.‬ ‫طريقة العمل‬ ‫1. تنظف الشريحة ذات التجويف تنظيفا ً جيداً‬ ‫‪ Depression Slide‬مع غطائها بالماء الساخن‬ ‫والصابون إلزالة المواد الدهنية العالقة بها.‬
  8. 8. ‫2. توضع أربعة نقط من الماء أو الفازلين أو الهالم النفطي‬ ‫على كل زاوية من غطاء الشريحة بواسطة ناقل البيئة.‬ ‫3. توضع قطرة من البيئة البكترية في وسط غطاء الشريحة‬ ‫الزجاجية الرقيقة.‬
  9. 9. ‫4. توضع الشريحة على غطاء الشريحة الزجاجية الرقيقة ،‬ ‫بحيث يكون التجويف مقابال للقطرة في وسط التجويف،‬ ‫بحيث يكون الغطاء ملتصقا مع الشريحة.‬ ‫5. تقلب الشريحة بسرعة مع الحفاظ على وجود نقطة البيئة‬ ‫البكتيرية في منتصف التجويف.‬
  10. 10. ‫6. تفحص النقطة المعلقة تحت المجهر، مستعمال العدسة‬ ‫الصغيرة القوة ، ثم يخفض المكثف قليال، ويقفل الحجاب‬ ‫جزئيا ً لتقليل اإلضاءة للتمكن من رؤية العينة بوضوح.‬ ‫7. تعدل حافة الشريحة لوضع حافة النقطة في وسط مجال‬ ‫المجهري.‬
  11. 11. ‫8. تغير العدسة الصغيرة إلى كبيرة القوة، ثم إلى الزيتية، بعد‬ ‫وضع نقطة زيت السيدر، على غطاء الشريحة.‬ ‫9. تفحص حافة العينة، مع تحريك الضابط الدقيق ببطء، مع‬ ‫تعديل اإلضاءة، بواسطة المكثف، حتى ترى البكتيريا‬ ‫بشكل واضح.‬ ‫01.الحظ حركة البكتيريا، عند حافة النقطة المعلقة.‬ ‫11.تدون المالحظات برسم شكل البكتيرية، وطريقة تجميع‬ ‫الخاليا البكتيرية ونوعية حركتها.‬
  12. 12. ‫طريقة صبغ البسيطة ‪Simple Stain‬‬ ‫• طريقة تحضير اللطخة البكتيرية‬ ‫• الهدف من تحضير اللطخة:-‬ ‫1. هو تحضير غشاء رقيق متجانس من البكتيريا النامية على‬ ‫شريحة زجاجية، ثم إضافة صباغات معينة لصبغها والكشف‬ ‫عليها تحت المجهر.‬ ‫2. ومن المعروف بأن البكتيريا عديمة اللون، ولتحديد نوعية‬ ‫خالياها، يجب إجراء عملية صبغها بأحد الطريقة التالية:-‬ ‫3. تحضير اللطخة البكتيرية.‬ ‫4. إضافة بعض األصباغ إلى اللطخة لتحديد نوعيتها من ناحية‬ ‫سالبة أو موجبة لصبغة الجرام.‬
  13. 13. ‫طريقة تحضير اللطخة البكتيرية‬ ‫تنظف الشريحة الزجاجية جيدا ، بالماء والصابون،‬ ‫1.‬ ‫وتجفف.‬ ‫تمسك الشريحة من إحدى طرفيها؛ وترسم دائرة قطرها‬ ‫2.‬ ‫5.1 سم، على الوجه األسفل من الشريحة.‬ ‫توضع قطرة من الماء على وجه الشريحة المرسوم‬ ‫3.‬ ‫عليها الدائرة بداخلها، لغرض عمل لطخه بكتيرية.‬ ‫تعقم عقدة الحلقية( اللوبي) ، في نهاية اإلبرة الناقلة‬ ‫4.‬ ‫،على لهب موقد بنزن،حتى درجة االحمرار،وتبرد لمدة‬ ‫01 ثواني.‬ ‫تؤخذ كشطة من البيئة البكتيرية، بعقدة اإلبرة المعقمة.‬ ‫5.‬ ‫خلط الكشطة بالماء، داخل الدائرة على سطح.‬ ‫6.‬
