H19 GENEAREN METILAZIO EGOERAREN AZTERKETA COBRA TEKNIKAREN BIDEZ

1. H19 GENEAREN METILAZIO
EGOERAREN AZTERKETA
COBRA TEKNIKAREN BIDEZ
IBAI, PAUL, IÑIGO ETA XABI

2. H19 GENEA
• 11. kromosoman
• 11p15.5 gunean
• 1,995,175 base paretik
1,997,834-raino
• RNA ez-kodetzailea sortzen du

3. H19 GENEA
Zelulen proliferazioaren erregulazio negatiboa
Organismoaren eta zelulen hazkuntza mugatu
Minbizi mota batzuetan garrantzizkoa da:
◦ Esofago minbizia
◦ Bularreko minbizia
◦ Kartzinoma adrenalak
◦ (…)
Beste gaixotasun batzuetan ere bai:
◦ Beckwith-Wiedemann Syndrome (BWS)
◦ Silver-Russell syndrome (SRS)

4. RNA PRODUKTUA
Genearen azken produktua RNA katea bat da.
2,3 kb-ko RNA katea  Poliadenilatzen da baina ez da itzultzen
H19ren espresioaren galera:
◦ Ez da mutazio letala
◦ Gehiegizko hazkuntza (IGF2 gehiegi espresatuko da)
◦ Minbizia izateko probabilitate handiagoa
H19ren gainespresioa:
◦ Mutazio letala izaten da
◦ H19 normalean espresatzen ez den ehunetan (Ad: Garuna)
◦ H19 normalean espresatzen den ehunetan (Ad: Gibela)

5. EPIGENETIKA
Diferentzialki metilatutako eskualde bat  ICR1 (Inpronta kontrola)
Normalean:
◦ Alelo aitatiarra  Metilatuta  Isila
◦ Alelo amatiarra  Ez metilatuta edo hipometilatuta  Espresatzen da
H19 metilatuta  ez espresatu
 IGF2-ren espresioa bultzatu
IGF2 Insulin (Growth Factor 2) gene auzokidea da.
◦ Hazkuntzarekin erlazionatuta

6. EPIGENETIKA
H19 GENEA
◦ Alelo amatiarrean espresatu (ez dago metilatuta)
◦ Zelulen hazkuntza inhibitzen du
IGF2 GENEA
◦ Alelo aitatiarrean espresatu (ez dago metilatuta)
◦ Zelulen hazkuntza bultzatzen du
ICR1 METILAZIO GUNEA  Bi geneen espresioa kontrolatu
◦ Metilatuta badagoIGF2 espresatu
◦ Metilatuta ez badagoH19 espresatu

7. ICR1

8. H19, ONKOGENEA?
Alde:
H19-ren gainespresioa esofago eta minbizi kolorektalean
Saguetan H19ren RNA injektatuta tumore progresioa emendatu
Kontra:
Bular minbizidun zeluletan transferitzeak ez du hedapenean
faboratzen
Zelula ama Mesenkematikoen H19 adierazpena Tumoredunak > Ez
tumoredunak

9. H19, GENE ONKOFETAL RNA
H19 ezaugarriak:
Produktu genikoa RNA da
Adierazpen nagusia: Prenatala
Jaio ondoren eta heldutasuna: Minbizia sor ditzake
Def:Enbriogenesian zehar adierazten diren
geneak, ehunak garatu ahala espresioa gutxituz

10. ART-ak INPRONTA ALDAKETAK SOR
DITZAKE
Lagundutako ugalketa teknika
nagusiak (ART) :
◦ IVF => in vitro fertilization
◦ ICSI=> intracytoplasmic sperm
injection
ART-ak garatzeko prozeduretan:
◦ hormonen bidezko super obulazioa
◦ in vitro enbrioien hazkuntza
◦ Kriokontserbazioa
◦ Gizonezkoen antsutasuna

