1. SNP ARRAYS
JAIONE AUZMENDI
MAIALEN IGARTUA
MAIALEN FELIPE
SARA TOJA
GIDOIA
SARRERA
• SNPak eta CNVak: zer dira?
• SNP arrays Plataforma nagusiak: Affymetrix eta Illumina
PROZEDURA
• Pauso orokorrak
• Affymetrix eta Illumina arteko desberdintasunak
APLIKAZIOAK
• Adibidea: minbizi-zeluletako aldaketa somatikoen azterketa.
SARRERA
ZER DIRA SNP-AK?
Single nucleotide polimorphysmsSingle nucleotide polimorphysms
Alelo biren arteko nukleotido bakarreko
desberdintasunak
Bariante bat SNP bezala hartua izateko
populazioan % esanguratsu batean agertu behar da.
Giza genoman 10 milioi SNP inguru ezagutu.
Garrantzi handia hainbat gaixotasunen agerpenean
hauek aztertu eta sailkatzea ezinbestekoa
CNV-AK
• 1000bp-tako sekuentzia errepikatuak. Gizaki
batetik bestera kopia kopurua aldatzen da.
“Copy number
variants”
• Duplikazio eta delezioakSorrera
• Alzheimer, autismo, psoriasi, eskizofrenia
eta Parkinson gaixotasunekin loturaGaixotasunak
• Database of genomic variants
• SNP-en kasuan, dbSNP
Datu baseak
SNP-ARRAYS
• SNP, CNV eta beste aldaera batzuk detektatzeko.
• MIKROTXIPETAN oinarritutako teknika
• Oinarria: baseen arteko parekamenduak + fluoreszentzia.
Mikrotxipean DNA zatiekiko oligonukleotido osagarriak; gure
DNA bere SNParekiko osagarria duen oligoari lotuko da,
fluoreszentzia igorriz.
MILIOI BAT INGURU SNP
DESBERDIN ANALIZATU SAIO
BAKARREAN
2. SNP bakoitzari dagokion argi-seinalea interpretatzeko, informatika
sendoa beharko da. Seinale piloa dugu, eta egiazko seinaleak
zaratatik bereizi behar dira.
ikerkuntza biologikoa, ahalmen konputazionala eta teknologiaren
garapena elkarren eskutik
Teknologia
Informatika
Ikerkuntza
biologikoa
SNP array teknologian diharduten plataforma nagusiak:
AFFYMETRIX + ILLUMINA
PROZEDURA
1. Lagina lortu
OROKORRA:
2. Azido
nukleikoen
isolamendua
3. Errestrikzio
entzimekin
tratatzea
DNA:
Disolbatzaile organikoekin
tratatuz
Alkohol eta gatz bidezko
prezipitazioa
mRNA:
Disolbatzaile organikoekin
tratatuz
Oligo dT-dun zutabean
kromatografia eginez
OROKORRA:
5. Zati
txikiagoetan
fragmentatzea
6. Hibridazioa
eta eskaner
bidezko
detekzioa
4. One primer
amplification
PCR-a
Affimetrix Affimetrix
3. ILLUMINA
• Oligonukleotidoa SNParen AURREKO POSIZIOra
arte heltzen da bakarrik.
• DNA gehitzean, SNPa parekatu gabe gelditzen den
lehen basea da
• Polimerasa eta ddNTPak gehituko ditugu; ddNTP
bakoitza kolore batekin markatuta.
• SNPari dagokion ddNTPa oligoaren 3’
nukleotidoari itsatsi eta fluoreszentzia igorriko du.
• Fluoreszentzia hori jaso eta interpretatu.
KONTUAN HARTZEKOAK
• Kontrolak:
– Ez dira ohikoak. Ohikoena emaitzak beste tekniken bidez
kontrastatzea da.
– Affimetrix-ean missmatch eta match perfektuak emango
dituzten lagin ezagunak.
• Desabantaila:
– Ezin dira traslokazio orekatuak detektatu.
EMAITZEN INTERPRETAZIOA
SNP G/T
Berdea: G Gorria: T
Mikrotxipetan igorritako
fluoreszentzia begi-hutsez aztertuz…
Baina, hau ez da hain erraza!
AHALMEN KONPUTAZIONALAREN
BEHARRA
SNP genotipazioa… Y aleloarekiko
homozigotoa
Bi aleloekiko
heterozigotoa
X aleloarekiko
homozigotoa
No template
control
Puntu bakoitza lagin
bat da
Puntu multzoak
Cluster-ak dira
4. Delezioak…
Kopia kopurua
guztira
Alelo bakoitzaren
kopia kopurua
Kopia kopurua
guztira
Alelo bakoitzaren
kopia kopurua
Duplikazio eta anplifikazioak…
Heterozigositatearen galera…
Kopia kopurua
guztira
Alelo bakoitzaren
kopia kopurua
APLIKAZIOAK: Minbizia
GENOTIPOARI ERREPARATUZ…
Zelula normalak
Tumore zelulak
3 AUKERA
AUKERA ASKO
Delezioak
Anplifikazioak
Heterozigositatearen galera
Disomia uniparentala
Diploideak
AA : Homozigoto basatia
AB : Heterozigotoa
BB : Homozigoto mutatua
Diploideak, aneuploideak…
AAB
ABB
BBB
…
Zatiketan ematen diren akatsengatik
TUMORE ZELULETAN GERTATZEN DIREN
ALDAKETAK
• Heterozigositatearen galera
– Lokus jakin baterako bi aleloak ezberdinak izanik, alelo batean delezioa
ematen da.
5. • Disomia uniparentala
– Minbizi zelulak jasotako gene batzuetako bi aleloak gurasoetako
batenak dira
TUMORE ZELULETAN GERTATZEN DIREN
ALDAKETAK
SNP ARRAY BIDEZKO ANALISIAK
• Disomia uniparentala
• Heterozigositatearen galera
Genotipoa
Aleloen kopia kopurua
• Aneuploidia:
– Kromosoma kopuru aldaketak ( gehipena edo gutxipena)
– Ondorioa Seinalea ez dagokio bi kopia dituzten indibiduoei
Zailtasunak
TUMORE ZELULETAN GERTATZEN DIREN
ALDAKETAK
Aneuploidia
Aldaketa gabeko
tumore zelulak
Analisia zaildu
ASCAT (allele-specific copy number analysis of tumors)
1. Tumoreen ploidia eta mutazioa pairatzen duten zelulen portzentaia
determinatu
2. ASCAT profilak: Heterozigositatearen galera, delezioak, anplifikazioak…
3. Aleloen delezio eta anplifikazio maiztasunak kalkulatu
4. Aleloen mapa genetikoa
TUMORE ZELULETAN GERTATZEN DIREN
ALDAKETAK