  14. 14. ‫7. بعد ذلك عقم العقدة المعدنية، مرة أخرى.‬ ‫8. تعمل لطخه بكتيرية من البيئة السائلة، على شريحة‬ ‫أخرى، بحيث يكون حجمها العقدة المعدنية مرتين إلى‬ ‫ثالثة مرات( وفي كل مرة يجب تعقيم العقدة وسلكها)،‬ ‫وتنقل إلى داخل الدائرة، مع توزيعها فيها توزيعا جيدا.‬ ‫9. تعقم الحلقة مرة أخرى.‬ ‫01.تترك اللطخة لتجف، عند درجة حرارة الغرفة، دون نفخ‬ ‫أو إمرار الهواء عليها.‬
  15. 15. ‫11.تثبت اللطخة بإمرار الشريحة على اللهب مرتين أو ثالثة‬ ‫مرات.‬ ‫شكل (44) طريقة تحضير اللطخة البكتيرية على شريحة زجاجية من بيئة سائلة وبيئة صلبة‬
  16. 16. ‫• صبغ اللطخة البكتيرية:‬ ‫• تعتبر الصباغات ‪ Dyes‬التي تصبغ البكتيريا مواد كيميائية،‬ ‫أما أن تكون حامضية مثل :-‬ ‫1. ‪ Fuchsin Acid‬و ‪ Eosin‬التي تتفاعل مع المكونات‬ ‫القاعدية في الخلية مثل:- سيتوبالزم،‬ ‫2. أو قاعدية مثل سفرانين أو البلورات البنفسجية ‪Crystal‬‬ ‫‪violet‬التي تتفاعل مع مكونات الخلية الحامضية.‬ ‫• يتم تحضير اللطخة كما هو موضح في الشكل(44 )‬
  17. 17. ‫1. وضع الشريحة على حامل الصبغ (شكل 54)، أو تمسك بملقاط معدني.‬ ‫شكل(54) كيفية إضافة الصبغة إلى اللطخة البكتيرية‬ ‫2. تغمر اللطخة بأزرق المثيلين، لمدة 03 – 06 ثانية‬ ‫3. تغسل الشريحة بالماء المقطر، بعناية إلزالة الصبغة الزائدة،‬ ‫بواسطة أنبوب قنينة الماء المقطر.‬ ‫4. تجفف اللطخة برفق، بورق ماص للرطوبة، وتترك لتجف.‬
  18. 18. ‫فحص اللطخة تحت المجهر‬ ‫•‬ ‫تفحص اللطخة المصبوغة،‬ ‫•‬ ‫تحت المجهر بواسطة عدسة‬ ‫قوتها 01 ‪ ، X‬وبعدها تفحص‬ ‫بالعدسة الزيتية التي قوتها‬ ‫001‪.X‬‬ ‫عند الفحص بالعدسة الشيئية‬ ‫•‬ ‫(الزيتية)؛ يوضع الزيت‬ ‫مباشرة على اللطخة، دون‬ ‫غطاء زجاجي رقيق.‬ ‫تسجل المالحظات مع الرسم أو‬ ‫•‬ ‫التصوير، لكل ما يشاهد تحت‬ ‫المجهر( شكل 64).‬
  19. 19. ‫• تجفف الزيت من العدسة الشيئية، بأوراق خاصة بذلك.‬ ‫• يرجع المجهر داخل صندوقه، أو المكان المناسب له.‬ ‫• تنظف الشرائح جيدا، ويتخلص الموجود الزيت من عليها،‬ ‫وتحفظ في الصندوق المخصص لحفظها .‬
  20. 20. ‫• صبغ البكتريا بصبغة جرام‬ ‫• اكتشف هذه الطريقة هانس جرام في 4881، عندما الحظ أن‬ ‫البكتيريا تفقد لون الصبغة، عند التخلص من الزائد منها. وتستعمل‬ ‫هذه الطريقة في تشخيص وتصنيف البكتيريا، وتقسيمها إلى‬ ‫مجموعتين، سالبة ، وموجبة لصبغة الجرام. ويرجع الفرق بين‬ ‫الصفتين الموجبة والسالبة، لمكونات الجدار الخلوي البكتيري.‬ ‫• وتعتمد هذه الطريقة على أربعة خطوات هي:-‬ ‫استخدام الصبغة الرئيسية ( ‪ ،)Crystal violet‬لصبغ جميع البكتيريا‬ ‫1.‬ ‫باللون البنفسجي.‬ ‫يستخدم األيودين ‪ ،Iodine‬لزيادة الروابط األيونية بين الصبغة الرئيسية‬ ‫2.‬ ‫والبكتيريا.‬ ‫يستخدم الكحول األثيلي، أو األسيتون كمادة مزيلة للصبغة من بعض‬ ‫3.‬ ‫البكتيريا، بينما تحتفظ البعض منها بلونها.‬ ‫تستخدم مادة السفرانين ‪ ،Safranin‬في صبغ البكتيريا التي فقدت صبغتها‬ ‫4.‬ ‫بالكحول أو األسيتون، باللون األحمر.‬