11. BECKWITH WIEDEMANN SINDROMEA
IGF2 ren amatiar inprota galera ondorioz
sortua, IGF2 amaren kromosoman ere
espresatuko da
ART ondoren: Ugariago BWS-ak
◦ (%8,6 kasueta; Japan 2009 )
Sintoma nagusiak:
◦ Mikroentzefalia
◦ Makrogolisa
◦ Atzerapen metala

12. Silver-Russel sindromea
H19 ren inpronta aitatiarra
galtzean gertatzen da H19 bi
kromosometan espresatuz.
Sintomak
•Jaiotzean pixu baxua
•Gorputz tamaina txikia
•Beso laburrak eta burua handia
gorputzarekin konparatuz
•Hatz lodia kanpora begira

13. COBRA teknikaren bidez, ART-ak sor
ditzakeen metilazio aldaketen arriskuak
aztertuko ditugu.

14. METODOA
Zoriz aukeratutako 91 haur jaioberritatik laginak (8-10ml odol) eskuratu
◦ 61 haur lagundutako ugalketa tekniken bidez fekundatuak (ART) eta 30 haur naturalki
fekundatuak.
DNA isolatu eta bisulfitoarekin konbertsioa burutu
◦ DNA-n ez-metilatuak dauden zitosinak urazilo bihurtuko dira.
◦ 3 pausu nagusi.
Laginak PCR-z anplifikatu.
Errestrikzio entzimekin DNA laginak inkubatu + gel elektroforesia.
Emaitzak baieztatzeko, laginak sekuentziatu.

15. DNA PURIFIKAZIOA ETA PRESTAKETA
Haurretatik hartu ditugun laginak Maxwell 16 purification system erabiliz
purifikatu.
Jada DNA dugula, DNA 18µl lisi bufferretan (2 μg tRNA, 280 ng/μl Proteinase K,
1% SDS).
◦ 37ºC; 1h ur-bainuan.
◦ Pauso hau garrantzitsua izango da DNAri lotuta gera dakiokeen proteina txikiak kendu eta
bisulfito konbertsio ona emateko.
DNA desnaturalizatu 20 µl soluziotan 3M NaOH-ren 2µl botaz.
◦ 37ºCtan 15 minutu inkubatu ur bainuan eta segidan 90ºCtara berotu berogailu baten bidez 2
minutuan. Gero izotzetan 5 minutu.
◦ Laginak 4ºC-tan 10 segunduz zentrifugatu (10000g).

16. BISULFITO KONBERTSIOA
SULFONAZIOA ETA DESAMINAZIO HIDROLITIKOA
10 mM Quinol
20µl DNA desnaturalizatu
pH 5.0 sodio metabisulfito saturatua
240µl ko soluzioa
◦ Nahastu eta 10 segunduz
zentrifugatu
208µl
12µl

17. BISULFITO KONBERTSIOA
SULFONAZIOA ETA DESAMINAZIO
HIDROLITIKOA
Nahasteari gainera 200µl olio mineral
bota gainetik.
◦ Laginak inkubatu 55ºtara ur bainuan 4-16
ordu bitartean (DNA kalitatearen arabera).
Zentrifugatu eta segidan pipeta baten
bidez DNA hartu oliorik sartu gabe.

18. BISULFITO KONBERTSIOA
GATZGABETZEA ETA DESULFONAZIOA
Lagina gatzgabetu.
◦ Bisulfito ioiak kendu gatzgabetze zutabe batetik gure lagina pasatuz.
◦ 50 μl milli-Q water-ekin (MQH2O) eluitu.
Desulfonazioa.
◦ 3M NaOH-ren 5.5µl gehitu soluziora eta inkubatu 37ºCtan 15 minutuz.
◦ Zentrifugatu + 1µl tRNA (10mg/ml).
◦ Neutralizatu amonio azetatoa botaz pH 7 lortu arte.
◦ Etanolarekin DNA prezipitatu: 300µl %100 etanol + zentrifugatu (14,000 g;15
min).
◦ Pellet-a erresuspenditu

