Azido nukleikoen erauzketa

1. Olatz Conde, Maite Garcia, Ane
Orrantia, Mikel Txopitea

2. AURKIBIDEA
 Sarrera
 Zertarako?
 Laginen homogenizazioa
 Metodo fisikoak.
 Metodo kimikoak.
 DNAren erauzketa prozedura.
 RNAren erauzketa prozedura.
 Azido nukleikoen erauzketaren helburuak.
 Lagin forenseak
 PCR
 Alderantzizko transkripzioa
 Northern Blot

3. Sarrera
 ZERTARAKO?
 DNA birkonbinatuko tekniken eta biologia
molekularrarekin loturiko ikerketa gehienen lehengo
pausua.
 Odola eta listua DNA iturri onenak

4. Pausoak
 Ehun laginaren lorpena
 Laginaren homogeneizazioa
 Ehunetik zelulak banatzea
 Lisi zelularra
 Purifikazioa
 Erauzketa organikoa
 Prezipitazioa

5. Laginen Homogenizazioa
 Egitura tisularrak zelularretatik banatu
(zentrifugazioa)
 Lisi zelularra:
Metodo ideala: hainbat tekniken arteko oreka.
 Potentzia jakina:
 Hasierako material konplexua apurtu bai
 Azido nukleikoak egonkor mantentzeko bezain leuna

6.  LISI ZELULARRA: zenbait metodo fisiko
 Sonikazioa: ultrasoinuak sortuko dituen intentsitate
altuko bibrazioak bidaltzen ditu sonikatzaileak,
bibrazioak.
 Irakitea: lagina irakitean datza, mintza desegorkortuz.
Purifikazio-maila minimoa.
 Izoztea: honen ondorioz urak kristalak sortu, mintzak
apurtu
 Txoke osmotiko: zelulak medio hipotonikoan jarriz,
mintzaren apurketa (kontuz pareta zelularra)

7.  LISI ZELULARRA: zenbait metodo kimiko
 Detergenteak (SDS motakoak)
 Molekula kelanteak: (EDTA), mintz zelularra
ezegonkortu eta DNAsak inhibitu
 Lisozima
 K proteinasa

8. DNAren ERAUZKETA PROZEDURA
 Erauzketa diagnostiko eta prozedura analitiko askoren
lehen pausua.
 DNArekin lan egiterakoan kontuan izan beharrekoak.
 Erauzketa egiteko metodo ezberdinak existitzen dira.
 Erauzketa organikoa: Fenol-kloroformo
 Erauzketa ez-organikoa: Chelex (erretxina kelanteak)

9.  1. pausua: homogenizazioa
 Erauzketa buffera erabiltzen da:
 Detergentea
 Molekula kelanteak
 Gatzak
 Tanpoia
 K proteinasa
 Inkubazio zikloak  lipidoen apurketa

10.  2. pausua: erauzketa organikoa
 Fenola. Fenolaren bidezko bi erauzketa  proteinak
kendu (nukleasak). Zentrifugatu + gainjalkina hartu
(kontu handiarekin). Pausu hau ez da beti egiten.
 Kloroformoa. Geratzen diren hondakin lipidikoak
kendu. Zentrifugatu + gainjalkin hartu.

11.  3.pausua: prezipitazioa
 Gatza. Kontzentrazio altuan. Negatiboki kargatutako
DNA, geruza ioniko positiboaz inguratu  prezipitatu.
Gatz motaren aukeraketa faktore ezberdinen menpe.
 Alkohola. Gatzen gehiegizko kontzentrazioa kendu +
azido nukleikoen prezipitazioan lagundu.
 Prezipitazioa ia bat-batekoa da. Gomendagarria:
Inkubazioa.

12.  4.pausua: garbiketa
 Inkubazio ostean, zentrifugatu + fase urtsua kendu.
DNA pastilla %70 etanol garbitu  geratzen diren
gatzak kendu.
 Berriro ere zentrifugatu, etanola kendu eta sikatzen utzi.

13.  DNAren presentziaren baieztapena
 Agarosazko gelean egindako elektroforesi bidez.
 Etidio bromurua + argi ultramorea edo
espektrofotometroa
 Kuantifikazioa: espektrofluorimetroa erabiliz.

14. https://www.youtube.com/watch?v=JNl1kjw9ZDQ

15. RNAren ERAUZKETA PROZEDURA
 Proteinen sintesiaz arduratzen den molekula.
 Erauzketaren helburua  gene ezberdinen
adierazpenaren azterketa.
 Erauzketa prozesuan zehar kontuan hartu beharreko
gauzarik garrantsitzuena RNAasa-en presentzia.
 RNA iturria zein den arabera metodo ezberdinak:
 Ehunetatik edo odol zeluletatik abiatuta: Trizol

16.  1.pausua: homogenizazioa
 Trizol. Fenol eta guanina isozianata disoluzio
monofasikoa. Homogenizazio bitartean RNAren
egonkortasuna mantendu + zelularen egonkortasuna
aldatu  zelulak apurtu + osagai zelularrak askatu.

17.  2. pausua: erauzketa organikoa
 Kloroformoa. Gehitu eta zentrifugatzen jarri  bi fase:
 Fase urtsua: RNA
 Fase organikoa: DNA eta proteinak

18.  3.pausua: prezipitazioa
 Alkohol isopropilikoa. Inkubatu eta zentrifugatu 
prezipitatu den RNA saiodiaren beheko partean, botoi
itxura.

19.  4. pausua: garbiketa
 Zentrifugazio ostean gainjalkina kendu eta jalkina
etanolarekin garbitu. Nahastu eta zentrifugatu.
 Jalkina berresuspenditu RNAasaz libre dagoen H2O

20. https://www.youtube.com/watch?v=RmPsLoIPRwc

21. AZIDO NUKLEIKOEN
ERAUZKETAREN HELBURUAK
 DNA:
 Lagin forentseetan ezinbestekoa
 Erreaktibo eta orbaneko kutsatzaileetaz garbitzea,
garrantzitsua
 Proteina basikoak Elektroforesian arazoak
Emaitza okerrak

22.  PCR inhibitzaileak
 DNA polimerasa termoegonkorretan eragin
 Mg2+ ioiekin elkarrekintzak
 Erauzketan erabilitako erreaktiboak
 Gatzen gehiegizko kontzentrazioa: KCl, NaCl,…
 Detergente ionikoak
 Alkoholak: Etanola, isopropanola,…
 Laginaren purifikazioa
 Kimikoa
 Fisikoa: Silika zutabeak

23.  RNA:
 Alderantzizko transkripzioa
 cDNA sekuentzia osagarria lortu
 Bektore baten txertatu eta organismo bati transferitu
Transkribatzean, proteina birikoak lortu Txertoak
Klonazioa cDNA bilduma espezifikoak
 Hasieran RNA osoa izatea ezinbestekoa

24.  Northern Blot:
 Ehun baten RNA lagin ezberdinak gel
elektroforesis banandu
 Kapilaritatez, Nailon mintz batera transferitu
 Zunda markatuak erabili hibridazioan
 Garbitu eta erradiografia ehu arruntaren
emaitzekin aztertu
Gen baten produktuan akatsak (transkripzioan
delezioak)
Minbizi zelulen gene tumoralen erregulazio eza