  21. 21. ‫• تسمممى البكتيريمما التممي فقممدت لممون الصممبغة الرئيسممية بكتيريمما‬ ‫سمممالبة لصمممبغة الجمممرام، أمممما التمممي احتفظمممت بلمممون الصمممبغة‬ ‫الرئيسية تعرف باسم بكتيريا الموجبة لصبغة الجرام.‬ ‫• نظرية آلية صبغة الجرام :‬ ‫تعتمد هذه النظرية على النقاط التالية:-‬ ‫•‬ ‫1. تختلف البكتيريا لتقبلها الصبغة الرئيسية والصبغة‬ ‫الثانوية.‬ ‫2. جدار الخلية الموجبة لصبغة الجرام؛ أكثر سمكا‬ ‫من جدار خلية البكتيريا السالبة لصبغة الجرام ،‬ ‫من حيث التركيب الكيميائي.‬
  22. 22. ‫• يحتوي جدار البكتيريا الموجبة لصبغة الجرام ،على طبقة‬ ‫ً‬ ‫سميكة من بيبتدوجلوكان ، أكثر سماكة من جدار البكتيريا‬ ‫السالبة لصبغة الجرام أنظر الشكل (74).‬
  23. 23. ‫• وبناء على النظرية، يمكن تفسير آلية الصبغة السالبة أو‬ ‫الموجبة لصبغة الجرام كالتالي:-‬ ‫• يحتوي جدار البكتيريا الموجبة لصبغة الجرام، على طبقة‬ ‫سميكة من بيبتيدوجلوكان ( متعدد السكريات مرتبطة مع‬ ‫البيبتيدات)، التي يسبب لها الكحول إزالة وانكماش جدارها،‬ ‫بحيث يخفض من معدل فقد الصبغة الرئيسية، ومن ثم تصبغ‬ ‫باللون األساسي البنفسجي.‬ ‫• يحتوي الغشاء الخارجي، لجدار بكتيريا السالبة لصبغة الجرام،‬ ‫على طبقات محتوية على البروتين، ومتعدد السكريات ودهون‬ ‫مرتبطة بعديد السكريات، وطبقة غير سميكة من‬ ‫بيبتيدوجلوكان، محاطة بغشاء خارجي، ومن تم يقوم الكحول‬ ‫بإزالة، أو إذابة الدهون، مما يزيد من فقد الصبغة األساسية ،‬ ‫ويتلون جدارها بلون الصبغة الثانوية (األحمر).‬
  24. 24. ‫• طريقة العمل‬ ‫• يجب تحضير اللطخة البكتيرية من بيئة حديثة عمرها أقل من 42‬ ‫ساعة.‬ ‫– تنظف ثالث شرائح تنظيفا جيداً.‬ ‫– يرسم دائرة على السطح السفلي، على كل شريحة من الشرائح‬ ‫الثالثة ،مع كتابة أسماء البيئات على كل منها.‬ ‫– تحضر لطخة لكل من البيئات، بالطريقة التي سبق شرحها.‬ ‫• طريقة الصبغ وهي كاآلتي:-‬ ‫1. تغمر اللطخة بصبغة ‪ ،Crystal violet‬وتتركها لمدة نصف‬ ‫دقيقة.‬ ‫2. تغسل الشريحة بعناية بالماء المقطر، لمدة 2 ثانية، بطريقة غير‬ ‫المباشرة فوق اللطخة ( عدم تسليط الماء مباشرة على اللطخة).‬
  25. 25. ‫بدون تجفيف الشريحة، تغمر اللطخة بمحلول اليود لمدة‬ ‫3.‬ ‫دقيقة.‬ ‫بدون غسيل الشريحة، يضاف 59% كحول إثيلي إلى‬ ‫4.‬ ‫الشريحة، ويترك لينساب على اللطخة، لمدة ما بين‬ ‫01- 02 ثانية، إلى حين توقف خروج كميات كبيرة من‬ ‫الصبغة األساسية (غالبا بعد بضع ثوان)، وتعتمد مدة إزالة‬ ‫الكحول على العوامل كثيرة، أهمها سمك اللطخة، والخبرة‬ ‫العملية في تحضير اللطخة وصبغها.‬ ‫تغسل الشريحة مباشرة بالماء المقطر، لمدة دقيقتين.‬ ‫5.‬ ‫تضاف الصبغة الثانوية السفرانين، وتترك لمدة 02 ثانية.‬ ‫6.‬ ‫تغسل الصبغة الزائدة بالماء المقطر، لمدة 2 ثانية، وتجفف‬ ‫7.‬ ‫بورق نشاف.‬ ‫تترك لتجف.‬ ‫8.‬
