1. • Real-Time PCR (qPCR): intereseko DNA segmentua anplifikatu
+ kuantifikatu
• Oinarria: fluoroforoak eta fluorimetrodun termozikladoreak:
itu-DNAren anplifikazioa eta fluoreszentzia-sorrera
erlazionatzeko
itu-DNAren anplikoi kopurua ↑= fluoreszentziaren seinalea ↑
• Zergatik Real-Time?: PCR erreakzioaren jarraipena denbora
errealean
• Parametro nagusia: atalase-zikloa (Threshold Cycle,
Ct)
• Zer da? Fluoreszentzia inguru-zaratarekiko estatistikoki
adierazgarria (neurgarria) izaten hasten den zikloa
• Ezaugarriak:
- Estatistikoki esanguratsuak diren datuak eta inguru-
zarata bereizten ditu
- Anplifikazioa hasten deneko zikloa determinatzen du
- Hasierako DNA ituaren kopia-kopuruarekiko alderantziz
proportzionala da
Jatorrizko DNA kantitatea txikiagoa bada Ct ↑
Real-Time PCRaren abantaila nagusia: anplikoi-kopurua PCR
erreakzioaren fase esponentzialean kuantifikatu
Fase
esponentziala Atalase-maila
Fase
lineala
Asetasun-fasea (Plateau)
Ohiko PCRa Real-Time PCRa
Anplikoi-kopuruaren kuantifikazio
erlatiboa erreakzioaren amaieran
(Plateau fasean)
Anplikoi-kopuruaren kuantifikazioa
erreakzioaren fase esponentzialean
Zehaztasun ↓ Zehaztasun ↑
Agarosazko gel elektroforesia: gelak
bereizmen ↓
Ez da elektroforesirik burutu behar
Kuantifikazioa banden intentsitateak
konparatuz
Kuantifikazioa fluoreszentzia-
emendapenean oinarrituz
Plateau fasearen hasiera-unea oso
aldakorra
DNAren anplifikazioa hasierako itu-
DNA kantitatearekiko proportzionala
Parametro zinetikoak: aldakortasun↑ Parametro zinetikoak: aldakortasunik
ez
Errepikagarritasun eskasa Errepikagarritasun handia
2. Ohiko PCRa: anplifikazio-ziklo ↑ desbiderapen ↑
Real-Time PCR: Ct beti kte desbiderapen ↓
Real-Time PCRaren abantailak:
• Erreakzioaren ikuspegi azkarra
• Eraginkortasunaren kalkulua
• Gene-adierazpenaren analisi kuantitatiboa (qRT-PCR )
• Teknika semi-automatizatua anplifikazio-ziklo
azkarrak
• Post-PCR prozesamendurik ez kutsadura-arriskua ↓
• Sentikorragoa eta errepikagarria
Osagaiak:
• Itu-DNA
• Hasle espezifikoak
• dNTPak
• DNA polimerasa
• pHa konstante mantentzeko tanpoia
• Anplikoiaren kuantifikaziorako elementuak
(metodoaren arabera):
- Fluorokromo inespezifikoak
- Zunda espezifikoak
• Fluorimetrodun termozikladoreak
*
1. DNA itua 94-95ºC-tara berotu
(desnaturalizazioa)
2. Tenperatura 50-65ºC-tara jaitsi
(hasleen parekaketa)
3. Tenperatura 72ºC-tara igo
(elongazioa)
GUZTIRA: 30- 40 ziklo
Beacon
zundak
Scorpions
zundak
3. dsDNA molekulari inespezifikoki lotzen zaizkion molekulak
Molekula txikiak
Tartekatzaileak edo dsDNAren ildo estuarekin
Adib: SYBR Green, interakzionatzen dutenak
argi urdina xurg.(λmax = 488 nm)
argi berdea igorri (λmax = 522 nm)
Hasleak dsDNA
Molek.
