Pseudohipoparatiroidismoa (gnas)

1. PSEUDOHIPOPARATIROIDISMO
GNAS COMPLEX LOCUS
MS-MLPA

2. GNAS COMPLEX LOCUS
•20q13.32
•58839739-
58911194bp
•13 exoi GNAS
genea

3. •NESP55: inpronta aitatiarra
•NESPas, XLαs eta A/B: inpronta amatiarra

4. 5 transkripto
ezberdin:
 A/B + 2-13 =
transkriptorik ez
 NESP55 + 2-13 =
NESP55-en
produktua
 1-13 exoiak = Gsα
 XLαs + 2-13 = Gsα
luzeagoa
 NESPas antisense

5. PSEUDOHIPOPARATIROIDISMOA (PHP)
 Hipokaltzemia, hiperfosfatemia eta odolean
hormona paratiroidearen (PTH) kontzentrazio altua
 PTHren funtzioak:
 [Kaltzio]
 [Fosforo]

6. HORMONA PARATIROIDEA

7. PHP MOTAK
PHP Ia
 G prot-ren aktibitatea
murriztu
[AMPc]
 AHO fenotipoa
PHP Ib
 Aldaketa G proteinan
 PTHrekiko
erresistentzia
 AHO ez

8. PHP IB
Kasu esporadikoa
(sporPHPIb)
 20q13.2 bandaren aitatiar
isodisomia
 Metilazioa amatiarraren
galera totala
Kasu familiarra
(ADPHPIb)
 STX16 genean
mikrodelezioa
 A/B exoiaren metilazio
galera

9. KASU FAMILIARRAREN HERENTZIA
Osasuntsu
Kasu
familiarra

10. ZUNDEN AZALPENA
•Right Probe Oligonucleotide (RPO)
·Reverse haslearen sekuentzia osagarria (Berdina zunda pare guztietan)
-TCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC
·Optional Stuffer (ez dugu erabiliko)
·5' muturrean hibridatuko den sekuentzia (RHS)
•Left Probe Oligonucleotide (LPO)
·3' muturrean DNA ituarekin hibridatzen den segmentua (LHS)
- GGGTTCCCTAAGGGTTGGA
·Optional Stuffer: M13 fagoaren sekuentzia (Desberdina zunda pare bakoitzean)
·Forward haslearen sekuentzia berdina (Berdina zunda pare guztietan)
3’ 5’

11. MS-MLPA TEKNIKA
•MS-MLPA burutzen dugunean,
metilatuta dagoen DNA HhaI
errestrikzio entzimarekin
tratatzean ezin izango du
metilaturiko DNA moztu,
metilazioarekiko sentikorra baita.
•DNA ez badago metilatuta,
arazorik gabe moztuko da.
•PCR-a burutzean, soilik izango
da posible zunda anplifikatzea,
hasierako DNA metilatuta
bazegoen itu gunean.

13. ZUNDAK
PROTOKOLOAN:
 25 zunda bikote GNAS
lokusean
 17 GCGC HhaI-rako
gunearekin
 6 zunda bikote STX16
genean
 12 zunda bikote gene
kontroletarako
 2 zunda bikote digestio
kontrolerako
SINPLIFIKATZEKO:
 12 zunda bikote GNAS
lokusean
 12 GCGC HhaI-rako
gunearekin
 -
 Zunda bikote bakarra
gene kontrolerako
 2 zunda bikote digestio
kontrolerako

14. ZUNDEN SEKUENTZIAK
XLαs exoia
5’…CACTCCCGCCGCGAACGCGCCTCCCCTCTGGGTCCCAGGCGC
CATCGGCAGCCCATCCCAAGAGGCTGTCAGACCTCCTTCTAACT
TCACGGGCAGCAGCCCCTGGATGGAGATCTCCGGACCCCCGTT
CGAGAT-TGGCAGCGCCCCCGCTGGGGTCGACGACACTCCCGT
CAACATGGACAGCCCCCCAATCGCGCTTGACGGCCCGCCCATC
AAGGTCTCCGGAGCCCCAGATAAGAGAGAGCGAGCA…3’
·Exoiak (GCGC gunea bai)
·Gene kontrola (GCGC gunerik ez)
·Digestio kontrola (GCGC gunea bai, inoiz ez metilatuta)