  26. 26. ‫• تفحص الشريحة بالمجهر تحت العدسات المختلفة، وتسجل‬ ‫المالحظات (الشكل 84).‬
  27. 27. ‫• الصبغة السالبة ‪Negative Stain‬‬ ‫• يمكن استخدام الصبغ السالب لمعرفة شكل، وترتيب الخاليا‬ ‫البكتيرية، التي ال تتحمل التثبيت الحراري، الذي يشوه خالياها،‬ ‫ولصبغ السبورات البكتيرية ( الحافظة) ‪.Capsule‬‬ ‫• في حالة إجراء الصبغ السالب، تظهر البكتريا واضحة جدا،‬ ‫بالنسبة للخلفية الملونة التي حولها.‬ ‫• تستعمل األصباغ الحامضية، التي ال تستطيع صبغ مكونات‬ ‫الخلية البكتيرية، ولكنها تصبغ الخلفية حول الخلية فقط، بحيث‬ ‫تصبح الخلفية ملونة ،وفي نفس الوقت ال تتلون الخلية، بحيث‬ ‫تظهر البكتيريا كأجسام شفافة، في محيط معتم.‬
  28. 28. ‫خطوات العمل‬ ‫•‬ ‫تستعمل الشرائح النظيفة، والخالية من‬ ‫•‬ ‫المواد الدهنية.‬ ‫توضع قطرة صغيرة من الصبغة‬ ‫•‬ ‫الحامضية، النيكروسين، على إحدى‬ ‫طرفي الشريحة.‬ ‫تؤخذ عينة من المزرعة الصلبة، ملء‬ ‫•‬ ‫العقدة المعدنية ، مع قطرة من صبغة‬ ‫نيكروسين، وتترك لتجف بدون توزيعها.‬ ‫تلمس القطرة بأحد طرفي شريحة أخرى‬ ‫•‬ ‫، وتحرك األخيرة يمينا ً ويساراً، يجب‬ ‫توزع البكتيريا والصبغة،لتغطي اللطخة‬ ‫ً‬ ‫بالتدريج من لون المعتم إلى لون‬ ‫الرمادي (94).‬
  29. 29. ‫• تترك اللطخة لتجف عند درجة حرارة الغرفة.‬ ‫• تفحص الشريحة تحت المجهر شكل (05).‬ ‫• تغسل الشرائح، وتخلص من زيت من العدسة الشيئية‬ ‫• تحفظ األدوات في مكانها المناسب بعد تنظيفها جيدا.‬
  30. 30. ‫• صبغ الثابت للحامض ‪Acid-fast stain‬‬ ‫‪،Differential stain‬‬ ‫• تستخدم طريقة الصبغ التفريقية‬ ‫في تحديد قدرة الخاليا البكتيرية من جنس‬ ‫‪،Mycobacterium tuberculosis‬والتي تسبب مرض‬ ‫السل، و ‪M. leprae‬التي تسبب مرض الجذام، واللتان‬ ‫لهما القدرة على الحفاظ على الصبغة الرئيسية، عند‬ ‫معالجتها بالكحول األثيلي، وحامض الكبريتيك،‬ ‫• وقد وجد بأن أغلبية البكتيريا تفقد الصبغة الرئيسية، عند‬ ‫عائلتي‬ ‫أعضاء‬ ‫عدا‬ ‫بالكحول،‬ ‫معاملتها‬ ‫‪Mycobacteriaceae‬و ‪ Norcardiaceae‬من الرتبة‬ ‫‪،Actinomycetales‬اللتان تحتوي جدران خالياهم على‬ ‫مادة دهنية تشبه الشمع (‪ ،)Mycotic acid‬والتي ال تقبل‬ ‫جدرانها الصبغ من معظم الصبغات.‬