fluorokromoa
PCR
dsDNA molekulari inespezifikoki lotzen zaizkion molekulak
Zunda espezifikoak
Distantzia
laburrean Q-k
R-ren
fluoreszentzia
xurgatu
erresonantziaren
bidez
Distantzia luzean, Q ez da gai xurgatzeko R-ren
fluoreszentzia ikusgarria
Quencher-ak
Zunda
espezifikoak
Molekula
fluorokromoak
Polimerasaren
exonukleasa
aktibitatean
oinarrituak
https://www.biosearchtech.com/flash/guides/formats_explained.html
R eta Q banantzeko teknikaren arabera, 2
zunda mota mota:
Zundaren
konformazioa
aldatzean R eta Q
artean distantzia
handitzean
oinarrituak
Zunda espezifikoak
Polimerasaren exonukleasa
aktibitatean oinarrituak (dynamic
quenching)
https://www.biosearchtech.com/flash/guides/formats_explained.html
Zunda itu DNAri
lotuta dagoenean:
Quencher-ak R-ren
fluoreszentzia
xurgatu
Zunda espezifikoak
5. “Dynamic Quenching” “Static Quenching”
Tenperaturarekiko ez oso
dependentea
Tenperaturarekiko oso dependentea
Zundaren apurketa ematea
beharrezkoa da fluoreszentzia
igortzeko
Zundaren apurketa ez da ematen; Q
eta R urrun egotearekin nahikoa da
fluoreszentzia igortzeko
Exonukleasa aktibitatean oinarrituak Nukleotidoen osagarritasunean
oinarrituak (Q eta R-ren arteko
distantzia handitzean datza)
Primer-a eta zunda bi molekula desberdin dira, ez dira batera agertzen.
(salbuespena: “Scorpions zundak”)
Zunda espezifikoak:
Molekula inespezifikoak Zunda espezifikoak
Espezifizitatea Ez, edozein DNA
molekularako baliogarria
DNA sekuentzia
espezifiko baterako
erabilgarria
Sentikortasun minimoa Aldakorra 1-10 kopia
Multiplex PCRrako (+1 zunda, +1
fluoroforo…)
Gene-adierazpenerako Kuantifikazio-maila baxua Kuantifikazio-maila altua
Hasleen beharra
Prozedura Laburra Luzea (hasleen diseinua,
zundaren diseinua…)
Prezioa Merkea Garestia
KONTUZ! Edozein DNA molekulari
lotuko dira
Sekuentzia bakoitzerako
zunda espezifikoak
beharko dira
Arazoak Positibo faltsuak ager
daitezke (hasleen
duplexak, hasierako
DNA…)
SNP-ak agertzekotan
arazoak
Fluoreszentzia emateko… DNAri lotu Hibridazioa+ R eta Q
arteko distantzia handitu
Negatiboa: DNA
molderik gabeMarkatzailea
k
Positiboa:
· Kanpokoa (irudian): Itu
sekuentziatik kanpo dagoen DNA
sekuentzia baten anplifikazioa
·Barnekoa: intereseko DNA
fragmentuaren kantitate ezagunaren
anplifikazioa (hasleen parekamendu
desegokiak, polimerasaren jarduera
desegokia… detektatzeko.)
Fase
esponentziala
Atalase-
maila
Fase
lineala
Plateau
Fase
esponentziala
Fluoreszentzia
basala
Threshold
Cycle
Atalase-
maila
6. DNA kantitate
ezaguneko
diluzio seriatuen
anplifikazioa Ct
balioa
kalkulatzeko
Zuzen patroia:
Ct vs. Log[DNA]
Deribatuan pikoak behatzen
dira. Desnaturalizazioa
sekuentziaren araberakoa
denez, kutsatzaileren bat
egonez, gero, piko bat baino
gehiago agertuko da
Anplifikazioaren ondoren,
tenperatura igoz produktua
desnaturalizatu egiten da
(fluoreszentzia murriztuz).
-Diskriminazio alelikoa
-SNP
Kontaminante
ohikoenak
hasleen
dimeroak izaten
dira
Diskriminazio alelikoa
Gene baten kopia kopuruaren determinazioa
Patogenoen detekzioa eta kuantifikazioa
Espresio-genikoaren analisia
DNA-ren kuantifikazio azkarra behar duen edozein aplikazio …
Disoziazio-puntua
sekuentziaren luzera
eta konposizioren
araberako denez:
Alelo
desberdinak
bereiz
daitezke
SNP
detektatu
daitezke
Dosi genikoak eragindako gaixotasunak
diagnostikatzeko: aneuploidiak, delezioak,
Loss of Heterozygosity, euploidiak
(landareetan)…
7. • Patogenoaren andui zehatza
• Infekzioaren maila (batzuetan patogeno
kantitatearekin korrelazionatuta)
Tratamendu
espezifikoagoak
baimendu
•Gene jakin baten espresioa
ehun desberdinetan edota
egoera fisiologiko
desberdinetan aztertu
•Zelulako housekeeping
gene baten espresioarekin
konparatu: kuantifikazio
erlatiboa
•RT-qPCR: mRNA-ren cDNA
sintetizatu behar