15. PROTOKOLOA

16. MS-MLPA
 Paziente bat aztertuko da
 TE Buffer + DNA
 3 pertsona osasuntsuen DNA (kontrola)
 TE Buffer + DNA “kontrola”
 Zuria
 TE Buffer + TE (Ez dago DNA)
+1 TE Buffer bolumen (bolumen galerak)
*TE Buffer (10mM Tris-HCl, pH=8,2 + 0,1 mM EDTA)

17. DNA-REN ERAUZKETA
Odol lagina Erauzketa tanpoia: SDS,
RNAasa
Proteinasa K +
BEROA
4 LAGINEKIN
PROZEDURA HAU
JARRAITUKO DA

18. DNA-REN ERAUZKETA

19. MS-MLPA PROZEDURA
ZUNDEN LIGAZIOA
 DNA desnaturalizazioa (1. eguna)
 98ºC (Harizpiak banatu) 5 minutu
 25ºC pausa
 Laginak termozikladoretik atera. Besteak beste, zundak, Tris-
HCL, pH 8 eta EDTA duen buffer gehitu saihodi guztietara (5)

20.  Hibridazioa (1. eguna)
 95ºC (DNA desnaturalizatu) - 1 minutu
 60ºC (Zunden hibridazioa ahalbidetu) – 16-20h
Pausa.
 20ºC (2. eguna) Pausa.
 Ligasa buffer eta ura gehitu saihodi guztietara.
 Saihodi bakoitza bi saihodi berritan bereizi. (10)
 48ºC Pausa.
 Erreplika bakoitzetik, batera ligasa eta HhaI gehituko zaio, eta
besteari soilik ligasa.

21. 2 SAIHODI: LIGASA/LIGASA+ENTZIMA
Ligasa
Ligasa + HhaI
entzima
x5
x5
x5
1x Gaixo
3x Osasuntsu
1x Zuria

22.  Ligazio eta digestioa (2. eguna)
 48ºC - 30 minutu
 Erreplika batetan soilik ligazioa
 Bestean ligazio eta digestioa
 98ºC (Entzimak inaktibatuz) - 5 minutu
 20 ºC Pausa.
 Hasleak, dNTP, Mg2+, EDTA, Tris-HCl eta DNA polimerasa
dituen buffer gehitu.

23.  PCR erreakzioa (2. eguna)
 35 ziklo burutuko dira
 95ºC (Desnaturalizazioa) - 30 segundo
 60ºC (Hasleak itsatsi) - 30 segundo
 72ºC (Luzapena) - 1 minutu
 72ºC - 20 minutu
 15ºC Pausa.
 Elektroforesi kapilarra (emaitzak)

24. DATUEN NORMALIZAZIOA
 Methylation
 Intra-lagin normalizazioa:
 Ligasa+HhaI = konparatu itu exoiaren zunda eta gene
kontrolaren zunda
 Ligasa= konparatu itu exoiaren zunda eta gene kontrolaren
zunda
 Aurreko bien arteko ratioa, lagin guztietarako
 Metilazio ehunekoa lortu
 Inter-lagin normalizazioa:
 Gaixoaren DNA eta osasuntsuarena (kontrola) alderatu,
ratioen bidez
 Copy number
 Konparatuko dira gaixoaren eta osasuntsuaren ratioak,
HhaI gabeko laginekin

25. EMAITZAK
 Copy number
1.Saihodia(ligasa, HhaI ez): ratio-patroi berdina
osasuntsu zein gaixoetan=kopia kopuru bera (pikoa
falta=delezioa)
 Methylation
2.Saihodia (ligasa+HhaI):
Piko patroia 1.Saihodikoarekin alderatu
METILAZIO PORTZENTAIA

26. 0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
STX16(E1)
NESP(E1)
NESP(E1)
NESP(E1)
NESPAS
(E1)
NESPAS
(E1)
NESPAS(I1)
GNASXL
(E1)
GNASXL
(E1)
GNASXL
(E1)
GNASXL
(E1)
GNAS1A
GNAS1A
GNAS(E1)
GNAS(E1)
THL1
3p14
kontrola
php
RESULTADO MSMLPA-METILACIÓN