  31. 31. ‫• طريقة العمل‬ ‫• وتعتمد طريقة )‪(Ziehl-Neelsen method‬بغمر اللطخة‬ ‫كاربولفوكسين‬ ‫باسم‬ ‫تعرف‬ ‫بصبغة‬ ‫البكتيرية،‬ ‫‪ ،Carbolfuchsin‬لتسهيل دخول الصبغة في البكتيريا، ويتم‬ ‫بعد ذلك غسل اللطخة بمحلول الحامض – الكحول األثيلي،‬ ‫إلزالة الصبغة من جميع الخاليا، ما عدا المقاومة لفعل ذلك‬ ‫المحلول، وفي نفس الوقت، تستخدم صبغة أزرق المثيلين، بدال‬ ‫من الصبغة األولى .‬ ‫• هذا وقد وجد أن صبغة كاربولفوكسين أكثر ذوبانا ، في حامض‬ ‫الكربوليك( الفينول) من الماء، وتذوب أيضا ً في الدهون أكثر‬ ‫من الحامض – الكحول األثيلي، ويعطي كاربولفوكسين اللون‬ ‫األحمر لمادة الدهن.‬
  32. 32. ‫• وتتم خطوات العمل كالتالي:-‬ ‫تحضر اللطخة البكتيرية ، والتي أخذت من بيئات‬ ‫1.‬ ‫‪ Mycobacterium phlei‬و .‪ ، .E. coli‬وتجفف هوائيا ً‬ ‫تضع الشريحة المحتوية على اللطخة، على حامل ‪،Rack‬فوق‬ ‫2.‬ ‫حوض الغسيل.‬ ‫توضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح، لتثبيت الشريحة فوق‬ ‫3.‬ ‫الحامل.‬ ‫تضاف كميات كبيرة من صبغة كاربولفوكسين.‬ ‫4.‬ ‫تسخن اللطخة والصبغة على بخار مائي يغلى لمدة 5 دقائق ،‬ ‫5.‬ ‫ويضاف مزيدا من الصبغة، كلما تطلب األمر ذلك، وال يسمح‬ ‫بغليان الصبغة.‬ ‫يتخلص من ورق الترشيح، وتغسل الشريحة جيداً بالماء‬ ‫6.‬ ‫المقطر.‬ ‫ً‬
  33. 33. ‫7. يتخلص من الصبغة، بمعالجة اللطخة المصبوغة، بمحلول‬ ‫الحامض – الكحول األثيلي لمدة 51 – 02 ثانية.‬ ‫8. تغسل بالماء المقطر.‬ ‫9. تضاف صبغة أزرق المثيلين، وتترك لمدة نصف دقيقة.‬ ‫01.تغسل الشريحة بالماء المقطر، وتجفف بورق الترشيح.‬ ‫11.تحضر شريحة أخرى، من البيئة البكتيرية الثانية بنفس‬ ‫الطريقة.‬ ‫21.تفحص الشريحتان تحت المجهر، وتدون المالحظات‬ ‫31.البكتيريا التي تصبغ باللون األحمر، موجبة لصبغ البكتيريا‬ ‫الثابت للحامض، أما البكتيريا التي تصبغ بلون األزرق‬ ‫فهي سالبة لصيغ البكتيريا الثابت للحامض.‬
  34. 34. ‫• صبغ الكبسوالت ‪Capsule Stain‬‬ ‫• يمكن استخدام الصبغ السالب، لتوضيح الكبسولة ( عندما يكون‬ ‫بيضاويا ً أو دائريا ً) حول الخلية البكتيرية، والذي يلتصق بسطحها،‬ ‫مكونا ً طبقة لزجة، وتعطي طبقة مخاطية في حالة كون الكبسولة‬ ‫غير منتظمة الشكل.‬ ‫• من أهم أساسيات لصبغ الكبسوالت البكتيرية ما يلي:-‬ ‫من الصعب صبغ الكبسوالت البكتيرية، ألنها تتكون من عديد‬ ‫1.‬ ‫السكريات، وعديد البيبتيدات.‬ ‫معظم الكبسوالت ال تذوب في الماء، وال تحمل شحنات كهربائية،‬ ‫2.‬ ‫وبسبب لذلك فإن هذه الصبغات البسيطة ال ترتبط معها.‬ ‫أغلبية طرق الصبغ التي تستعمل في الكشف عن الكبسولة؛ تصبغ‬ ‫3.‬ ‫البكتيريا والوسط المحيط بها، وال تصبغ الكبسولة.‬ ‫ال تعامل اللطخة بالحرارة لتثبيتها، ألن الحرارة تسبب فقدان‬ ‫4.‬ ‫الكبسولة.‬