20. BISULFITO KONBERTSIOA
KONTROLA
Human Methylated & Non-methylated
DNA Set (Zymo Research Corporation,
Orange, CA, USA) kontrol positibo eta
negatibo gisa.
◦ Sekuentzia berdinak: bata metilatua,
bestea metilatu gabe.
◦ Biak bisulfitoaren bidez tratatu, anplifikatu
eta TaqI errestrikzio entzimarekin inkubatu.
◦ Gel elektroforesia.
◦ Metilatua ez litzateke moztu behar eta ez-
metilatua bai.
DAPK1 Primer I:
5’ - 3’
ATTGGGAAGGTTAAGGYGGAGGGAAATTTGGT
DAPK1 Primer II:
5’ – 3’
CCCCAAACRAAACAATCCCCAAAACCACATTCCTA

21. KONTROLEN METILAZIO EGOERA
Kontrolen DNA egoera
aztertzeko
MspI ek metilatua zein ez egon
ebaki.
HpaII-k ez metilatua bakarrik.
Ebakitzen bada ez da PCR
produktorik lortuko

22. BISULFITOAREN KONTROLA
 Bisulfito eta PCR a egin eta
gero kontrolen sekuentzia
 Metilatua egon den kontrolean
tcga gunea
 TaqI entzimak ebakiko du
 Agarosazko elektroforesian ez
metilatuan banda bakarra,
metilatuan bi.

23. PCR
PCR reaction mix
◦ 2x PCR HotStart premix buffer +
0.2mM hasleak
◦ 93 mix prestatu
◦ 61 ART + 30 Nat + 1 zuria + 1 badaezpada
PCR produktuak Maxwell116
DNA purification kit erabiliz
purifikatu.
Zikloa Etapa Temperat
ura (ºC)
Denbora
(s)
1 1
Desnaturaliza
zioa
95 300
2 (x40) 1
Desnaturaliza
zioa
94 30
2 Hibridazioa 60 45
3 Luzapena 72 45
3 3 Luzapena 72 300
Forward: 5´-AGG TGT TTT AGT TTT ATG GAT GAT GG-3´
Reverse: 5´-TCC TAT AAA TAT CCT ATT CCC AAA TAA CC-3´

24. ERRESTRIKZIO ENTZIMEN BIDEZKO
MOZKETA ETA GEL ELEKTROFORESIA
PCR-arekin anplifikatutako DNA TaqI
errestrikzio entzimarekin tratatuko dira.
TaqI
◦ Soilik metilatuta egon diren CpG guneak
moztuko ditu
◦ 2 orduz (65ºC)
Agarosa %4 gel elektroforesia.

25. PAZIENTEEN EMAITZAK
2 kromosoma. H19 aitarenean metilatua eta amarenean ez. COBRA egitean naturalki
jaiotako umeetan (kontrolak) 3 banda.
230bp ko banda metilazio ez duen DNA eta 100 eta 130 bp ko DNA metilatua izango da.
4, 5 eta 62 pazienteek metilazioa galdu dute aitatiar kromosoman
Metilazio dentsitate ratioa: 2 metilatutako banden dentsitatea/dentsitate totala

26. SEKUENTZIAZIOAREN EMAITZAK
COBRA ren emaitzak ziurtatzeko
PCR emaitzak bektoreetan
klonatzen dira eta gero
sekuentziatu egiten da
A, B eta C 4, 5 eta 62 pazienteen
emaitzak. D kontrola
Zirkuloak metilazio guneak dira,
beltzez metilatua esan nahi du.
COBRA-n metilazioa galdu dutenen
emaitzak konfirmatzen dira. Dena
zirkulo irekiak, hau da, metilatu
gabe.

28. ART bidez jaiotako umeetatik 58-ik metilazio egoera normala dute (%50 ingurukoa)
Naturalki jaiotako ume guztiek metilazio egoera normala dute
ART bidez jaiotako 3 umek metilazio egoera aldatua dute (%0)
Biki batekin jaio dira, hauen bikiaren metilazio egoera normala delarik
Kasu hauetan ART-a aitaren infertibilitate arazoengatik eskatu zen, beraz baliteke metilazio
arazoa espermatik transmititzea

29. GALDERARIK?