  35. 35. ‫طريقة العمل:‬ ‫•‬ ‫تنظف الشريحة بمطهر وتجفف بالهواء، ثم تمسك ، من أحد‬ ‫•‬ ‫زواياها.‬ ‫‪ ،K. pneumoniae‬بواسطة‬ ‫تؤخذ عينة من بيئة بكتيرية‬ ‫•‬ ‫عقدة الناقل، وتضع على سطح الشريحة لتجهيز اللطخة.‬ ‫تترك اللطخة لتجف بالهواء، بدون استعمال الحرارة.‬ ‫•‬ ‫تغمر اللطخة بصبغة ‪ crystal violet‬لمدة 5 – 01 دقائق.‬ ‫•‬ ‫تغسل اللطخة بلطف بمحلول كبريتات النحاس 4‪ ،CuSO‬للتخلص‬ ‫•‬ ‫من الصبغة ‪ crystal violet‬الزائدة .‬ ‫تجفف محتويات الشريحة.‬ ‫•‬ ‫تفحص الشريحة تحت المجهر، وتالحظ الخاليا لونها بنفسجي،‬ ‫•‬ ‫محاطة بهالة زرقاء باهتة اللون، أو عديمة اللون، ويكون لون‬ ‫الخلفية( األرضية) بنفسجي لذلك أيضا ً (الشكل 25).‬
  36. 36. ‫صبغ األبواغ( السبورات) الداخلية‬ ‫•‬ ‫يستخدم الصبغ السبورات ، لتحديد مواقع األبواغ، داخل خلية‬ ‫•‬ ‫البكتيرية، ومن أكثر األنواع المكونة لألبواغ الداخلية هي‬ ‫بكتيريا كلوستيريديوم، والباسيليس، لألسباب التالية:-‬ ‫األبواغ الداخلية غير نشطة، ومقاومة للظروف غير مناسبة‬ ‫•‬ ‫للبكتيريا، سواء من الحرارة أو الكيماويات ، أو أي ظروف بيئة‬ ‫أخرى.‬ ‫األبواغ ليست وسيلة للتكاثر، وتبقى البكتيريا في حالة سكون،‬ ‫•‬ ‫طالما استمرت الظروف غير مواتية.‬ ‫تستخدم األبواغ في عملية تصنيف البكتيريا.‬ ‫•‬ ‫األبواغ غير منفذة لمعظم الصبغات.‬ ‫•‬ ‫تستعمل الحرارة لتثبيت الصباغات.‬ ‫•‬
  37. 37. ‫شكل(35) الحظ ‪DNA‬محاط بغالف البوغ. ويظهر البوغ داخل الخلية الخضرية‬ ‫وسوف تفقد الخلية جزء الخضري منها مع مرور الوقت‬
  38. 38. ‫• طريقة العمل‬ ‫1. تنظف شريحتان زجاجيتان.‬ ‫2. جهز لطخه من بيئتين بكتيريتين، لباسيليس سابتيلس،‬ ‫عمر أحدها 81 – 42 ساعة، واألخرى 27ساعة،‬ ‫3. تجفف بالهواء، وتثبت بالحرارة.‬ ‫4. توضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح على اللطخة،‬ ‫قبل إضافة صبغة أخضر مالكايت، لمنع التبخر الكامل‬ ‫للصبغة، وجفافها قبل تسربها إلى األبواغ، وعليه في‬ ‫جميع األحوال، يساعد التسخين على تمدد غشاء‬ ‫األبواغ ، ويسمح بدخول الصبغة إلى الداخل، وتبقى‬ ‫الصبغة داخل البوغ بالتبريد.‬
  39. 39. ‫تغمر اللطخة بصبغة أخضر مالكايت ‪MALACHITE‬‬ ‫•‬ ‫‪.GREEN‬‬ ‫تسخن على البخار لمدة 5 دقائق ، ويضاف مزيد من‬ ‫•‬ ‫الصبغة، كلما أحتاج األمر لذلك.‬ ‫ترمى الورقة في مكان مناسب ، وتغسل اللطخة بالماء‬ ‫•‬ ‫المقطر جيداً.‬ ‫تضاف صبغة السفرانين لمدة نصف دقيقة.‬ ‫•‬ ‫تغسل الشريحة بالماء المقطر وتجفف.‬ ‫•‬ ‫تفحص الشرائح تحت المجهر( شكل 45).‬ ‫•‬
  40. 40. ‫• تقارن النتائج مع شرائح الجاهزة، ويالحظ مواقع األبواغ‬ ‫في الخاليا المختلفة شكل(55) .‬ ‫شكل (45) طريقة صبغ السبورات، ومثال على مواقع المختلفة للسبورات كما‬ ‫هو موضحه في الدائرة أسفل الشكل .‬
  41. 41. ‫• صبغ أسواط البكتيرية‬ ‫• من أهم أهداف صبغ األسواط ما يلي:-‬ ‫1. مشاهدة األسواط.‬ ‫2. ترتيب األسواط وموقعها.‬ ‫3. تستعمل األسواط للتعرف على أنواع البكتيريا.‬ ‫4. ومن أهم أساسيات صبغ أسواط البكتيرية التالية:-‬ ‫5. تعتبر األسواط رفيعة جدا، وسريعة الكسر، ال يمكن صبغها‬ ‫بالصباغات العادية.‬ ‫6. تحتاج األسواط إلى تقنية وصبغة معينة، لتزيد من قطرها.‬ ‫7. يمكن مالحظة حركة البكتيريا، عن طريقة القطرة المعلقة، أو‬ ‫عن طريق صبغ األسواط،.‬
  42. 42. ‫طريقة العمل:‬ ‫•‬ ‫يجب أخذ الحيطة والعناية الفائقة؛ لمنع فقد األسواط ، بتنظيف‬ ‫•‬ ‫الشرائح جيداً، مع تداول البيئة البكتيرية بعناية كبيرة.‬ ‫تؤخذ قطعة من وسط بيئة اآلجار الصلبة ، حيث تنمو البكتيريا،‬ ‫•‬ ‫مع عدم لمس المزرعة باليد.‬ ‫توضع قطعة اآلجار برفق على الشريحة بحيث تكون مواجهة‬ ‫•‬ ‫للنمو، ترفع تلك القطعة وتعاد إلى الطبق.‬ ‫تترك البكتيريا الملتصقة بالشريحة.‬ ‫•‬ ‫تجفف بالهواء، دون استعمال الحرارة.‬ ‫•‬ ‫تغمر الشريحة بحامض التانيك ‪ Tannic acid‬المثبت لمدة‬ ‫•‬ ‫عشر دقائق.‬ ‫تغسل الصبغة برفق بالماء المقطر.‬ ‫•‬
  43. 43. ‫تغمر الشريحة بصبغة كاربولفوكسين ‪،Carbolfuchsin‬‬ ‫•‬ ‫لمدة خمسة دقائق.‬ ‫تغسل برفق بالماء المقطر.‬ ‫•‬ ‫تترك اللطخة تجف بالهواء ،وبورق الترشيح.‬ ‫ً‬ ‫•‬ ‫تفحص الشريحة تحت المجهر وتسجل المالحظات(65).‬ ‫•‬
  44. 44. ‫• حركة البكتيريا في أوساط النمو شبه صلبة‬ ‫• تستخدم األوساط النمو شبه صلبة، المحتوية على كميات قليلة من‬ ‫مادة اآلجار ويحقن الوسط النمو بالبكتيريا المراد اختبار حركتها،‬ ‫داخل الوسط النمو، بواسطة إبرة حقن(بدون عقدة في نهايتها‬ ‫شكل75) في أنابيب النمو ، وتحضن األنابيب لمدة زمنية معينة،‬ ‫وتؤخذ المالحظات مباشرة بمجرد المالحظة التغيرات التي حصلت‬ ‫في الوسط الغذائي .‬ ‫شكل(75) إبرة الحقن الحظ أنه ال توجد في نهايته حلقة دائرية‬
  45. 45. ‫• تسمح التركيزات القليلة من اآلجار في الوسط الغذائي،‬ ‫بتحرك البكتيريا بحركة محدودة من خالل منطقة الطعن،‬ ‫وتحدد الحركة نتيجة حدوث تفرع النمو في منطقة‬ ‫الطعن، ويمكن إضافة صبغة معينــــة مثل أمالح‬ ‫تترازيوليوم)‪ ، Tetrazolium salt (TTC‬لمالحظة تفرع‬ ‫النمو بلون األحمر الفاتح (فجلي اللون).‬ ‫يجب حقن اإلبرة بطريقة مستقيمة، وتسحب بنفس‬ ‫•‬ ‫الطريقة، للحصول على نتائج جيدة (شكل85).‬
  46. 46. ‫• اختبار قدرة البكتيريا على الحركة‬ ‫• ‪Motility Determination‬‬ ‫تستخدم طريقة اختبار قدرة البكتيريا على الحركة، للتعرف على‬ ‫•‬ ‫بكتيريا مجهولة النوع ( الجنس)، حيث يجرى لها اختبار على ذلك،‬ ‫ويتم مالحظة مدى حركتها خالل الحقل المجهري، وهناك نوعان من‬ ‫الحركة وهما:‬ ‫– حركة حقيقة فعلية ( الحركة من مكان إلى آخر).‬ ‫– حركة كاذبة على شكل اهتزازات أو ارتجاج (حركة برا ونية).‬ ‫توجد عدة طرق يمكن بها معرفة قدرة البكتيريا على الحركة وهي‬ ‫•‬ ‫كاآلتي:-‬ ‫‪Wet-Mount‬‬ ‫الطريقة الرطبة‬ ‫•‬ ‫‪Hanging Drop‬‬ ‫طريقة النقطة المعلقة‬ ‫•‬ ‫‪Culture Method‬‬ ‫الطريقة المزرعية‬ ‫•‬ ‫لقد سبق شرح طريقة الرطبة أو المبتلة وطريقة النقطة المعلقة‬ ‫•‬
  47. 47. ‫• تسمح التركيزات القليلة من اآلجار في الوسط‬ ‫الغذائي، بتحرك البكتيريا بحركة محدودة من خالل‬ ‫منطقة الطعن، وتحدد الحركة نتيجة حدوث تفرع‬ ‫النمو في منطقة الطعن، ويمكن إضافة صبغة‬ ‫معينــــة مثل أمالح تترازيوليوم ‪Tetrazolium‬‬ ‫)‪ ،salt (TTC‬لمالحظة تفرع النمو بلون األحمر‬ ‫الفاتح (فجلي اللون).‬ ‫يجب حقن اإلبرة بطريقة مستقيمة، وتسحب‬ ‫•‬ ‫بنفس الطريقة، للحصول على نتائج جيدة (شكل85).‬
  48. 48. ‫• تقنية عزل البكتيريا ‪Isolation Techniques‬‬ ‫• طريقة العزل بتخطيط األطباق ‪Streak Plate Method‬‬ ‫‪of Isolation‬‬ ‫• الهدف من عزل البكتيريا بتخطيط األطباق:-‬ ‫• تستخدم هذه الطريقة للحصول على مستعمرات نقية، من‬ ‫بيئة محتوية على عديد من األنواع األخرى، وذلك لألسباب‬ ‫التالية:-‬ ‫1. تعتبر هذه الطريقة واسعة االنتشار‬ ‫2. تستخدم لخفض أعداد وكثافة األحياء الدقيقة في البيئة،‬ ‫ومن ثم سهولة عزلها من األنواع غير المرغوبة.‬ ‫3. تعتبر كل مستعمرة معزولة مستعمرة نقية ( من المعروف‬ ‫نظريا بأن كل مستعمرة تبدأ بخلية من نوع واحد فقط).‬
  49. 49. ‫• طريقة العمل:‬ ‫• طريقة التخطيط المتعامد:‬ ‫1. تصب بيئة اآلجار المغذي في أطباق بيتري، عند‬ ‫درجة 54 ‪º‬م، وتترك لتبرد وتتصلب.‬ ‫2. تغمر عقدة الناقل المعدني المعقم، في بيئة بكترية‬ ‫مختلطة ، أو من معلق المادة المراد العزل منها.‬ ‫3. تخطط مساحة صغيرة على سطح اآلجار، عند حافة‬ ‫طبق بيتري، بلمس السطح بعقدة الناقل المجففة،‬ ‫بدون ضغط حتى ال يخرج سطح اآلجار‬ ‫( المساحة1).‬ ‫4. تعقم حلقة الناقل وتترك لتبرد لمدة 5 ثواني.‬
  50. 50. ‫يحرك الطبق مع فتح الغطاء الزجاجي لطبق بيتري ،‬ ‫5.‬ ‫أخرى ، ويرسم على‬ ‫وتعاد عملية التخطيط مرة‬ ‫سطح اآلجار خطوط على شكل حرف ‪ S‬بواسطة الناقل‬ ‫على المساحة 2 بعرض الطب‬ ‫يعقم الناقل مباشرة ويترك ليبرد.‬ ‫6.‬ ‫يخطط سطح اآلجار تخطيطات( 6 – 7 خطوط)، بحيث‬ ‫7.‬ ‫تكون عمودية‬ ‫يعقم الناقل ويترك ليبرد.‬ ‫8.‬ ‫تكرر عملية التخطيط في االتجاه 3 و4. (شكل 95).‬ ‫9.‬
  51. 51. ‫• طريقة التخطيط المتشعع ‪Radiant Streak Method‬‬ ‫1. تعقم حلقة الناقل، وتبرد لمدة 5 ثواني.‬ ‫2. ترسم بواسطة الناقل 7 –8 خطوط كما موضح في شكل (06).‬
  52. 52. ‫يعقم الناقل مرة أخرى ويترك ليبرد.‬ ‫3.‬ ‫يخطط سطح اآلجار، بحث تكون الخطوط متقاطعة‬ ‫4.‬ ‫مع الخطوط التي سبق تخطيطها في السابق.‬ ‫يعقم الناقل مرة أخرى، ويترك ليبرد.‬ ‫5.‬ ‫توضع األطباق مقلوبة في الحضانة عند درجة‬ ‫6.‬ ‫73‪º‬م ،لمدة 42 – 84 ساعة.‬

×